Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden; overlevelsestider er dårlig til tross for behandling. Rollen til de to-pore domene K
+ (K2P) kanal OPPGAVE-en (KCNK3) i lungekreft er i dag ukjent. Vi fant ut at OPPGAVE-en er uttrykt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer ved variable nivåer. I en svært OPPGAVE-1 som uttrykker NSCLC cellelinje, A549, en karakteristisk pH og hypoksi-sensitive ikke-inaktive K
+ strøm ble målt, noe som indikerer tilstedeværelse av funksjonelle OPPGAVE-1 kanaler. Hemming av OPPGAVE-en førte til betydelig depolarisering i disse cellene. Knockdown of OPPGAVE-1 av siRNA betydelig forbedret apoptose og redusert spredning i A549 celler, men ikke i svakt OPPGAVE-1 som uttrykker NCI-H358-celler. Na
+ – koplet næringsstoff transport gjennom cellemembranen er funksjonelt koplet til utstrømningen av K
+ via K
+ -kanaler, således OPPGAVE-en potensielt kan påvirke Na
+ – koplet næringsstoff transport. I motsetning til OPPGAVE-en, som ikke var forskjellig uttrykt i lungekreft vs. normalt lungevev, vi fant Na
+ – kombinert nærings transportører,
SLC5A3
,
SLC5A6
, og
SLC38A1
, transportører for myo-inositol, biotin og glutamin, henholdsvis, for å bli betydelig overuttrykt i lunge adenokarsinomer. Oppsummert viser vi for første gang at OPPGAVE-en kanal regulerer apoptose og proliferasjon i en undergruppe av NSCLC
Citation. Leithner K, HIRSCHMUGL B, Li Y, Tang B, Papp R, Nagaraj C , et al. (2016) OPPGAVE-en Regulerer apoptose og spredning i en undergruppe av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 11 (6): e0157453. doi: 10,1371 /journal.pone.0157453
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 14 desember 2015; Godkjent: 31 mai 2016; Publisert: 13 juni 2016
Copyright: © 2016 Leithner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. For i silico analyser genuttrykk datasett i lunge adenokarsinom prøver og normale lungene (GDS3257) publisert på Gene Expression Ominbus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ble brukt.
Finansiering : studien ble støttet av midler fra den Oesterreichische National (Anniversary fond, prosjektnummer 12713 til HO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Vårt arbeid ble finansiert av Oesterreichische National (Anniversary Fund, prosjektnummer 12713). Den Oesterreichische National har ingen kommersielle interesser knyttet til de finansierte prosjekter, inkludert vårt prosjekt. Den Oesterreichische National eies av den føderale regjeringen i Østerrike, og Anniversary Fondet støtter eneste uavhengige forskning fra svært ulike forskningsfelt. Prosjektene er vurdert av uavhengige, internasjonale forskere (peer-review) og resultatene oppnådd er ikke i noen form benyttet av Oesterreichische Nationalbank, heller ikke Oesterreichische National ha noen innvirkning på målene for prosjektene. Dette endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lung kreft står for det største antallet kreftdødsfall på verdensbasis [1]. Omtrent 85% av lungekrefttilfellene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og 15% er små-celle lunge kreft. Lungekreft er ofte avansert ved diagnose [1] og overlevelse er dårlig til tross for terapi [2].
K
+ kanaler har vist seg å være involvert i praktisk talt alle kjennetegnene til kreft, for eksempel vedvarende spredning , unndragelse av apoptose, og invasjon (for oversikt se [3,4]). I alt 77 gener koder kaliumkanaler. Fire hovedklasser av K
+ kanaler finnes: de spenningsstyrte K
+ kanaler, kalsium-aktiverte K
+ kanaler, innover-likeretter K
+ kanaler, og to-pore domene K
+ -kanaler (K2P kanaler) [3]. Mens mange K
+ kanaler åpne på en bestemt trigger, f.eks forandringer i membranpotensialet, K2P kanaler er konstitutivt aktiv. En funksjonell K2P kanal er en dimer av to kanal subenheter [5,6]. K2P kanaler er gruppert i seks underfamilier basert på deres strukturelle og funksjonelle egenskaper. En av gruppene, oppgaven (Twik-relatert, syre-sensitive) K
+ kanal familie omfatter syre-og oksygenfølsomme K2P kanaler, OPPGAVE-en (kodet av
KCNK3
genet ), OPPGAVE-3 (
KNCK9
), og OPPGAVE-5 (
KCNK15
) [5,6]. OPPGAVE-5 er strukturelt relatert til OPPGAVE-1 og oppgave-3, men er elektrisk taus. OPPGAVE-en er unik blant ionekanaler i å generere en åpen-likeretter «lekkasje» K
+ strøm som er regulert av begge, en økning eller reduksjon av den ekstracellulære pH i fysiologiske området [5,7]. Egenskapene til OPPGAVE-3 er lik OPPGAVE-en, men pK for OPPGAVE-3 strømninger er flyttet til et surere nivå (pH 6,7) [5,7]. Foruten forskjellige funksjoner i nevroner, har OPPGAVE-1 er vist å være funksjonelt uttrykt i hjertet, og for å stille inn hvilemembranpotensialet og regulere tonen i glatte muskelceller i lungene arteriene, tarm og blære [5,7]. Dessuten har OPPGAVE-en vist seg å være en markør for brunt fettvev [8,9].
K2P kanaler, som OPPGAVE-en kanal, gir vanligvis utstrømningen av K
+ fra celler langs deres elektrokjemisk gradient. Sammen med virkningen av Na
+ /K
+ – ATPase, bestemmer K
+ utstrømming hvilemembranpotensialet [5,7]. Etter kontroll av membranpotensialet er viktig også i ikke-eksiterbare celler, f.eks for kontroll av spenningsavhengige kalsium oppføring, men også for Na
+ – drevet oppløst stoff transport, vurdert vi enten OPPGAVE-en er funksjonelt uttrykt i lungekreftceller og menneske lungekreft
Materialer og metoder.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549 (. Cat No. 300114), A427, og SK-MES-1 (SK-MES (Cat No. 300111.); Cat. No. 300339) ble kjøpt direkte fra cellelinjer Tilbud (Eppelheim, Tyskland). A549 og A427-celler ble dyrket i DMEM /F-12 medium (Gibco, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt kalveserum (FCS, BioWest, Ringmer, UK) og antibiotika (penicillin og streptomycin). SK-MES-1-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% FCS og antibiotika. De humane NSCLC-cellelinjer NCI-H23 (ytterligere referert til som H23, ATCC nummer CRL-5800), NCI-H358 (ytterligere referert til som H358, ATCC nummer CRL-5807), og NCI-H441 (ytterligere referert til som H441, ATCC nummer HTB-174) ble anskaffet direkte fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MOR celler og NCI-H460-celler (videre referert til som H460) var en gave fra Martin P. Barr, Institute of Molecular Medicine, St. James Hospital og Trinity College Dublin, Dublin, Irland. H23, H358, H441, H460, og MOR-celler ble dyrket i RPMI (Gibco), supplert med 10% FCS (BioWest) og antibiotika. Tester for å utelukke mycoplasma forurensning ble gjennomført regelmessig.
NSCLC og lungevev
vevsprøver NSCLC og tilsvarende prøvene normale lungevev ble hentet fra tolv pasienter som ble henvist for kirurgisk reseksjon til Divisjon Lunge og hyperbar kirurgi, Medical University of Graz. Før operasjonen signert skriftlig informert samtykke for denne studien ble innhentet fra alle pasienter. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen ved Medical University of Graz (Graz, Østerrike) og gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
hypoksisk behandling
NSCLC celler ble sådd ut i kulturen retter og lov til å feste i 24 timer. Deretter ble cellene dyrket i 72 timer ved 37 ° C i omgivelsestemperatur (21%) oksygen eller 1% oksygen i den automatiserte Xvivo System G300CL (BioSpherix, Lacona, New York) før RNA-ekstraksjon, protein sampling, eller patch clamp opptak. Eksponering for oksygen ble kontrollert gjennom eksperimentene i hypoksisk arbeidsstasjonen. PH-verdien i kulturmediet ble målt ved slutten av eksperimentet ved hjelp av WTW 3110 pH-meter (WTW, Weilheim, Tyskland) umiddelbart etter uttak fra inkubatoren.
Elektro
hel- celle patch clamp teknikk ble anvendt som tidligere beskrevet for å måle det hvilende membranpotensial i henhold til gjeldende klemme og K
+ strømmene i henhold til spenningsklemmen [10]. Alle reagenser ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). I korthet ble cellene superfuseres ved romtemperatur med bad-oppløsning (i mM): NaCl 140,5, KCl 5,5, CaCl
2 1,5, MgCl
2 1, glukose 10, Na
2HPO
4 0.5, KH
2PO
4 0,5, HEPES 10; pH ble justert til 7,3 med NaOH. For OPPGAVE-en innspilling, ble pipetter fylt med følgende løsninger (i mm): KCl 20, kalium metansulfonat (for å undertrykke Cl
– strøm) 135, MgCl
2 1, CaCl
2 0,1, Na
2ATP 2, etylenglykol bis (ß-aminoetyl-eter) -N, N, N «, N»-tetraeddiksyre (EGTA) 3, HEPES 20; pH ble justert til 7,2 med KOH. Den ikke-inaktiverende OPPGAVE-1 K
+ strøm (I
KN) ble oppnådd fra holdepotensialet fra 0 mV, ved å trå spenningen til 60 mV og deretter gradvis til -100 mV i løpet av en periode på 1,6 sek . For å isolere den ikke-inaktive OPPGAVE-1 K
+ strøm (I
KN) fra spenningsavhengig K
+ strøm, ble cellene festet ved 0 mV i minst 5 min. Data ble analysert med pCLAMP 9.0-programvaren (Axon Instruments, Foster City, California).
Gene stanse med siRNA
siRNA målretting OPPGAVE-en og ikke-tie siRNA ble hentet fra Ambion (Waltham , MA). Non-tie siRNA (Negativ kontroll # 1 siRNA, Ambion) viser ingen sekvens homologi til menneskelige gensekvenser. Transfeksjon ble utført ved en sluttkonsentrasjon på 40 nM siRNA ved hjelp Effectene (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Effektiviteten ble vurdert 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon ved qPCR og Western blot.
RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese
Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen) i kombinasjon med DNase fordøyelse (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (1 mikrogram) var revers transkribert ved hjelp av RevertAid H Minus First Strand cDNA syntese kit (Fermentas, Burlington, Canada).
kvantitativ real-time PCR (qPCR)
qPCR reaksjoner var utført i 7900 real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved bruk av TaqMan
® genuttrykk Analyser (Applied Biosystems)
KCNK3 plakater (OPPGAVE-1), Hs00605529_m1;
KCNK9 plakater (TASK-3), Hs00363153_m1;
SLC2A1 plakater (GLUT1), Hs00892681_m1;
HK2
, Hs00606086_m1;
ACTB plakater (ß-aktin), Hs99999903_m1 (referanse genet). PCR ble utført i 10 ul reaksjoner inneholdende cDNA (tilsvarende 25 ng total RNA), 1x TaqMan
® Gene Expression Mastermix (Applied Biosystems), og 1x TaqMan
® Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Mean terskel syklus (Ct) antall triplo forsøk ble anvendt for dataanalyse. Den relative ekspresjon av genet av interesse i behandlede versus kontrollceller ble beregnet som 2
ΔΔCt. ΔCt ble beregnet ved å subtrahere Ct antall av genet av interesse fra den til referanse genet. For beregning av ΔΔCt, ble ΔCt-verdiene i kontrollgruppen subtrahert fra ΔCt-verdier for den behandlede gruppe.
Western blot
Celler ble lysert på is i Ripa buffer (Sigma-Aldrich ) inneholdende proteaseinhibitorer. 50 ug protein ble applisert på en 10% akrylamidgel, separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese ved bruk av Mini-Protean
® elektroforese enhet (BioRad, Hercules, CA) og overført til en PVDF-membran (BioRad). Immundeteksjon ble utført med kanin polyklonale anti OPPGAVE-1 antistoff (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, APC-024) fortynnet 1: 500 eller en mus monoklonalt OPPGAVE-3-antistoff (Abcam, Cambridge, MA, ab50042) fortynnet 1: 1000. Peroxydaseaktivitet ble oppdaget ved hjelp chemiluminescence deteksjon (SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat, Thermo Scientific, Waltham, MA). Som en lastekontroll, ble membraner farget med en polyklonale antistoff mot p-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California).
apoptose analyser
OPPGAVE-en siRNA eller styrer siRNA transfekterte celler ble replated på 2×10
4 celler /cm
2. Etter 24 timer apoptotiske stimuli ble lagt: enten cisplatin eller DMEM medium mangler glukose (Gibco). Etter ytterligere 72 timer flytelegemer og festede celler ble innhøstet, og suspensjonen ble sentrifugert ved 400 g i 5 min. Prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt med caspase-3 Intracellulær Activity Assay Kit I (PhiPhiLux
® G1D2, Merck, Darmstadt, Tyskland), eller etter seponering av settet av produsenten, ved CellEvent Caspase-3/7 grønn Flowcytometri Assay Kit (molekylære prober, Waltham, MA). Den DEVD peptidkonsentrasjonen ble innstilt på 4 pM. Prøvene ble analysert ved flowcytometri (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, USA). Som en annen metode cellene ble høstet, sentrifugert, farget med Hoechst fargestoff (Invitrogen, Waltham, MA), og kjernefysisk fragmentering ble vurdert. Observatøren (KL) ble blindet for behandling, minst 500 celler per prøve ble evaluert.
proliferasjonsanalyser
transfekterte celler replated i seks-brønns plater på 1×10
5 celler /brønn i kulturmedium inneholdende 1% FCS. Etter angitte tidspunkter ble cellene trypsinert og totale celle tall ble målt med casy
® celleteller (Scharfe System, Reutlingen, Tyskland) i duplikater. For vurdering av mitose, ble celler inkubert i kulturmedium inneholdende 1% FCS. Etter 48 timer EDU (5-etynyl-2′-deoksyuridin, et nukleosid analog av tymidin) ble tilsatt til mediet i ytterligere 1,5 timer. Etter høsting ble cellene analysert med Clickit Edu kit (Invitrogen) ved hjelp av flowcytometri (FACS Calibur, BD Biosciences).
I silico
uttrykk analyse
mRNA overflod av medlemmer av
SLC5
familie av transportører og
SLC38A1 Hotell og
SLC38A2
ble undersøkt i en offentlig tilgjengelig genekspresjon datasett i lunge adenokarsinom prøver og normale lunger (GDS3257) [ ,,,0],11] publisert i Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Detaljer om microarray behandling og pasientkarakteristika er ført til GEO og i [11].
Statistisk analyse
Data ble samlet og analysert med SPSS programvarepakken, versjon 21.0 (Chicago, Illinois) eller med GraphPad Prism, versjon 5.03 (La Jolla, California). Gruppeforskjeller ble beregnet med uparede eller sammen Student
t
-test, en-sample Student
t
-test, eller Toveis ANOVA med Bonferroni post hoc-analyse som er aktuelt.
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
OPPGAVE-en er uttrykt i en undergruppe av NSCLC cellelinjer og NSCLC vev
Først vi undersøkt OPPGAVE-1 og oppgave-3 protein og mRNA i åtte humane NSCLC-cellelinjer. OPPGAVE-1-proteinet var konsekvent påvises ved immunblotting i fire av de åtte cellelinjer (A549, H358, H460, og MOR), det sterkeste uttrykket blir funnet i A549, H460, og MOR-celler (figur 1A). I tillegg ble svak OPPGAVE-1 protein uttrykk funnet i A427, H441 og SK-MES celler, mens uttrykket i H23 celler var ubetydelig. I A549 celler også OPPGAVE-1 mRNA nivåer ble hevet mens i alle andre cellelinjer ingen klar sammenheng mellom OPPGAVE-1 protein og mRNA nivåer ble observert (figur 1A). Men OPPGAVE-1 protein nivåer er ikke bare regulert av genuttrykk, men viktigst også ved endocytose og degradering [12,13]. Dette kan forklare avvik mellom OPPGAVE-1 protein og mRNA nivåer. Interessant, med de kommersielt tilgjengelige OPPGAVE-1 primere ingen oppgave-1 mRNA-transkript ble funnet i H441 celler. OPPGAVE-3, som har blitt beskrevet å bli forsterket i lunge og bryst kreft [14], ble uttrykt i alle åtte NSCLC-cellelinjer med lavest uttrykk blir funnet i A549-celler (figur 1B). OPPGAVE-1, et glykosylert protein [15], først ved en molekylvekt på 52 kDa på immunoblot (figur 1C). En svak ekstra band på 46 kDa kan representere den glykosylerte OPPGAVE-en form (figur 1C). Signalet ble opphevet ved bruk av en spesifikk blokkerende peptid til antistoffet, og ble redusert etter transfeksjon med kommersielt tilgjengelige siRNA målretting OPPGAVE-1 (figur 1C-1E), noe som bekrefter dets spesifisitet.
(A) OPPGAVE -1 ekspresjon i åtte forskjellige NSCLC-cellelinjer. En representant immunoblot og middel densitometry verdier vises. A549 celler, til stede på alle immunoblotter, servert som en referanse for normalisering. Bottom: OPPGAVE-1 mRNA nivåer ble vurdert av kvantitativ RT-PCR. Beta-aktin (ACTB) ble anvendt som en referanse genet. (B) OPPGAVE-3 protein og mRNA nivåer i åtte forskjellige NSCLC cellelinjer. (A, B) Resultatene er gjennomsnitt +/- SEM fra tre til fire uavhengige utvalg. Gruppe sammenligninger ble beregnet med en-gruppe t-test. (C, D) A549 celler ble transfektert med ikke-tie siRNA (c), OPPGAVE-en siRNA (T) eller venstre ubehandlet (u). (C) Representative immunoblot ved anvendelse av en OPPGAVE-1-antistoff i nærvær eller fravær av en spesifikk blokkerende peptid er vist. OPPGAVE-en vises på en molekylvekt på 52 kDa, kan den ekstra svakt bånd på 46 kDa representerer unglycolsylated form. (D) OPPGAVE-1 mRNA nivåer 48 timer etter transfeksjon med OPPGAVE-en siRNA vurdert av kvantitativ RT-PCR. (E) Representative immunoblotter av OPPGAVE-en i A549 celler og H358-celler på ulike tidsintervaller etter transfeksjon. Data er vist som gjennomsnitt +/- SEM fra n = 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
oppgave- en er funksjonell og bidrar til å sette membranpotensialet i A549 celler
for å bevise at OPPGAVE-1 danner funksjonelle kanaler i lungekreftceller, ble K
+ strøm analysert i A549 celler. Etter bruk en holder potensialet fra 0 mV, som inaktiverer de spenningsstyrte K
+ kanaler, en «non-inaktivere» K
+ strøm (I
KN) ble påvist i A549-celler (figur 2). Strømmen ble modulert ved avvik av pH, som viser en signifikant reduksjon ved lav pH-verdi og en signifikant økning ved høy pH (figur 2A). Den selektive OPPGAVE-en inhibitor Anandamid [16] (10 mm) betydelig redusert de ikke-inaktive K
+ strøm i A549-celler (figur 2B). Følgelig, inhibering av OPPGAVE-en strøm av Anandamid (10 pM) førte til betydelige depolarisering av cellemembranen mot mindre negative verdier (figur 2B). Når den ikke-inaktive K
+ strøm ble analysert i A549 celler transfektert med OPPGAVE-en siRNA eller kontrollere siRNA, celler transfektert med OPPGAVE-en siRNA viste en betydelig redusert ikke-inaktive K
+ strøm (Fig 2C) . Disse data viser klart at funksjonelle OPPGAVE-1 kanaler er til stede i A549-celler, og at en vesentlig del av den ikke-inaktiverende K
+ strøm blir båret av OPPGAVE-1-kanaler. Den ikke-inaktivere strøm ble også redusert med OPPGAVE-3 hemmer ruthenium red [17] (figur 2D). Virkningene av Anandamid og ruthenium rød var additiv (figur 2D).
(A) Representative opptak av en ikke-inaktiverende K
+ strøm (I
KN) på A549-celler ved bruk av helcelle patch clamp teknikken under sure og grunnleggende forhold, og grafer som oppsummerer den gjennomsnittlige gjeldende ved 0 mV. I /I
0 er strømmen i nærvær av lav (6,3) eller høy (8,3) pH-verdien, uttrykt som en brøkdel av den strøm før behandlingen. Den ikke-inaktiverende strøm blir redusert under sure og øket under basiske betingelser. (B) Representative opptak og et diagram som oppsummerer de ikke-inaktiverende K
+ strøm (I
KN) og det hvilende membranpotensial (
E
m) i nærvær og fravær av oppgaven-en inhibitor Anandamid (Ana, 10 mm) ved pH 7,3 i A549 celler. I /I
0 er strømmen i nærvær av Anandamid uttrykt som en brøkdel av den nåværende før Anandamid behandling. Anandamide redusert den ikke-inaktiverende K
+ strøm og ført til depolarisering av cellemembranen mot mer positive verdier. (C) Representative opptak av den ikke-inaktive K
+ strøm (I
KN) og søylediagram oppsummerer middelstrømmen ved 0 mV i A549 celler transfektert med OPPGAVE-en siRNA eller kontrollere siRNA ved pH 7,3. (D) Representative opptak av den ikke-inaktive K
+ strøm (I
KN) og normalisert gjennomsnittlig strøm på 0 mV i A549 celler etter behandling med OPPGAVE-3 blocker ruthenium rød (RR, 10 mm) eller ruthenium rød sammen med Anandamid (10 mm) ved pH 7,3. Data er gjennomsnitts +/- SEM. **
P
0,01, ***
P
0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. Ana, Anandamid; RR, ruthenium rødt.
OPPGAVE-en mediert K
+ strøm hemmes av hypoksi
OPPGAVE-1 er kjent for å være hemmet etter akutt hypoksi ved posttranslasjonelle mekanismer [10]. Vi dyrket A549 celler etter hypoksi for å vurdere om OPPGAVE-en mediert K
+ strøm er følsom for hypoksi i lungekreft celler. I hypoksiske celler, et ikke-inaktive K
+ strøm var påviselig (fig 3A), men strømmen var lavere enn etter normoxia og manglet følsomhet for OPPGAVE-en inhibitor Anandamid (fig 3A). Den ikke-inaktiverende K
+ strømtetthet i celler dyrket under hypoksi var betydelig lavere enn i celler dyrket under normoxia (figur 3B). Tilsvarende hvilemembranpotensialet (
E
m) var signifikant mer positive (depolarized) i hypoksiske celler enn i normoksisk celler (figur 3B). PH-verdien i kulturmediet av celler dyrket under forskjellige oksygenkonsentrasjoner på tettheten brukes for patch-clamp eksperimenter ble målt for å klargjøre hvorvidt en forskjell i pH-verdi kan forklare den observerte reduksjon av den ikke-inaktiverende K
+ strøm under hypoksi. Den midlere pH-verdien i cellekulturmediet var 7,57 (+/- 0,11) under normoxia og 7,85 (+/- 0,05) under hypoksi (
P
= 0,02). Den litt høyere pH etter hypoksi, muligens på grunn av den reduserte veksten av A549 celler etter hypoksi [18], vil heller øke enn redusere OPPGAVE-1 K
+ strøm, og dermed en forskjell i pH var ikke ansvarlig for hypoksi- induserte hemming av strømmen.
(A) Høyre, representative opptak av den ikke-inaktiverende K
+ strøm (i
KN) på A549-celler dyrket under hypoksi (1% oksygen) i tre dager. Den påvisbare nåværende mangler følsomhet for OPPGAVE-en inhibitor Anandamid (Ana, 10 mm). Høyre, graf som oppsummerer den gjennomsnittlige gjeldende ved 0 mV. (B) Ikke-inaktivere K
+ strømtetthet (I
KN Density, til venstre) og hvilemembranpotensialet (
E
m; høyre) i A549 celler dyrket under hypoksi eller normoxia. (C) i forhold overflod av OPPGAVE-1 mRNA i A549 celler dyrket under hypoksi (1% oksygen) for ulike tidsintervaller målt ved kvantitativ PCR. GLUT-1 og heksokinaseløsning 2 (HK2) ble vurdert som hypoksi markører. (D) Immun og relative overflod av OPPGAVE-1 protein i A549 celler dyrket under hypoksi (1% oksygen) målt for ulike tidsintervaller. Data er gjennomsnitts +/- SEM. *
P
0,05, ***
P
0,001, N.S., ikke signifikant. Ana, Anandamid; HK2, heksokinaseløsning 2; GLUT1, oppløst stoff carrier familie 2 (lettere glukosetransportør), medlem 1.
Reduksjonen i Anandamid-sensitive K
+ strøm under hypoksi var ikke skyldes en nedgang i oppgave en uttrykk, ettersom mRNA-nivåer var lavere, men til og med litt høyere i hypoksi, selv om forskjellen var ikke signifikant (figur 3C). Interessant, gradvis økt OPPGAVE-1 mRNA nivåer over tid i A549 celler belagt i kulturplater og samlet hver 24. time, både i hypoksi og normoxia (Fig 3C). Det er ikke kjent hvorvidt en økning i celletetthet, en mulig liten forskyvning i pH-verdien, eller en uttømming av næringsstoffer er den underliggende årsak. Uttrykk for GLUT-1 (
SLC2A1
, oppløst stoff carrier familie 2 (lettere glukosetransportør), medlem 1) og heksokinaseløsning 2 (
HK2
), kjente hypoksi-indusert gener, ble forhøyet etter hypoksisk behandling (fig 3C). Likeledes OPPGAVE-1 proteinnivåer i A549 celler ble ikke påvirket av hypoksi (Fig 3D).
OPPGAVE-en knockdown øker apoptose i A549 celler
Vi forstummet OPPGAVE-en i A549 og i H358 celler ved hjelp av siRNA. Når det cytotoksiske medikament cisplatin, som er kjent for å indusere apoptose i lungekreftceller, ble administrert til A549-celler, ble en signifikant økning i cisplatin-indusert apoptose som finnes i OPPGAVE-1 siRNA transfekterte celler sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler (figur 4A og 4C, S1 fig). Denne effekten ble ikke observert i H358-celler (figur 4B, S2 fig). Likeledes når apoptose ble indusert ved glukosemangel, OPPGAVE-en lyddemping førte til en signifikant økning i apoptose i A549-celler, men ikke i H358-celler (figur 4A og 4B, S1 og S2 figurene). Celler ble sådd ut på nytt etter transfeksjon for å unngå høye celletettheter, særlig i ubehandlede celler, i løpet av eksperimentet. Men hvis re-plating ble utelatt, det samme apoptose fremmende effekten av OPPGAVE-en siRNA ble observert i A549 celler (figur 4D). Effekten av OPPGAVE-en knockdown av siRNA var lavere i H358-celler enn i A549 celler etter 48 timer, men nådde samme nivå etter 72 timer (figur 1E). Dermed kan forskjellene i følsomhet for OPPGAVE-en siRNA ikke forklares med ulike nivåer av knockdown.
(A, B) Cellene ble transfektert med OPPGAVE-en siRNA eller ikke-tie siRNA (kontroll siRNA). 48 timer etter transfeksjon, ble cellene på ny sådd ut, etter ytterligere 24 timer ble cellene behandlet med forskjellige stimuli i 72 timer, og apoptose ble bestemt ved påvisning av celler med kaspase 3 aktivitet ved FACS-analyse. For apoptose-induksjon, ble cellene behandlet med cisplatin ved forskjellige konsentrasjoner eller med DMEM-medium inneholdende dialysert serum og 10 mM eller 0 mM D-glukose (balansert med metabolsk inert L-glukose). (C) A549-celler ble transfektert og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin på samme måte som i panel A. Apoptose ble bestemt ved å farge flytende og festede celler med Hoechst fargestoff. Utbredelsen av atom fragmentering ble bestemt i en blindet måte. (D) A549-celler ble transfektert på samme måte som i panel A og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin uten tidligere replating. (A, B, D) Apoptose ble bestemt ved påvisning av celler med kaspase 3 aktivitet ved FACS-analyse. Resultatene er gjennomsnitt +/- SEM fra n = 3 uavhengige eksperimenter. Gruppe sammenligninger ble utført med Toveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc-analyse. *
P
0,05, **
P
0,01; ***
P
0,001. ns, ikke signifikant.
OPPGAVE-en knockdown reduserer spredning i A549 celler
Når vi vurdert rollen OPPGAVE-en i lungekreft celleproliferasjon under serum redusert forhold, vi funnet at knockdown av OPPGAVE-1 siRNA betydelig redusert celletallet økningen i A549-celler, men ikke i H358-celler (figur 5A). Den mitose rate, målt ved Edu innlemmelse, ble også betydelig redusert i A549 celler behandlet med OPPGAVE-en siRNA sammenlignet med kontroll siRNA (Fig 5B).
(A) Cellene ble transfektert med OPPGAVE-en siRNA eller ikke -silencing siRNA (kontroll siRNA). 48 timer etter transfeksjon ble cellene sådd ut i medium med redusert serum-innhold (1%), for å unngå overstimulering av celler. Totalt celle tall ble talt hver påfølgende dag i duplikater med elektronisk puls Analyse (casy
®). Resultatene er gjennomsnitt +/- SEM fra n = 3 uavhengige eksperimenter. Gruppe sammenligninger ble utført med Toveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc-analyse. (B) Celler ble transfektert som beskrevet og dyrket i serum redusert medium (1%) i 48 timer. Mitose ble vurdert ved hjelp av en EDU opptaksanalyse. Resultatene er gjennomsnitt +/- SEM fra n = 4 uavhengige eksperimenter. **
P
0,01, ***
P
0,001, ns, ikke signifikant
Uttrykk for oppgave en og mulige nedstrøms effektorer. av OPPGAVE-1, Na
+ – kombinert transportører, i menneskelig NSCLC og normale lunger
Når vi analyserte OPPGAVE-1 uttrykk på proteinnivået i humane NSCLC prøvene og tilsvarende normal lungevev fra tolv pasienter vi funnet variable nivåer av uttrykk, både, i lungene og tumorer (figur 6a). Samlet uttrykket nivåer ble ikke endret i NSCLC i forhold til normal lunge (Fig 6A). Na
+ – kombinert nærings transportører er antatte nedstrøms effektorer av OPPGAVE-en siden deres handling avhenger Na
+ gradienter som bare kan etableres hvis K
+ import av Na
+ /K
+ – ATPase er balansert av K
+ – eksport via K
+ kanaler. Vi vurderte uttrykk for Na
+ – oppløste co-tilhengere, medlemmer av
SLC5
familie og Na
+ – drevet glutamin transportører
SLC38A
en og
SLC38A2
, i menneskelige NSCLC (adenokarsinom) prøver sammenlignet med normal lungevevet ved hjelp av en stor, offentlig datasett publisert på GEO (GDS3257) [11]. Vi fant Na
+ – glukose symporters
SLC5A1 plakater (SGLT1) og
SLC5A2 plakater (SGLT2) skal uttrykkes i NSCLC på et tilsvarende nivå som i normal lunge, hvor SGLT- mediert transport av glukose på tvers av alveolar epitellaget spiller en viktig rolle i glukose reopptak [19]. Men vi fant betydelig økt uttrykk for Na
+ /myo-inositol co-transporter
SLC5A3
, Na
+ – avhengig multivitamin transporter
SLC5A6
, og av glutamin transporter
SLC38A1
i tumorer versus normal lunge (fig 6B og 6C).
SLC38A
2 ble ikke uttrykt forskjellig (data ikke vist).
(A) OPPGAVE-1 protein ble vurdert i NSCLC vev og tilsvarende ikke-involverte lunge fra tolv pasienter som bruker Western blot. Høyre: densitometry verdier for OPPGAVE-en i NSCLC og lungene ble normalisert til p-aktin. (B, C) mRNA nivåer av medlemmer av
SLC5
familie av Na
+ – kombinert transportører og av Na
+ – drevet glutamin transporter
SLC38A1
ble vurdert i en offentlig tilgjengelig GEO datasett (GDS3257) [11] publisert i Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) i lunge adenokarsinom prøver (n = 58) og normale lunger (n = 49). RMA (Robust multichip gjenomsnitt) uttrykk tiltak for mRNA overflod er i loggen skala. ***
P
0,001, *
P
. 0,05
Diskusjoner
Betydningen av K
+ kanaler i mitosen er foreslått så tidlig som i 1960, men bare ganske nylig K
+ kanaler har blitt studert i kreft [3]. I vår studie viser vi at OPPGAVE-en er uttrykt i en undergruppe av NSCLC og at OPPGAVE-en er funksjonell, fremmer spredning og hemmer apoptose i en svært OPPGAVE-1 som uttrykker lungekreft cellelinje.
Aberrant uttrykk for K
+ -kanaler er hyppig observert i kreft, men forståelsen av deres regulering og funksjon under kreft progresjon og vekst er ufullstendig. [14].
