Abstract
Bakgrunn
Denne undersøkelsen ble utført for å evaluere uttrykk for den aktiverte leukocytter celleadhesjonsmolekyl (Alcam) i bukspyttkjertelkreft (PAC) og for å avgjøre hvorvidt den ectodomain utgytelsen av Alcam (s-Alcam) kan tjene som en biomarkør i perifert blod av PAC-pasienter.
Materiale og metode
Tissue prøver og blod sera fra pasienter med PAC (n = 264 og n = 116, henholdsvis) og sera hos 115 pasienter med kronisk pankreatitt (CP) ble analysert via Alcam immunhistokjemi og s-Alcam ELISA-tester. Resultatene ble korrelert med kliniske, histopatologiske og pasientoverlevelsesdata (Chi-kvadrat test, Kaplan-Meier analyse, log-rank test, henholdsvis).
Resultater
Alcam ble uttrykt i flertall av PAC lesjoner. Immunhistokjemi og serum ELISA tester viste ingen sammenheng mellom Alcam uttrykk i primære svulster eller s-Alcam og kliniske eller histopatologiske data. Verken Alcam eller s-Alcam viste en betydelig innvirkning om total overlevelse (p = 0,261 og p = 0,660, henholdsvis). S-Alcam serumnivåer ble signifikant forhøyet sammenlignet med sera fra pasienter i KF (p 0,001). Sensitiviteten av s-Alcam i å oppdage PAC var 58,6% ved en spesifisitet på 73,9% (AUC = 0,69).
Konklusjoner
Alcam er uttrykt i de fleste PAC lesjoner, men statistisk analyse viste ingen sammenheng med kliniske eller patologiske data. Selv om signifikant forhøyet hos pasienter med PAC, sensitiviteten og spesifisiteten til s-Alcam serum kvantifisering testen var lav. Derfor forblir sitt potensial som en roman diagnostisk markør for PAC unnvikende og videre undersøkelser er nødvendig
Citation. Tachezy M, Zander H, Marx AH, Stahl PR, Gebauer F, Izbicki JR, et al. (2012) Alcam (CD166) Expression og serumnivåer i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (6): e39018. doi: 10,1371 /journal.pone.0039018
Redaktør: Frank T. Kolligs, Universitetet i München, Tyskland
mottatt: 27 februar 2012; Godkjent: 15 mai 2012; Publisert: 20 juni 2012
Copyright: © 2012 Tachezy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for denne studien ble gitt av et forskningsstipend fra Universitetet i Hamburg (Forschungsförderung Medizin – FFM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Siden de fleste pasienter med pankreatisk adenokarsinom (PAC) som er tilstede i fremskredne stadier av sykdommen, er forekomsten av PAC nesten lik dens dødelighet. Selv i kurativ innstillingen, som bare gjelder for en undergruppe av pasienter, har onkologisk langsiktig overlevelse ikke vesentlig forbedret de siste årene (rapporterte median overlevelse på mellom 14 og 22 måneder); de fleste av de tumorer gjentas lokalt eller på fjerntliggende steder [1], [2]. Dessverre, forbedringer i (neo) adjuvant og selv palliativ behandling av tilbakefall og overlevelse er fortsatt skuffende; ingen av de nylig testede målrettet terapi var svært lovende i kliniske forsøk [3], [4], [5], [6]
Som en konsekvens av to hovedmål må oppnås:. første, ny biokjemisk tester for tidlig deteksjon, overvåking og prognose av PAC bør utvikles. I tillegg kan disse bidra til å skille mellom maligne og benigne lesjoner i bukspyttkjertelen, som kronisk pankreatitt (CP). Faktisk, er det fortsatt ingen etablerte eller anbefalt serum markører for diagnose eller prognose av PAC i rutinemessig bruk [7], [8]. Dernest må potensielle innovative mål for biologisk behandling identifiseres for å forbedre overlevelsen av pasienter med PAC.
I nyere tid, ble teorien om den hierarkiske organiseringen av kreftceller grundig undersøkt, og støtter kreftstamcelle hypotese [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13]. Disse cellene kan være potensielle terapeutiske biologiske mål og prognostiske markører. Flere forfattere har identifisert putative stamcelle markører for tarm samt PAC, nemlig CD133, CD44, og CD166, den aktiverte leukocytt celleadhesjonsmolekyl (Alcam) [10], [14], [15], [16], [17 ]. Sistnevnte er et sterkt konservert 110 kDa multidomain transmembran-type 1 glycoprotein av immunglobulin super. Dette molekyl medierer og homotypisk heterotypic interaksjoner mellom celler [18], [19]. Det spiller en rolle i utvikling av forskjellige vev, for eksempel i neurogenesis og haemotopoiesis, og det deltar i mekanismene for immunresponsen [20], [21], [22]. Som med andre membranproteiner, representerer Alcam et potensielt mål for terapi og dens anvendbarhet som et legemiddel målstruktur kan ytterligere forbedres ved ligand-induserte endocytose [23]. Dessuten har en nylig beskrevet internal single-kjeden anti-Alcam antistoff potensial til å levere terapeutiske midler til kreftceller [23], [24].
Flere studier rapporterte sitt potensial som en biomarkør for ulike kreft enheter, slik som melanom, bukspyttkjertel og ampullary adenokarsinom, og tykktarms, gynekologisk og nevroendokrine karsinomer. Dets ekspresjon er assosiert med forskjellige resultater i forskjellige tumorer [17], [18], [19], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Videre er det ekstracellulære domene av Alcam (s-Alcam) skur av metallproteaser (for eksempel, ADAM 17), fungerer som en aktiv messenger og kommuniserer med omgivende vev [33]. Etter spalting fra tumorcelleoverflaten, kan s-Alcam påvises i blodserum. En økt nivå av s-Alcam uttrykk ble observert i eggstokkene, brystkreft og esophageal kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller [30], [33], [34], [35], [36]. I tillegg studier med små pasientprøver viste en økning av s-Alcam uttrykk i sera fra pasienter med PAC [37], [38].
Vi gjennomførte denne studien å undersøke sammenhengen mellom Alcam uttrykk i et stort antall primær PAC lesjoner og kliniske og histopatologiske data og dens potensielle prognostisk verdi. Videre har vi bestemt preoperative s-Alcam serumnivå av pasienter med PAC og CP og evaluert sin betydning som en diagnostisk og prognostisk markør.
Resultater
kjennetegn ved pasientene
kreft i bukspyttkjertelen vevsprøver fra 264 pasienter i alderen 33 til 87 år (median 63 år) og blodserum fra 116 PAC-pasienter i alderen mellom 33 og 92 år (median 64 år) og 115 CP-pasienter i alderen mellom 31 und 79 (median 51 år) ble inkludert i denne studien. Alle pasientene ble kirurgisk behandlet mellom 1993 og 2006 ved Institutt for General, visceral og Thoracic Surgery ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf i Tyskland.
Drifts metoder som ble brukt var den klassiske Whipple prosedyren, pylorus bevar pancreaticoduodenectomy , delvis eller fullstendig pancreatectomy i tilfeller av PAC og organbevar reseksjon metoder i tilfeller av CP.
median oppfølgingstid av pasientene inkludert i overlevelsesanalyse var 14 måneder (variasjons 0-193 måneder) og median total overlevelse (OS) var 15 måneder (95% KI 13.2-16.7 måneder). Tjueni (10,5%) av pasientene døde i løpet av de første 30 dagene etter operasjonen.
Alcam Expression i PAC og dens korrelasjon med kliniske og histopatologiske Kjennetegn
I alt 192 (78,6%) primær PAC tumorprøver var tolke i vår vev microarryay (TMA) analyse. Grunner for ikke-informative tilfeller (52, 21,3%) inkludert en fullstendig mangel på vevsprøver eller fraværet av entydig kreftvev i TMA seksjoner. Analyse av sunn bukspyttkjertelen vev avdekket en svak eller middels Alcam uttrykket (+ /++) i normal acinar eller duktale bukspyttkjertelen celler (n = 10, figur 1F). Den fargemønster av Alcam immunhistokjemi viser en dominerende membran ekspresjon av det Alcam molekylet. Selv om noen cytoplasmatic farging ble til sett, ble dette alltid forbundet med en mye større grad av farging i membranene. Trettiåtte prosent av tumorene viste et lavt nivå av Alcam uttrykk, 44% medium og 18% et høyt nivå av ekspresjon Alcam (figur 1A-1E, se Materiale og metoder for kriterier). Svulstene viser en heterogen fargemønster inne til kreft (figur 1A-1E).
(A) og (B) sterk Alcam uttrykk, (C) og (D) medium og (E) ingen uttrykk. (F) Healthy pankreatisk vev. (G) Fullstendig skanning av PAC vevet microarray.
De histopatologiske funn av tolk svulster er oppsummert i tabell 1. uttrykk for Alcam viste ingen sammenheng med kliniske eller histopatologiske parametre som alder, kjønn , tumorstadium (UICC 6
th klassifisering) eller svulst Karakter (G).
de totale overlevelseskurver plottet i et Kaplan-Meier analyse viste ingen signifikant forskjell mellom lav, middels eller høy Alcam-uttrykk pasienter (p = 0,261, figur 2A). På grunn av dette ble det ikke multivariat analyse utført.
(A) Immunhistokjemisk Alcam farging av primærbukspyttkjertelkreft prøver og (B) lave og høye s-Alcam serumnivåer (pasienter som døde i løpet av de første 30 dagene etter operasjonen ble ekskludert).
S-Alcam in Blood serum
s-Alcam verdier ble signifikant forhøyet i blodet serum av PAC pasienter (n = 116, mener 29,4 ng /ml , standardavvik (SD) 1,1 ng /ml, p 0,001) sammenlignet med CP-pasienter (n = 115, bety 18,2 ng /ml, SD 1,0 ng /ml) og friske bloddonorer (n = 128, bety 21,1 ng /ml , SD 0,7 ng /ml, figur 3A)
(A) s-Alcam serumnivå av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (PAC) og kronisk pankreatitt (CP) og friske kontrollblodgivere (p. 0,001) . (B) Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver av s-Alcam for diagnostisering av PAC versus CP-pasienter.
Receiver Operating karakteristiske kurver ble brukt til å etablere sensitiviteten-spesifisitet forhold for s-Alcam ( Figur 3B). Cut-off nivå bestemmes av Youden indeksen var 22 ng /ml. AUC var 0,690. Sensitiviteten av s-Alcam ved påvisning av PAC var 58,6% ved en spesifisitet på 73,9% sammenlignet med pasienter med cp.
For å bestemme effekten av forhøyet s-Alcam nivåer på pasienter med PAC, kontinuerlig og kategoriske analysene ble perfomed
Ingen signifikante forskjeller ble funnet om kjønn (kvinnelige 33,6 ng /ml, mannlige 31,3 ng /ml, p = 0,649), alder (. 64 år 33,0 ng /ml, 64 år 33,0 ng /ml; p = 0,775), UICC trinn (Ia 24,1 ng /ml, Ib 36,0 ng /ml, Ila 26,8 ng /ml, Ilb 36,4 ng /ml, III 19,0 ng /ml; iv 28,1 ng /ml; p = 0,277) og tumorcelle gradering (G1 og G2 31,1 ng /ml, G3 35,0 ng /ml;. p = 0,479)
Vi definerte forskjellige grenseverdier for kategorisk analyse av s-Alcam data . Med ingen av dem (25
th persentil, median og 75
th persentil, den «optimale cut-off verdi», fastsatt ved bruk av Youden-indeksen for diskriminering av UICC klassifisering og tumorcelle gradering) en betydelig sammen med kliniske eller histopatologiske parametre ble beregnet
for å illustrere dette, Tabell 1 viser analysen med en cut-off verdi av 75
th persentil (. 42,3 ng /ml s-Alcam, 75
th persentil, tabell 1). De totale overlevelseskurver plottet i et Kaplan-Meier analyse viste ingen signifikante forskjeller mellom lav og høy s-Alcam grupper (p = 0,660, figur 2B). På grunn av dette ble det ikke multivariat analyse utført. Videre ble ingen sammenheng funnet om alder eller kjønn i både PAC og CP. I tillegg var det ingen signifikant sammenheng mellom s-Alcam grupper og Alcam immunhistokjemisk fargings resultater (n = 39, p = 0,699)
Diskusjoner
Hensikten med denne studien var. for å behandle uttrykket og kliniske betydningen av Alcam i PAC vev og for å avgjøre hvorvidt s-Alcam kan tjene som en diagnostisk og prognostisk markør i perifert blod av PAC-pasienter. Resultatene viste at Alcam ble uttrykt i de fleste PAC lesjoner og at s-Alcam serumnivåer ble betydelig forhøyet sammenliknet med sera av CP-pasienter og friske kontroller (p 0,001).
Sammenhengen mellom Alcam uttrykk i primær PAC lesjoner med de kliniske og patologiske parametere viste ingen signifikante funn, som bekrefter resultatene av nylig publiserte studier på mindre pasientprøver [29], [37]. Ikke desto mindre de samme forfatterne beskrevet en potensiell rolle Alcam i celleadhesjon reduksjon og induksjon av chemoresistance in vitro [37], og Alcam ble også beskrevet som en selvstendig prognostisk markør i PAC pasienter (n = 97) [29]. I motsetning til funn av Kahlert og kolleger, en total overlevelse analyse av resultatene (n = 138) viste ingen signifikant sammenheng mellom tidspunktet for overlevelse og intensitet og mengde Alcam uttrykk (lav, middels eller høy) (p = 0,261, figur 2A).
lokalisering av Alcam uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler ble tidligere beskrevet som hovedsakelig cytoplasmatic i PAC prøvene [29]. I motsetning til disse resultater, immunhistokjemisk farging protokollen i foreliggende studie viste en overveiende membranøs ekspresjon av adhesjonsmolekylet Alcam (figur 1) [27], [30], [31], [32]. Cytoplasmatic fargeintensitet ble relatert til intensiteten av membranøs farging og ikke forekomme i fravær av membranøs farging. Lignende observasjoner ble gjort av Kristiansen og kolleger, som også finnes hovedsakelig membranous farging med en varierende grad av cytoplasma farging [39]. I tillegg gjorde vi ikke observere en membran-cytoplasmatic skift mellom normale duktale celler eller lav karakter og høy klasse svulster som Kahlert og kolleger gjorde [29].
Hvorfor er det avvik i morfologiske og statistiske resultater fra studier undersøker Alcam i PAC? Selvfølgelig, flere faktorer påvirker fargeintensitet og spesifisitet av immunhistokjemi, og antistoffkonsentrasjon er bare ett av dem. Brukte fortynninger spenner fra 1:100 til 1:450 og ulike forbehandlinger er beskrevet i studiene, noe som reflekterer den generelle problemet med sammenlignbarhet i immunhistokjemiske studier. Dessverre er generelt aksepterte retningslinjer for optimal immunhistokjemi protokollen utvikling [40], [41]. Nylig, i en studie som undersøkte den kliniske betydningen av p53 endringer i prostata kreft, en immunhistokjemi protokoll som ble bevisst utformet for å være «oversensitive» resulterte i en mye høyere rate av positive immunhistokjemiske funn (2,5% positivitet med standard protokoll sammenlignet med større enn 90% positivitet med «overfølsom» protocol) [42]. Overfor dette problemet, har vår gruppe etablert en omfattende og svært standardisert protokoll for en objektiv optimalisering av immunhistokjemiske stainings [40]. Som konklusjon, forskjellige protokoller fremstille forskjellige grader av følsomhet og spesifisitet, noe som fører til betydelige avvik i fargemønstre og, som et resultat, i den statistiske data. En annen kilde for statistiske forskjeller er forskjeller i utvalgsstørrelser og avvikende poengsystemer. Mens vår protokollen er optimalisert for å måle både, mengde og tha intensiteten i farging, Kahlert og kolleger har fokusert på intensiteten bare [29], [40]. For å utelukke dette som en grunn for avvikende resultater, har vi utført en analyse bare ved hjelp av fargeintensitet, som også fant ingen statistisk signifikante resultater (data ikke vist).
Likevel, ikke bare gjorde de fleste av primær PAC lesjoner uttrykke Alcam, men metastatiske og tilbakevendende lesjoner viste også en middels til sterk ekspresjon (lymfeknutemetastaser 46%, n = 50; fjernmetastaser 85%, n = 7, tilbakevendende tumorlesjoner 67%, n = 15, data ikke vist) . Tilsvarende Piscuoglio og kolleger har beskrevet en betydelig forhøyet uttrykk i kreft i ampulla av Vater sammenlignet med friske bukspyttkjertelen prøver og adenom [17]. Disse funnene vil foreslå en potensiell involvering av denne faktoren i tumor progresjon av PAC [17].
Denne hypotesen står i kontrast til nyere observasjoner fra Zhang og kolleger, som identifiserte ikke småcellet lungekreft (NSCLC) stilk celler, eller tumor-initiere-cellene ved Alcam spesifikke FACS sortering [13]. Alcam positive NSCLC-celler viste en høy proliferativ potensial in vitro og in-vivo i motsetning til Alcam negative celler. Interessant, en knock-down av Alcam resulterte ikke i en reduksjon av tumorigenitet, som er i henhold til studiet av Hong og kolleger som observerte lignende resultater i en Alcam stanse eksperiment av en PAC cellelinje via Alcam RNAi [37]. Ingen effekt på spredning eller migrasjon ble sett. Videre Zhang og kollegene presenteres immunhistokjemiske resultatene på virkningen av Alcam vev uttrykk på overlevelse i en TMA-format med 143 NSCLC pasienter, finner ingen statistisk signifikant effekt. De konkluderte med at Alcam ville være en meget robust, men inert celleoverflatemarkør for NSCLC-tumor-initiere-celler. Siden vi ikke har funnet en signifikant klinisk sammenslutning av Alcam uttrykk, kan Alcam godt ha en tilsvarende rolle i PAC stamceller. Dersom denne hypotese kan bekreftes ved ytterligere in-vitro og in-vivo forsøk, kan Alcam bli et potensielt mål for nye antistoffbaserte behandlingsstrategier. Nytten av Alcam som et medikament målstruktur kan bli ytterligere forsterket ved ligand-induserte endocytose av Alcam [23]. I tillegg er et nylig beskrevet internalisert enkelt-kjede antistoff [23], [24], er rettet mot Alcam blitt foreslått for den potensielle intracellulær avlevering av forskjellige terapeutiske midler til prostata kreftceller. Imidlertid må man viktig innvending reises: Alcam er en allestedsnærværende uttrykt molekyl med fysiologiske roller i tarmslimhinnen [43]. Alvorlige virkninger på normalt vev kan dermed føre og må tas hensyn til når en søknad for systemiske spesifikke kreftbehandling regnes [43].
På grunn av forhøyet uttrykk for Alcam i de fleste av de til kreft evaluert vi også nivåene av s-Alcam (fra ectodomain Shedding av Alcam) i blodserum. S-Alcam verdier ble signifikant forhøyet i PAC pasienter sammenlignet med pasienter med CP og friske blodgivere (p 0,001 og p 0,001, henholdsvis figur 3A). AUC viste en akseptabel diskriminerende effekt av s-Alcam (AUC = 0,690; figur 3B). Følsomheten (58,6%) og spesifisitet (73,9%) av s-Alcam var klart dårligere enn tumoren markør mest brukte for PAC, CA19-9, (sensitivitet på 58% til 87%, spesifisitet på 93%) [44] . Imidlertid må potensielle metodiske svakheter ved studien vurderes i vurdering av resultatene: Selv om håndtering av serumprøver er standardisert ved vår institusjon, kan selv små forskjeller i behandlingen eller behandlingen har enorme effekter [45]. Dessuten studien var retrospektive og utført over en relativt lang periode. Derfor trenger våre resultater ikke utelukke en potensiell nytteverdi av s-Alcam serum kvantifisering test, mener vi testen bør vurderes nærmere i prospektive studier med større pasientgrupper.
For å bestemme foreningen av forhøyet s -ALCAM nivåer med pasient overlevelse og tumorstadium, ble ulike statistiske analyser utført. Verken en analyse ved hjelp av e-Alcam nivåer som en kontinuerlig variabel eller en kategorisk analyse med ulike grenseverdier viste signifikant sammenheng med kliniske eller histopatologiske parametre (Tabell 1 exemplarily viser resultatene av de 75
th persentil som cut-off nivå ). Som allerede nevnt, kan Alcam være en inert faktor, noe som kan forklare mangelen på en forening [13].
Nylig har en potensiell rolle Alcam i gemcitabin-indusert chemoresistance i PAC ble beskrevet, ettersom Alcam-stilnet PAC-celler viste en indusert chemoresistance [37]. Gransker den kliniske effekten av in-vitro-data, utførte vi en sub-analyse av pasienter som får adjuvant kjemoterapi om overlevelse (log-rank test). Pasienter med høy eller middels Alcam uttrykk viste ikke en redusert eller langvarig overlevelse sammenlignet med Alcam negative pasienter (n = 60, p = 0,176). Videre ble ingen overlevelsesgevinst funnet hos pasienter med redusert s-Alcam serumnivåer (75
persentilen, n = 28, p = 0,672). På grunn av den tilbakevirkende karakter av undersøkelsen, ble noen få pasienter som får kjemoterapi adjuvant identifisert, noe som i betydelig grad begrenser strømmen av analysen. Videre ble ulike regimer administrert (gemcitabin, fluorouracil og andre). Videre analyser skal utføres med større og mindre heterogene pasient kohorter, noe som kan bidra til å identifisere pasienter som vil få mest nytte av en adjuvant behandling og også hjelpe skreddersy den beste individuelle behandlingen for den enkelte pasient.
serumnivåer av s -ALCAM har blitt undersøkt i bukspyttkjertelkreft før, men denne studien var den første til å analysere både Alcam uttrykk og s-Alcam nivåer i de samme pasientene [36], [37], [38]. Overraskende, ble ingen signifikant sammenheng eller forening funnet mellom forhøyet vev uttrykk og serumnivået hos pasientene (n = 48, p = 0,699). Nylig ble s-Alcam nivåer undersøkt i bryst og spiserøret kreftpasienter, men ingen korrelasjon med vev-ekspresjon ble funnet [30], [35]. Dette kan ha flere årsaker: For eksempel ikke bare uttrykk for Alcam protein ikke trenger å resultere i en økt utgytelsen av s-Alcam av proteaser som ADAM17, som nylig ble vist [29], [30]. Videre spyling av shedded molekylet inn i blodstrømmen kan være en konsekvens av avbrudd av anatomiske barrierer liggende vertsvev og endotelceller. Til sammen er de mekanismene som regulerer utgytelsen av Alcam og sin formidling inn i omkringliggende vev og sin inntreden i blodsystemet knapt forstått og videre undersøkelser er nødvendig.
Alcam er sterkt uttrykt i PAC prøver. Den forhøyede Alcam uttrykk i grunnskolen og metastaser av PAC kan kanskje gjøre Alcam et mulig mål for nye antistoffbaserte behandlingsstrategier. De immunhistokjemiske Resultatene fra vår studie viste ingen signifikant sammenheng mellom Alcam uttrykk og kliniske eller patologiske data i PAC-pasienter. Dette resultatet er i klar kontrast til videre studier som undersøker uttrykk for Alcam i bukspyttkjertelkreft og flere andre solide svulster i mage-tarmkanalen. Ytterligere tiltak må iverksettes for å undersøke fysiologiske og onkologisk rolle Alcam og å validere den kliniske bruken av s-Alcam som en potensiell klinisk markør for PAC.
Metoder
Pasient og kliniske data
for denne studien, vevsprøver (n = 264) og blodserum (n = 116) av pasienter med PAC og sera av 115 pasienter med CP behandlet ved Institutt for General, visceral og Thoracic Surgery, University Medical Hamburg-Eppendorf mellom 1993 og 2006 ble analysert. Blodprøver ble tatt rett før kirurgi. Ingen av pasientene fikk neoadjuvant behandling. Alle data inkludert sex, histologi, tumor størrelse, lymfeknutemetastase, sykdomsstadiet (UICC 6
th edition). Oppfølgingsdata ble hentet fra en kombinasjon av kliniske og patologiske plateanmeldelser, fra polikliniske medisinske poster og kommunikasjon med pasienter og deres behandlende leger, og fra Kreftregisteret det. Total overlevelse ble beregnet fra datoen for operasjonen til dødsdato eller siste oppfølging. Pasienter som ikke overlever de første 30 dagene etter operasjonen ble ekskludert fra overlevelsesanalyse.
Studiet ble godkjent av etikkomiteen av Chamber of Physicians i Hamburg, Tyskland. Skriftlig samtykke for bruk av prøver for forskningsformål ble innhentet fra alle pasienter før operasjon eller blodprøvetaking.
Tissue microarray (TMA)
Den pre-eksisterende kreft i bukspyttkjertelen vev microarray består av totalt 600 vevsprøver [31], [46]. Disse omfatter 244 prøver av primær bukspyttkjertelen adenokarsinom, 116 lymfeknutemetastaser, 12 fjernmetastaser og 23 lokale residiv fra 264 pasienter med PAC. I tillegg pankreastumorer andre enn adenokarsinom (endokrin, intraductal papillær mucinkjertler svulster, godartede og ondartede cystisk svulster, og acinøse svulster celle), en standard kontrollområde som inneholder 40 svulster fra andre organer, sunt bukspyttkjertelen vev, og 18 friske vev fra andre nettsteder er inkludert. Byggingen av TMA ble beskrevet tidligere [47]. Kort, haematoxylin-eosin fargete snitt ble laget av utvalgte primærtumor blokker (giver blokker) for å definere representative tumor regioner. Tissue sylindre (0,6 mm i diameter) ble deretter stanset ut av dette område av donor blokken ved hjelp av et hjemmelaget halvautomatisk vev arrayer. Deler av tre mikrometer i størrelse ble kuttet med Parafin Seksjonering Aid System (Instrumentics, Hackensack, NJ, USA).
immunhistokjemisk farging for Alcam og evaluering av Alcam Expression
Alcam farging protokollen var optimalisert i en omfattende og standardisert flertrinns fremgangsmåten på ulike benigne og maligne vev; protokollen ble endret til selektiv farging med de laveste bakgrunnssignaler ble etablert [40]. Nyklipt TMA snitt ble analysert på en dag i et enkelt eksperiment. Ekspresjon av Alcam ble påvist ved anvendelse av et mus monoklonalt antistoff (klon MOG /07, 1:450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) etter at seksjonene var blitt dekket med en citratbuffer, pH 7,8, og kokt i en autoklav. Den EnVision system (Dako, Glostrup, Danmark) ble anvendt for å visualisere den immunfarging
Bare membranøs farging ble evaluert fordi cytoplasmatic flekker -. Hvis til stede – er alltid knyttet til sterkere membranøs farging. Den fargeintensitet (0, 1+, 2+, 3+) og brøkdel av positive tumorceller ble scoret for hvert vev sted som nylig publisert [40]. Flekker uten flekker og med et fargeintensitet av 1+ i 70% og 2+ i 30% av tumorceller ble scoret som Alcam lav, middels score ble gitt for et fargeintensitet av 1+ i ≥70%, 2+ i ≥30% eller 3+ i 30% av tumorceller, og høye poengsummer ble gitt for et fargeintensitet av 2+ i ≥70% eller 3+ i ≥30% av kreftceller. Immunhistokjemisk analyse av delene ble gjennomført uten kunnskap om pasientenes identitet eller klinisk status.
Sandwich ELISA for påvisning av s-Alcam
For s-Alcam kvantifisering i perifert blod, serumprøver av 116 kaukasiske pasienter med PAC og 115 kaukasiske pasienter (37 kvinner og 78 menn, median alder 50,1 år (31.4-79.2 år)) med CP, som ble angitt for kirurgisk behandling, ble analysert med en s-Alcam sandwich-enzymbundet immunoassay ( ELISA). Alle blodprøver ble oppnådd direkte før kirurgi. Som friske kontroller, ble 128 kaukasiske blod-bank givere (62 kvinnelige og 66 mannlige, median alder 48,7 år 19.2-65.3 år) inkludert i studien. Alle sera ble behandlet senest etter 4 timer [45].
For deteksjon av s-Alcam, fleksible 96-brønners mikrotiterplater (Costar, Corning, NY, USA) ble belagt med 50 ul pr brønn av 2 ug /ml av monoklonalt mus fange-antistoff (MAB6561; R Fraktion V, 98% renhet; Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) i PBS /T (PBS pH 7,3 inneholdende 0,05% volum /volum Tween) i 45 minutter ved værelsestemperatur, og deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med humane serumprøver fortynnet 1:50 i PBS. Etter fem vaskinger med PBS /T, ble bundet protein detektert ved en biotin-konjugert polyklonalt antistoff (BAF656; R 10% variasjonskoeffisient (CV) for intra- og inter-assay variabilitet studier
Statistical Analysis
Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av SPSS Statistics for Windows (versjon 17, SPSS Inc., Chicago Ill, USA). Gjensidig avhengighet mellom farging og ELISA resulterer samt kliniske data ble beregnet ved hjelp av Chi-kvadrat og Fishers eksakte tester og vises i krysstabeller. Cut-off nivå for s-Alcam kvantifisering ble bestemt ved bruk av Youden-indeksen. Gruppe forskjeller ble beregnet ved hjelp av t-testen, ANOVA; Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis test. Mottaker driftskarakteristikker ble anvendt for å beskrive utførelsen av s-Alcam. Overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og analysert ved hjelp av log-rank test. Alle testene var tosidig og p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Takk
Vi takker pasientene som frivillig og sjenerøst gitt data og prøver for forskningsformål samt Petra Schroeder og Christina Koop for deres utmerkede teknisk støtte.
