Abstract
Mange studier har vist at mikroRNA uttrykk i kreft kan være regulert av epigenetiske hendelser. Nylig fant vi at i lungekreft MIR-212 var sterkt nedregulert. Men mekanismene som er involvert i reguleringen av MIR-212 uttrykk er ukjent. Derfor adressert vi dette punktet ved å undersøke de molekylære mekanismene for MIR-212 stanse i lungekreft. Vi identifiserte histonmodifikasjonene fremfor DNA hypermethylation som epigenetiske hendelser som regulerer MIR-212 nivåer i NSCLC. Videre fant vi at MIR-212 stanse in vivo er nært knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen
Citation. Incoronato M, Urso L, Portela A, Laukkanen MO, Soini Y, Quintavalle C, et al. (2011) epigenetisk regulering av Mir-212 uttrykk på lungekreft. PLoS ONE 6 (11): e27722. doi: 10,1371 /journal.pone.0027722
Redaktør: Tobias Eckle, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 25 juli 2011; Godkjent: 24 oktober 2011; Publisert: 15.11.2011
Copyright: © 2011 Incoronato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra: Fondazione IRCCS SDN www.sdn-napoli.it, 5 × 1000 til Istituto di Ricerca Diagnostica e nucleare Fondazione IRCCS SDN, Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AIRC) (tilskudd n.ro 10620) www.airc .it og MERIT (RBNE08E8CZ_002) www.miur.it til GC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er lungekreft den vanligste kreftformen i form av både forekomst og dødelighet (1,35 millioner nye tilfeller per år og 1,18 millioner dødsfall), med de høyeste tallene i Europa og Nord-Amerika. De viktigste typer lungekreft er
småcellet lungekreft plakater (SCLC) og
ikke-småcellet lungekreft plakater (NSCLC). De ikke-småcellet karsinom inkluderer adenokarsinomer, plateepitelkarsinom lunge karsinomer, og store celle lungekarsinom. Disse svulstene har bare en 20-30% positiv klinisk respons, er fortsatt ukjent, men årsaken til behandlingsresistens.
microRNAs (mirnas) er evolusjonært konservert, endogen kodende RNA på omtrent 22 nukleotider (nt) i lengde involvert i protein-uttrykk regulering på posttranskripsjonelt nivå [1]. Med bruk av miRNA uttrykket profilering, har betydelig innsats er gjort for å korrelere miRNA uttrykk med tumor prognose [2], [3]. Til dags dato, en rekke nedregulert mirnas som finnes i lungekreft korrelerer med pasientens overlevelse [4], [5], [6] og med terapeutisk respons [7]. Dette funnet førte mange forskningsgrupper for å identifisere de molekylære mekanismene som er ansvarlig for dereguleringen av disse miRNAs i kreft hos mennesker.
epigenetikk viser til endringer i genuttrykk som oppstår uten endringer i DNA-sekvensen. Det er to primære og sammenkoblede epigenetiske mekanismer: DNA-metylering av CpG øyer innenfor promoter-regioner og post-translasjonell modifikasjon av histon haler som acetylering, fosforylering, metylering og ubiquitilation [8], [9], [10]. I tillegg til kjente genetiske mutasjoner som er involvert i neoplastisk transformasjon, mange bevis tyder på at kreftcellene har en endret epigenetisk maskiner siden enten DNA-metylering eller histonmodifikasjonene er modifisert sammenlignet med normale celler [11].
Nylig har vi funnet begge
in vivo Hotell og
in vitro Hotell som MIR-212 ble sterkt nedregulert i lungekreft og at ektopisk uttrykk økt TRAIL (tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand) følsomheten av lungekreft celler [ ,,,0],12]. Siden mange microRNAs nedregulert i kreft har vært tett knyttet til CpG island hypermethylation og /eller endring i histone merker endringer [13], [14], [15] vi lurte på om de samme endringer kan være involvert i MIR-212 stanse i lungekreft . Derfor, i dette manuskriptet undersøkte vi begge DNA metylering mønstre og histonmodifikasjonene av MIR-212 promoter-regionen i Calu-en (NSCLC) og MRC5 (normale humane fibroblaster avledet fra fosterets lunge fibroblast) celler som frakter forskjellige Mir-212 uttrykk profiler. Våre resultater viser at selv om den transkripsjonstartsetet av MIR-212 er innebygd i et CpG øy, er dens transkripsjonelle inaktivering i lungekreft ikke er knyttet til DNA-hypermethylation status, men i stedet for en endring i den metylering status av histon haler bundet til promoter-regionen av dette mikroRNA. Videre, ved hjelp av vevsprøver av lungekreft på ulike TNM staging vi analysert uttrykket nivåer av MIR-212 og funnet ut at det lyddemping er nært knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen.
Resultater
uttrykk av MIR-212 i ulike lungekreft stadier
Nylig demonstrerte vi begge
in vitro Hotell og
in vivo Hotell som Mir-212 uttrykk i lungekreft er nedregulert i forhold med normal lunge [12]. For å teste hvorvidt dens stanse korrelerer med scenen av svulsten, ble vevsprøver innsamlet fra 34 NSCLC rammede pasienter ved forskjellige TNM staging (kliniske funksjoner er oppsummert i tabell 1). Vi deretter analysert Mir-212 uttrykk ved QRT-PCR (figur 1A). Som vist i T1 /T2 prøver, er uttrykk for MIR-212 mest heterogene. Tvert imot, i T3 /T4 prøver, MIR-212 ekspresjon var homogent nedregulert. Figur 1B er et gjennomsnitt av T1 /T2 prøvene sammenlignet med T3 /T4. Disse data indikerer at ved å stanse all MIR-212 er nært knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen.
(A) Total RNA ekstrahert fra vev prøver innsamlet fra 34 NSCLC-berørte individer med forskjellig TNM staging (T1-T2 T3-T4) ble brukt til å analysere Mir-212 uttrykk ved real-Time PCR. (B) Mean ± SD av Mir-212 uttrykk for pool T1 /T2 vs T3 /T4. Feilfelt angir SD. * P 0,05, ved t-test. Som vist i T1 /T2 iscenesettelsen uttrykk for MIR-212 er helt klart heterogen mens i T3 /T4 iscenesettelse Mir-212 uttrykk er sterkt forstummet og korrelerer med alvorlighetsgraden av sykdommen.
rolle epigenetisk på Mir-212 uttrykk-Bruke CpG Island Searcher program (https://www.cpgislands.com/) fant vi at MIR-212 locus ble integrert i en CpG island. Det er kjent at flere mirnas er epigenetiske stilnet i forbindelse med CpG øy hypermethylation i kreftceller [16], [17]. Vi derfor undersøkt om tapet av MIR-212 uttrykk i NSCLC ble assosiert med DNA hypermethylation. Vi analyserte etter bisulfite genomisk sekvensering av DNA metylering status for de antatte transkripsjonsstartsider (TSSs) av pri-MIR-212 [18], [19] i Calu-en og MRC5 cellelinjer som uttrykker ulike mengder av MIR-212 (figur 2A). Som vist i figur 2B, i Calu-1-regionen analysert ble i stor grad under-metylert. For å bekrefte at transkripsjonen stanse av MIR-212 i lungekreft ikke var forbundet med CpG metylering, Calu-1 celler ble behandlet med to forskjellige konsentrasjoner av DNA metylering hemmer 5-aza-2′-deoxycytidine (5’Aza) som angitt . MIR-212-ekspresjon ble deretter evaluert ved Q-RT-PCR (fig. 2C-D). Som vist i figur 2C-D, ved å 5’Aza behandling, MIR-212 ekspresjonsnivåene var uendret. Til sammen disse resultatene tyder på at metylering ikke er relatert til Mir-212 stanse i NSCLC.
(A) Expression analyse av MIR-212 i NSCLC (Calu-1) og normale humane fibroblaster avledet fra fosterets lunge (MRC5 ) av Real- Time PCR. (B) Bisulfite genomisk sekvense analyser av MIR-212 CpG øy i Calu-1 og MRC5 celler. Åtte enkle kloner er representert for hver prøve. Svarte og hvite firkanter representerer metylert og unmethylated CpG henholdsvis, og hver loddrett strek illustrerer en enkelt CpG. (C) Expression analyse av modne MIR-212 ved Real-Time PCR i Calu-1 celler i fravær (kontroll) eller i nærvær av 1 um (venstre panel) og 5 mikrometer (panel høyre) av DNA metylering hemmer 5-aza- 2′-deoksycytidin (5-Aza-2dC), som angitt. I NSCLC, er DNA hypermethylation av CpG island ikke oppdaget noe som tyder på at dette epigenetisk modifikasjon er ikke ansvarlig for MIR-212 stanse. Betyr ± SD av fire uavhengige forsøk i tre eksemplarer er gitt.
Metylering og acetylering analyse av histoner knyttet til TSS på MIR-212
Vi deretter undersøkt om endringer i histonproteinene kunne står for MIR-212 downregulation i NSCLC. Vi utførte Chip analyse ved hjelp av fire antistoffer mot spesifikke histonmodifikasjonene: H3K4me3 og H3K9Ac, vanligvis assosiert med transkripsjonen aktive kromatin, og H3K27me3 /H3K9me2 vanligvis forbundet med transkripsjonen inaktiv kromatin. Deretter sammenlignet vi histon markerer mønster av den forutsagte MIR-212 TSS både i Calu-1 og MRC5 celler. Som ventet, har vi funnet betydelige forskjeller i metylering status av H3K27 og H3K9 og i acetylering status for H3K9 (figur 3). Nærmere bestemt, i Calu-1-celler som uttrykker lave nivåer av MIR-212, TSS av MIR-212 er beriket av tilstedeværelsen av histonproteinene med kovalente modifikasjoner er involvert i genet Slå (H3K27me3 og H3K9me2). Tvert imot, høy MIR-uttrykkende 212 MRC5-celler, viste en økning i histonmodifikasjonene forbundet med genaktivering (H3K9Ac) sammenlignet med Calu-1-celler. Våre data tyder på at epigenetiske modifikasjoner på histoner på MIR-212 TSS bidra til sin epigenetisk stanse i NSCLC.
chip og Real-Time PCR ble brukt til å studere, i Calu-en og MRC5 celler, histonmodifikasjonene i promoter-regionen i MIR-212 ved hjelp av antistoffer rettet mot H3K4me3, H3K27me3, H3K9me2 og H3K9Ac. En negativ kontroll-antistoff (IgG) ble inkludert i brikken analysen. Betyr ± SD av fire uavhengige forsøk i tre eksemplarer er gitt.
Altered Mir-212 uttrykk i NSCLC er knyttet til endringer i histonmodifikasjonene
histone methyl transferase EZH2, en bestemt H3K27 metyl transferase, er ofte over-uttrykkes i human kreft [20]. Videre immunhistokjemiske analyser viste at G9a, en bestemt H3K9 metyltransferase, ble sterkt uttrykt i lungekreft vevsprøver i forhold til normal lungeprøver [21].
Basert på disse funnene, vi analysert av q-RT-PCR uttrykk nivåer av EZH2 og G9a enzymer i Calu-en og MRC5 celler. Som vist i figur 4, oppviste Calu-1-celler økte mengder av EZH2 (A) og G9a (B) i forhold til MRC5-celler. Tvert imot, har ekspresjonsnivåer av H3K9 de-acetylase-HDAC ikke er ulik for de to cellene skriver figur 4C.
(A) Ekspresjon analyse av EZH2, (B) G9a og (C) HDAC-enzymer ved Real- time PCR i Calu-1 og MRC5 celler. (D) Ekspresjon analyse av modent MIR-212 i Calu-1-celler ubehandlet (-) eller behandlet (+) med siEZH2 og TSA-inhibitor eller (E) med TSA og BIX01294 (BIX) inhibitorer. (D) Calu-1-celler ble transfektert med spesifikk EZH2-siRNA i 24 timer. Deretter ble cellene inkubert med 100 ng /ml av TSA i 24 timer og MIR-212-ekspresjon ble evaluert ved QRT-PCR. Nedregulering av EZH2 uttrykk etter siEZH2 transfeksjon ble evaluert ved Western-blotting ved anvendelse av anti-EZH2 antistoff. For å bekrefte lik belastning på membranen ble immunoblottet med anti-β-aktin-antistoff. (E) Calu-1 celler ble behandlet med 100 ng /ml TSA i 16 eller 24 timer i nærvær eller i fravær av 10 pM BIX i 16 timer og Mir-212 uttrykk ble evaluert av Real-Time PCR. Disse resultater antyder at i Calu-1-celler oppregulerer EZH2 og G9a enzymer som bidrar til å øke histon metylering og således å redusere MIR-212 ekspresjonsnivåer. Betyr ± SD av fire uavhengige forsøk i tre eksemplarer er gitt.
De samme resultatene ble oppnådd i en annen NSCLC cellelinje, A549. Som vist i figur S2, A549-celler viser lave nivåer av MIR-212 (A), oppregulering av EZH2 (B) og G9a (C) og tilsvarende nivåer av HDAC (D), å sammenligne med MRC5.
I for å bekrefte involvering av histonmodifikasjonene i MIR-212 stanse i NSCLC, inhiberte vi både EZH2 ekspresjon og HDAC aktivitet, og deretter analysert effektene på MIR-212-ekspresjon i Calu-1-celler. Til dette formål, ble Calu-1-celler transfektert med EZH2-siRNA og /eller behandles med TSA, en spesifikk inhibitor av HDAC. MIR-212 ble deretter evaluert av q-RT-PCR. Som forventet, enten siRNA-mediert knock-down av EZH2 metylase, eller TSA-mediert hemming av HDAC de-Acetylase aktivitet bidratt til å øke Mir-212 uttrykk nivåer (Figur 4D). Interessant nok var effekten større (fire-folder) i nærvær av begge hemninger. Den samme effekt ble observert i A549-celler (Figur S2E). Inhiberingen av EZH2 og HDAC produserte en økning (to-folds) av MIR-212 også i MRC5-celler (figur S2F).
For å bestemme hvilken rolle G9a på MIR-212 stanse, Calu-1 cellene ble behandlet med BIX01294, en spesifikk inhibitor av G9a metylase, i nærvær eller i fravær av TSA. MIR-212 ble evaluert av q-RT-PCR. Som forventet, var behandling med begge reagenser, bidratt til å øke MIR-212 ekspresjonsnivåer opp til 5 folder (figur 4E). Tatt sammen tyder disse resultater på at oppregulering av EZH2 og G9a enzymer i lungekreft bidrar til å øke histon metylering og således å redusere MIR-212 ekspresjonsnivåer. Når brukt på samme tid, siEZH2 /TSA eller BIX01294 /TSA produsert større virkninger på MIR-212 uttrykk i forhold til den enkle inkubering. Dermed er det mulig å spekulere i at H3K27me3 eller H3K9me2-mediert stanse maskiner krever HDAC aktivitet, som tidligere rapportert av Lachner M
et al product: [22].
Effekter av hemming av EZH2, G9a og HDAC på histonproteiner
Basert på disse funnene, lurte vi på om hemming av EZH2, G9a og HDAC enzymer i Calu-1 celler kan føre til en endring i H3K27me3, markerer H3K9me2 og H3K9Ac histon mønster på TSS av MIR-212 påvirker dermed Mir-212 uttrykk nivåer. Til dette målet, ble Calu-1 celler behandlet med siEZH2 og TSA og chip analyser ble utført ved hjelp H3K27me3 og H3K9Ac antistoffer, henholdsvis. Interessant, hemmer både metylase (EZH2) og de-Acetylase (HDAC), sterkt økte acetylering av H3K9 og betydelig redusert metylering av H3K27 av MIR-212 TSS sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A). Disse resultatene korrelerer med oppregulering av MIR-212 i det samme eksperimentelle tilstand (sammenlign figur 4D med figur 5A). I tillegg ble Calu-1 celler behandlet med BIX01294 og TSA-hemmere og chip analyser ble gjennomført ved hjelp av H3K9me2 og H3K9Ac antistoffer, henholdsvis. Som ventet, har vi funnet at inhibering av den katalytiske aktiviteten til enten metylase (G9a) eller de-acetylase (HDAC), sterkt redusert metylering av H3K9 og betydelig økt acetylering av H3K9 på MIR-212 TSS sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5B) . Samlet utgjør disse resultatene sterkt demonstrere at spesifikke endringer i histonmodifikasjonene bestemme MIR-212 stanse i NSCLC.
chip og QRT-PCR ble brukt til å analysere, i Calu-1 celler, histonmodifikasjonene på spådd speil 212 TSS (A) i fravær (scrb) eller i nærvær av TSA og siEZH2, og (B) i fravær (scrb) eller i nærvær av TSA og BIX inhibitorer, respektivt. (A-B) Calu-1-celler ble behandlet i nærvær av de angitte inhibitorer som beskrevet i forklaringen til figur 4. Resultatene indikerer at den histone modifikasjon katalysert av EZH2, G9a og HDAC-enzymer lokaliteter er involvert i MIR-212 stanse i NSCLC. Middelverdier ± SD av fire uavhengige forsøk in triplo er gitt.
Effekt av hemming av EZH2, G9a og HDAC på apoptose i Calu-1-celler
Det er kjent at inhibering av HDAC av TSA, induserer cellesyklus og apoptose i ulike kreftceller som gliom, blærekreft, leukemiceller og SCLC [23], [24]. Dessuten, i menneskelige bronchoepithelial celler, transfeksjon av G9a og EZH2 av sirnas indusert apoptose og G1 arrest, henholdsvis [25]. Våre siste resultatene viste at ektopisk uttrykk for MIR-212 sensitizes Calu-1 celler til TRAIL-indusert apoptose [12]. Vi bekreftet derfor hvorvidt inhiberingen av EZH2, G9a og HDAC-enzymer kan øke følsomheten av TRAIL Calu-1-celler. Til dette formål, ble Calu-1-celler behandlet med BIX01294 og TSA å inhibere G9a og HDAC-enzymer, og apoptose ble bestemt ved western blot analyse av caspase-8-aktivering ved TRAIL behandling. Som rapportert i figur 6A, er caspase-8 tydelig aktivert i nærvær av G9a eller HDAC-inhibering. Videre caspase-8 aktivering ytterligere økninger i nærvær av både enzymer inhibering, tilstand som korrelerer med oppregulering av MIR-212 (sammenlign figur 6A med figur 4E). For det samme formål ble apoptoseinduksjon evaluert ved å hemme EZH2 og HDAC-enzymer av siEZH2 og TSA. Til forskjell fra de resultater som ble oppnådd ovenfor, ble caspase-8 aktivert bare i nærvær av HDAC-inhibitor og ikke i nærvær av EZH2 knock-down (figur 6B). For ytterligere å bekrefte disse resultater vi har utført Annexin V apoptose-analysen (figur S1)
(A) Calu-1-celler ble behandlet i fravær. (-) Eller i nærvær (+) av 100 ng /ml og TSA /eller 10 uM av BIX, som tidligere beskrevet, deretter ble cellene inkubert med 1 ng /ml Super-Killer TRAIL i 3 timer. Lysater ble analysert ved western blotting med anti-kaspase-8 antistoff. Spalting av caspase-8 ble mer tydelig i Calu-1-celler som ble behandlet i nærvær av begge inhibitorer. (B) Calu-1-celler ble transfektert med siEZH2 og behandlet i fravær eller i nærvær av 100 ng /ml TSA, som tidligere beskrevet, deretter ble cellene inkubert med 1 ng /ml TRAIL. β-actin antistoff ble brukt som lasting kontroll.
Diskusjoner
microRNAs er små ikke-kodende RNA-molekyler som fungerer som endogene posttranskripsjonelt lyddempere av målgener og er viktige regulatorer av forskjellige celle prosesser, inkludert apoptose [26], [27]. Defekter i den apoptotiske programmet kan bidra til behandling motstand og tumorprogresjon, og kan være forårsaket av deregulerte ekspresjon av anti-apoptotiske molekyler. Antallet oppdaget microRNAs og deres mål vokse raskt indikerer deres avgjørende rolle i å opprettholde genuttrykk profil. Vi har nylig demonstrert for første gang pro-apoptotiske rollen MIR-212 i lungekreft. Vi fant spesielt at MIR-212 var i stand til å målrette den anti-apoptotiske proteiner PED oppregulert i lungekreft [28] tyder på at handlingen kan bidra til tumor undertrykkelse siden det negativt hemmer et molekyl som er involvert i apoptose motstand [12]. Videre analyserer menneskelig vev eksemplarer av normal og lungekreft vi funnet at oppregulering av PED protein i lungekreft vev ble korrelert med MIR-212 taushet
in vitro
med apoptose motstand. Ikke desto mindre er forholdet mellom MIR-212 lyddemping med progresjon og alvorlighetsgraden av sykdommen var fremdeles ukjent. For dette formål ved hjelp av vevsprøver fra NSCLC-berørte pasienter i T1-T2-T3 og T4 regi, har vi funnet at i T1 /T2 ekspresjonen av MIR-212 var heterogene, mens i T3 /T4 alle analyserte prøvene viste speil 212 downregulation. Disse resultater antyder at stanse av MIR-212 i lungekreft er nært knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen. Men de molekylære mekanismene som er involvert i MIR-212 stanse i lungekreft er fortsatt ukjent, og dette var fokus for vår studie.
Flere studier har analysert uttrykket av MIR-212 i ulike celletyper for å bestemme dets rolle i vev-spesifikk fysiologi. MIR-212-ekspresjonsnivåer ble funnet høyere i forhjernen regioner av den voksne rottehjernen [29] sterkt nedregulert i vev av fostre med anencephaly [30] og, i forbindelse med MIR-132, høyere i hippocampus-neuroner. Dessuten har MIR-212 blitt beskrevet som involvert i normal Dendritt modning hos nyfødte nerveceller i den voksne hippocampus [31].
Til dags dato, noen rapporter viser en involvering av MIR-212 i kreft, men alle av dem indikerer at dette miRNA er deregulert i ulike kreft hos mennesker. Spesielt avtar MIR-212-ekspresjon i begge magekarsinom (GC) celler og i humane primære GC vev tyder på at dens nedregulering kan være knyttet til magekreft gjennom målgener så som metyl-CpG-bindende protein [32]. I bukspyttkjertelen adenokarsinom vev MIR-212 er over-uttrykk og retter seg mot retinoblastom tumor suppressor [33] Ved hjelp av microarray analyse tretten miRNA, inkludert MIR-212, ble funnet betydelig overuttrykt i orale svulster [34]. I tillegg økte ekspresjon av HB-EGF (heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor) som følge av nedregulering av MIR-212 i hode og nakke squamous cell carcinoma (HNSCC) er blitt beskrevet som en mulig mekanisme for cetuximab motstand [35 ].
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP har en bestemt epigenome. I det siste tiåret mange studier har vist at den villfarelse av epigenetiske merker, for eksempel DNA metylering i CpG øyer og kovalente modifikasjoner av histonproteinene involvert i kromatin organisasjon, bidrar betydelig til malign transformasjon. På den annen side er det blitt vist at ekspresjonen av mirnas kan påvirkes av epigenetiske endringer. I blæren svulster ble det funnet at MIR-127 er brakt til taushet av arrangøren metylering og dens uttrykk kan gjenopprettes ved hypomethylating agenter [16]. Lujambio
et al
behandlet flere kreftcellelinjer avledet fra lymphonode metastaser med DNA demethylating agenter og ved hjelp av miRNA uttrykket microarray analyse fant at MIR-148a, MIR-34b /c, og MIR-9 familie viste kreft bestemt CpG island hypermethylation [36]. Tilsvarende i tykktarm kreft celler MIR-124a lyddemping var assosiert med CpG island hypermethylation [17]. Ved hjelp av bioinformatikk programmene vi har funnet en CpG øy i formidler av MIR-212 genet. Avvikende metylering av arrangøren CpG island regionen er et felles epigenetisk mekanisme for transkripsjonen lyddemping. Derfor, målte vi effektene av AZA på den transkripsjonelle regulering av MIR-212 i Calu-1-celler som uttrykker lave nivåer av miRNA. Overraskende, selv om arrangøren element av MIR-212 ligger innenfor et CpG island har vi funnet at Calu-en behandling med spesifikk hemmer for DNA metylase ikke endre uttrykket av MIR-212.
epigenetisk stanse i pattedyrceller er mediert av minst to distinkte histonmodifikasjonene: H3K27 trimethylation og H3K9 dimetylering [37]. Forholdet mellom DNA hypermethylation og disse histonmodifikasjonene er ikke helt forstått. Interessant, Kondo
et al
viste en nylig identifiserte epigenetisk aspekt av genet deregulering i kreftceller [38]. De fant at opp til 5% av genene på CpG microarray ble helt stille i kreftceller ved markert økning i H3K27me3 forbundet med forholdsvis lave nivåer av promotor-DNA-metylering. I tillegg ble det nylig funnet ut at Mir-22 stanse innebærer opphopning av H3K27me3 uavhengig av promoter DNA metylering ved akutt lymfatisk leukemi [39]. Disse data tyder på at H3K27me3 er en alternativ modus av genet Slå i kreft uavhengig av DNA metylering. I samsvar med disse nyere studier vi utført ChIP analyse i lungekreftceller (Calu-1) og i normale humane fibroblaster avledet fra fetal lunge (MRC5) for å undersøke forandringer av histonmodifikasjonene forbundet med transkripsjons- aktive og /eller inaktive kromatin av MIR-212-promoteren region. Som forventet fant vi økende mengder H3K27me3 og H3K9me2 (kovalent modifikasjon involvert i genet Slå) i promoter-regionen i MIR-212 i Calu-en sammenlignet med MRC5 celler og økende mengder H3K9Ac (kovalent modifikasjon involvert i genekspresjon) i promoter region of MIR-212 i forhold til MRC5 Calu-1-celler. Videre fant vi at hemmere av de som er involvert i histonmodifikasjonene, dvs. siEZH2, TSA og BIX01294, enzymer var i stand til å opp-regulere Mir-212 uttrykk i Calu-1 celler. Til sammen disse resultatene tyder på at, selv om DNA hypermethylation ser ut til å være avgjørende for genet stanse, transkripsjons stanse av MIR-212 i NSCLC innebærer H3K27me3 /H3K9Ac eller H3K9me3 /H3K9Ac-forbundet histone modifikasjon uavhengig av promoter DNA metylering.
Vi testet også virkninger på TRAIL-indusert celler død i NSCL av de ulike hemmere.
faktisk våre siste resultatene viste at ektopisk uttrykk for MIR-212 sensitizes Calu-1 celler i Trail-indusert apoptose [12]. Våre data viser at TRAIL følsomhet av Calu-1, bestemt ved western blot-analyse av kaspase 8, og ved FACS-analyse, ble større øket ved inhibering av G9a da det av EZH2. Fraværet av virkningen av siEZH2 på TRAIL følsomhet i Calu-1-celler kan skyldes forskjellige mekanismer. Det er mulig at: (i) 70% reduksjon av EZH2 oppnådd ved behandling med den spesifikke siRNA er ikke tilstrekkelig til å øke TRAIL reaksjon (ii) EZH2 knock-down, foruten MIR-212, kan regulere andre viktige signalmolekyler som er involvert i TRAIL signale (iii) å regulere Trail-signalveien, kan EZH2 må samtidig HDAC hemming som kan modulere uttrykket nivåer av forskjellige molekyler som er involvert i TRAIL respons. Videre studier er nødvendig for å utforske disse forskjellige hypotese.
Som konklusjon, viser denne studie at MIR-212 lyddemping er korrelert med alvorligheten av sykdommen, siden det er vesentlig nedregulert i T3 /T4 staging snarere enn i T1 /T2 iscenesettelse og at lyddemping i lungekreft er knyttet til histonmodifikasjonene heller enn DNA hypermethylation.
Materialer og metoder
Cell kultur
Calu-en (NSCLC) og MRC5 (normale humane fibroblaster avledet fra fetal lunge fibroblast-celler) ble dyrket i DMEM. Media ble supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 U /ml penicillin /streptomycin.
Lungekreftprøver
Totalt 34 Formalin -Fast, parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver som består av både adeno og plateepitelkarsinom ble hentet fra arkivene til Avdeling for patologi, Universitetssykehuset i Kuopio, Finland. Tillatelse til å bruke materialet ble hentet fra nasjonale tilsynsmyndighet for velferd og helse i Finland og studien ble akseptert av den etiske komiteen av Nord-Savo Hospital District, Kuopio, Finland.
RNA ekstraksjon og Real-Time PCR
Cell kultur.
Total RNA (miRNA og mRNA) av Calu-en og MRC5 celler ble hentet ved hjelp miRNeasy mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll.
vevsprøve:
Total RNA (miRNA og mRNA) fra FFPE- vevsprøver ble hentet ved hjelp RecoverAll Total Nucleic Acid isolasjon Kit (Ambion) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkripsjon av total miRNA og mRNA ble utført ved anvendelse av 500 ng (fra cellekultur), eller 50 ng (fra FFPE vevsprøver) av total RNA /prøve ved miScript Reverstranskripsjon Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. Kvantitativ analyse av MIR-212, EZH2, G9a og HDAC ble utført av Realtime PCR hjelp miScript SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Som intern referanse vi brukte RNU5A og GAPDH. EZH2 unntatt (Fw: CCACCATTAATGTGCTGGAA Rv: TTCCTTGGAGGAGTATCCACA) alle primere brukte ble kjøpt fra Qiagen. Reaksjonen for deteksjon av miRNA og mRNA ble utført som tidligere beskrevet [12]. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og dataanalyse ble utført ved hjelp av programvare (Bio-Rad)
DNA Metylering analyse
CpG Island Searcher program (http:. //www.cpgislands.com/) ble brukt for å fastslå at MIR-212 kodende region er innleiret i et CpG øy. DNA-metylering status ble bestemt ved sekvensanalyse av bisulfitt-modifisert genom-DNA som inngår i den tilsvarende CpG øya. Bisulfite behandling induserer kjemisk konvertering av unmethylated cytosin til uracil forlater denaturert cytosin uendret. Genomisk DNA ble modifisert ved hjelp av EZ DNA Metylering Kit (Zymo Research) i henhold til produsentens protokoll. Bisulfitt-behandlede DNA ble anvendt som templat for å forsterke regionen, inkludert MIR-212 transkripsjonsstartsetet på motsatt tråd ved å bruke de følgende primere: 5′-TTTTGGGTGGTATTTGAATTTT-3 «; RV 5»-CCCCTCCTCAATTCCTAAA-3 «. Deretter ble PCR produktene klonet inn p-GEM-T Easy Vector System II (Promega), og åtte uavhengige kloner fra hver prøve ble sekvensert.
Chromatin Immunpresipitasjon analyse
Kromatin Immunoutfellingsunder analysene ble utført ut ved hjelp Lowcell ChIP Kit (Diagenode) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene behandlet med 1% formaldehyd, et kryssbindingsmiddel, i 10 min. Deretter kromatin ble skåret med en Bioruptor (Diagenode) til en gjennomsnittlig lengde på 0,4-0,8 kb. Skåret kromatin ble immunopresipitert i 16 timer ved 4 ° C ved anvendelse av følgende antistoffer: anti-thrimethyl-K4 histon H3, anti-thrimethyl-K27 histon H3, anti-dimetyl-K9 histon H3 og anti-acetyl-K9 histon H3 (Diagenode) . I tillegg er 1/100 av oppløsningen oppsamlet før tilsetning av antistoff ble anvendt som en intern kontroll for mengden av påsatt DNA. Real-Time PCR ble utført i 25 ul som inneholder 5 mL av immuno DNA, 12,5 mL SYBR grønn PCR Master Mix (Qiagen) og 150 nM av spesifikke primere (FW 5′-GGAGTCCAGCTTCCTCTCCT-3 «; RV 5»-GCTCCTGGGGGTCTTCAC) . PCR-protokollen innebar 10 min ved 95 ° C og 40 sykluser med 15 sek ved 94 ° C og 1 min ved 60 ° C. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og dataanalyse ble utført ved hjelp av programvare (Bio-Rad).
Små interfering RNA Transfeksjon
siRNA duplex for negativ kontroll og EZH2 mRNA (Dharmacon) ble transient transfektert i 48 timer i Calu-1-celler ved anvendelse av lipofektamin 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble uttrykket verdier av EZH2 og MIR-212 nivåer evaluert av Real-Time PCR og Western blot analyse. Forsøk ble utført i tre eksemplarer for hvert datapunkt.
Protein isolasjon og Western-blotting
Cellene ble vasket to ganger i iskald PBS og lysert i JS-buffer (50 mM HEPES pH 7,5 inneholdende 150 mM NaCl, 1% glycerol, 1% Triton x 100, 1,5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, og 1 x protease-inhibitor cocktail). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analyse (Biorad) under anvendelse av bovint serumalbumin som standard, og like mengder av proteiner ble analysert ved SDS-PAGE (12,5% akrylamid). Geler ble elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA).
