Abstract
Helicobacter pylori plakater (HP) er en bakterie som koloniserer den menneskelige magen og kan etablere en langsiktig infeksjon i mageslimhinnen. Vedvarende Hp infeksjon induserer ofte gastritt og er assosiert med utvikling av mavesår, atrofisk gastritt, og adenokarsinom i ventrikkel. Virulente HP isolerer havn CAG (cytotoxin knyttet gener) patogenitet øya (cagPAI), en 40 kb strekning av DNA som koder for komponenter av en type IV sekresjon system (T4SS). Dette T4SS danner en pilus for injeksjon av virulensfaktorer inn i verts målceller, slik som CagA oncoprotein. Vi analyserte den genetiske variasjonen i
CagA Hotell og andre utvalgte gener fra HP cagPAI (
cagC
,
Cage
,
cagL
,
cagT
,
cagV Hotell og
CAG Gamma
) ved hjelp av DNA ekstrahert fra frosne mage biopsier eller fra kliniske isolater. Forsøkspersonene var 95 CagA + pasienter som ble histologisk diagnostisert med kronisk gastritt eller magekreft i Venezuela og Mexico, områder med høy forekomst av Hp-infeksjon. Sekvenseringsreaksjoner ble utført av både Sanger og neste generasjons pyrosekvensering (454 Roche) metoder. Vi har funnet en total av 381 varianter med entydige samtaler observert i minst 10% av de opprinnelig testede prøver og referansestammer. Vi sammenlignet Frekvensen av disse genetiske varianter mellom magekreft og kronisk gastritt tilfeller. Tjueseks SNPs (11 ikke-synonyme og 14 synonymt) viste statistisk signifikante forskjeller (P 0,05), og to SNPs, i posisjon 1039 og 1041 av
Cage
, viste en svært signifikant sammenheng med kreft (p verdi = 2,07 × 10
-6), og den varianten kodon lå i VirB3 homologi domene
Agrobacterium
. Resultatene av denne studien kan gi foreløpige opplysninger for å målrette antibiotikabehandling til høy-risiko individer, hvis effektene av disse variantene er bekreftet i nærmere undersøkelser
Citation. Rizzato C, Torres J, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S, Camorlinga-Ponce M, et al. (2012) Variasjoner i Helicobacter pylori cytotoxin knyttet gener og deres innflytelse i Progresjon til Gastric Cancer: Konsekvenser for forebygging. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10,1371 /journal.pone.0029605
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 6 oktober 2011; Godkjent: 01.12.2011; Publisert: 03.01.2012
Copyright: © 2012 Rizzato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. JT er en mottaker av en Eksklusivitet stipend fra Fundacion IMSS, Mexico. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Helicobacter pylori plakater (HP) er en av de vanligste kroniske bakterielle infeksjoner hos mennesker. Det har blitt anslått at mer enn halvparten av den voksne befolkningen i verden er infisert med denne organismen [1]. Blant disse er ca 10-15% av de smittede personer anslås å oppleve klinisk uønskede følgetilstander, inkludert magesår, adenokarsinom i ventrikkel og mage lymfom slimhinne-assosiert lymfoid vev (MALT) [2]. Til dags dato, til tross for omfattende innsats over hele verden, det som bestemmer disse variable kliniske utfall har ikke fullstendig klarlagt, men antas å være kombinasjoner av miljø (f.eks, røyking og kosthold) [3], vert genetikk og HP virulensfaktorer [3], [4 ], [5]. Arbeid med oss [6] og andre støtter at bakterielle faktorer vil kunne spille den mest avgjørende rolle [7], [8].
Det beste kjennetegnet HP virulens markør er cytotoxin-assosierte genet patogenitet øya (cagPAI ), et 40 kb område av kromosomalt DNA som koder for omtrent 31 gener som danner en type IV sekresjon system (T4SS) til translocate bakterielle produkter i vertscellen.
CagA
ligger innenfor cagPAI og er ansvarlig for de fleste av HP-assosierte ondartede fenotyper: det utløser IL-8 sekresjon grunning en inflammatorisk respons, fremmer cellevekst, spredning og migrasjon enten gjennom fosforylering-avhengige og uavhengige mekanismer [ ,,,0],9], [10]. Den cagPAI er til stede i omtrent 95% av østasiatisk isolerer og det er sjeldnere i isolater fra lavrisiko vestlige land [11], [12], [13].
Mange av CagA funksjoner bor i en C-terminale dobbelt arrangerte repeterende motiv som inneholder aminosyrene Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (Epiya motiver A, B, C og D). Stammer som bærer flere kopier av vestlige type Epiya-C eller østlige typen Epiya-D er foreslått å være mer forbundet med magekreft og med økt CagA
in vitro
aktivitet [14], selv om dette er kontroversielt [15] . Til dags dato, til tross for den kjente variabilitet i den N-terminale
CagA
genet og andre cagPAI øya gener, har det vært svært begrenset informasjon om kliniske relevansen av genetiske varianter utenfor EPIYAs. Derfor, i denne artikkelen forsøker vi å identifisere varianter i cagPAI genene
cagC product: (
HP0546
),
Cage product: (
HP0544
),
cagL product: (
HP0539
),
cagV product: (
HP0530
),
cagT product: (
HP0533
), og
CAG Gamma product: (
HP0523
) gener, som har blitt utpekt som viktige funksjonskomponentene i modellen bakteriell T4SS, og er kjent for å være avgjørende for cagPAI trans funksjon eller nåværende ekstracellulært, noe som tyder på en mulig interaksjon med vertsceller; og i
CagA, etter som Epiya regionen har vært konsekvent vist seg å korrelere med klinisk utfall (magekreft) [16].
CagA
status alene er ikke tilstrekkelig til å forutsi kliniske resultater. Dessuten er det indikasjoner på at HP utrydding reduserer magekreftforekomst bare hos personer uten forstadier til kreft. Resultatene av denne studien kan gi verdifull informasjon for å målrette antibiotikabehandling til høyrisikopersoner, hvis effektene av disse variantene er bekreftet i videre undersøkelser.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle deltakerne undertegnet et informert skriftlig samtykke. Studien ble godkjent av de etiske gjennomgang styrene i institusjonene som er ansvarlige for faget rekruttering i hver av rekrutteringssentre.
For meksikanske prøvene, ble studien godkjent av etiske komiteer i Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) og General Hospital i Secretaria de Salud (SS), Mexico City, Mexico.
for venezuelanske prøver, etisk klaring for studien ble innhentet fra International Agency for Research on Cancer (IARC) etisk komité i Lyon, Frankrike, og Kreft Control Center i San Cristobal, Venezuela.
studiepopulasjonen
Venezuela.
Vi brukte 11 DNA-prøver fra mage biopsier fra fagene berørt med kronisk gastritt uten atrofi rekruttert i et chemoprevention rettssak i Venezuela [17], [18]. Forsøkspersonene (alder 35-69) i denne studien ble rekruttert fra deltakerne i Gastric Cancer kontrollprogrammet for Tachira staten, som var basert på en gastric dobbel kontrast X-ray etterfulgt av en gastroscopic undersøkelse. Individer med noen kreft inkludert magekreft, eller med andre alvorlige sykdommer som hjerte, lunge, nyre eller leversvikt og gravide kvinner var ikke kvalifisert. Syv mage biopsier ble tatt fra forhåndsdefinerte områder, fem for histologisk evaluering og to ble frosset for
H pylori
DNA eller kultur. Expert patologer i neoplastiske lesjoner i magen lese histologiske lysbilder.
Mexico.
84 prøver var fra pasienter som deltar på Gastroenterology Unit av México General Hospital (Secretaría de Salud) og Oncology Hospital ( Instituto Mexicano del Seguro Social), begge sykehusene i Mexico City. Trettifem pasienter ble berørt med kronisk gastritt og 49 med magekreft. Pasientene var eldre enn 30 år, konsultert på grunn av gastroduodenalsår symptomer (General Hospital) eller på grunn av en sannsynlig magekreft (Oncology sykehus), og ble programmert for endoskopi og biopsi for diagnostiske formål. Temaer som tidligere hadde fått kreftbehandling, var på antibiotika, anti-HP terapi eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler to uker før undersøkelsen, eller hadde andre alvorlige kroniske sykdommer ble ekskludert. Gastriske biopsiprøver ble plassert i steril 0,9% saltoppløsning, homogenisert, og inokulert på blodagar base (BBL, MD)-skåler supplementert med 5% saueblod på HP-kultur. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 9% CO
2 atmosfære i opp til 5 dager. HP ble identifisert ved kolonihybridisering og mikroskopisk morfologi og ved positiv oksidase, katalase, og urease-tester. Fra hver primær vekst, ble 7 til 10 enkeltkolonier hver isolert fra antrum og corpus og propagert på blod-agar-medium. For denne studien analyserte vi 43 prøver fra kulturstammer og 41 direkte fra frosne biopsier.
De viktigste kjennetegn ved befolkningen er beskrevet i tabell 1.
DNA-ekstraksjon
for venezuelanske og meksikanske biopsiprøver DNA ble ekstrahert fra frosne vev ved hjelp QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. For dyrkede stammer DNA ble renset ved hjelp av guanidintiocyanat-EDTA-Sarkosyl (GES) metoden [19].
Primer design
Vi brukte justeringer av HP sekvenser fra offentlige databaser for å identifisere sekvenser som er egnet for utformingen av PCR primere. Vi begrenset våre søk i databaser til vestlige stammer av HP, som er mer sannsynlig å være lik de stammene som finnes i våre studieprøver. Vi har utformet flis amplikonene varierer i størrelse 312-876 bp. Den gjennomsnittlige størrelsen på sekvens lyder med 454 sekvenseringsteknologi er 450 bp, således forover og bakover leser leser overlapping i det minste delvis, for derved å forbedre påliteligheten av produksjonen. Fem av
CagA
amplimers brukt tidligere har blitt publisert [20], [21]. Alle primere som brukes for
CagA
,
cagC, bur, cagL, cagV, cagT Hotell og
CAG gamma
ble først testet i PCR reaksjoner på et lite antall studieprøver ( n = 16), og de forsterkede regionene ble sekvensert med Sanger-teknologi på de samme prøver for å bekrefte spesifisiteten til forsterkning (se tabell supplerende S1 for primersekvenser og PCR-amplifisering forhold).
videre har vi anvendt, som referanse, tre stammer 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) og G27 (NC_0011333) hvis genomer har blitt fullstendig sekvensert [22], [23], [24].
454 sekvense
Når PCR betingelser ble optimalisert, resyntetisert vi de samme primere som brukes for PCR med multipleks tags (som brukes til å identifisere sekvenser fra hvert enkelt prøve) og adaptere, og forsterket målet regioner som bruker DNA fra prøvene. En andre PCR ble utført ved bruk av de merkede primere, for å øke mengden av materiale. Alle PCR amplimers ble så renset, kvantifisert spektrofotometrisk, og samles i ekvimolare mengder.
Bibliotek generasjon for 454 FLX sekvensering ble utført ved hjelp av produsentens standardprotokoller (454 biovitenskap Corporation, Branford, CT, USA). Kort sagt, ble produsentens adaptere som kreves for prosessering og sekvensering lagt til endene av hver pool av merket PCR produkter ved ligering. Enkle molekyler av PCR-produktene som bærer de riktige adaptere ble hybridisert til de enkelte perler, klonalt forsterket i en etterfølgende PCR-emulsjon, og hvert basseng fylt på en 1/16 av en picotiterplate for sekvensering ved hjelp av GS 454 FLX Titanium teknologi. Etter behandling og basen ringer ved hjelp av produsentens egenutviklede programvare (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA, programvareversjon 2.0.00 oktober 2008) den resulterende leser ble sortert i henhold til de forhånds innlemmet seks basis koder. Genomisk sekvens analyse av 454-teknologien ble utført for disse HP isolater med 200 ganger gjennomsnittlig dekning (minimum 59x, maksimum 580x). De resulterende contigs ble satt sammen ved hjelp av gensekvensen av HP belastning 26695 [23] som et stillas. Vi har ikke observert betydelige forskjeller i kvaliteten på produksjonen mellom DNA fra kultivert belastning og DNA fra biopsier. For å vurdere kvalitetskontroll av dataene, sammenlignet vi 454 sekvenseringsdata for referanse stamme 26695 og den publiserte sekvens i NCBI-databasen (NC_000915); konkordans var over 99%. Vi har også sekvensert 9 venezuelanske prøver med den tradisjonelle Sanger-sekvenseringsmetode, observerer en konkordans . 99% mellom metoder
Sanger-sekvense
CagA
N-terminal (630bp ), C-terminal (posisjon 2670-3100) og Epiya motiver regionen så vel som
cagL
genet ble sekvensert ved Sanger-metoden. De sekvenseringsreaksjoner ble utført ved anvendelse BigDyeR Terminator Cycle Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) under termiske betingelser som følger: 96 ° C i 2 minutter, og deretter 27 sykluser ved 96 ° C i 30 s, 54 ° C etter 10 s og 60 ° C i 4 min. Reaksjonsproduktene ble utfelt med 2-propanol, vasket med 75% etanol, fortynnet i 25 ul vann og påsatt på en ABI prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Primære sekvense data ble analysert ved hjelp av en sekvenseanalyseprogram (Applied Biosystems).
bioinformatiske og statistiske metoder
Rå sekvenser ble automatisk analysert med 454 programvare, og kvalitetspoeng ble tildelt. Den resulterende sekvense utgang, både fra 454 i SFF-format og Sanger i ABI-format, ble analysert med multippel sekvenssammenstilling programvare (f.eks Geneious programvareplattform: https://www.geneious.com/), som samlet hele leser tilhører samme prøve, så sekvenser av alle prøvene ble justert til en referansesekvens og enkeltnukleotidpolymorfi så vel som små innsettinger og delesjoner ble identifisert. For å unngå potensielle gjenstander fra sekvensering og for å begrense varianter med klinisk og statistisk meningsfulle frekvenser, valgte vi varianter med entydige samtaler observert i minst 10% for synonymt (N = 175) og 20% for nonsynonymous (N = 206) varianter av opprinnelig testede prøver og referansestammer (Totalt 381).
SAS versjon 9.2 ble anvendt for å estimere logit odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (CI) for magekreft knyttet til hver variant, så vel som for å beregne p -verdier for forskjeller i variant frekvenser mellom magekreft og gastritt ved Fishers eksakte test (2-sidig). Bonferronikorreksjon ble brukt til å beregne p-verdier justert for multiple sammenligninger ved å dele rå p-verdier med 381.
Genetisk variasjon i syv HP cagPAI gener
En oppsummering av den genetiske variasjonen oppdaget i syv gener er rapportert i tabell 2. som forventet, ble det observert en høy grad av variabilitet (beregnet som antall steder som viser en variant av den totale av områder i et gen), både på DNA og aminosyre-nivå. Nucleotide variasjon varierte fra 8,03% i
cagV
til 23,92% i
cagC
, mens aminosyren variasjon interessant varierte fra 5,69% i
cagT
, viser den minste grad variasjon, til 31,01% i
CagA
.
Vi har sammenlignet frekvensene av 381 utvalgte genetiske varianter mellom magekreft og kronisk gastritt tilfeller. Vi så bestemt ikke-synonyme (tabell 3) og synonyme (tabell 4) varianter som viste betydelige forskjeller mellom gastritt og krefttilfeller, møte en av følgende kriterier, (1) absolutt variant frekvens skilte seg minst 25% mellom gastritt og kreftgrupper ; (2) variant frekvens i magekreft minst dobbelt så høy som i gastritt og (3) variant frekvens i gastritt minst dobbelt så høy som i magekreft. Tjuefem SNPs (11 ikke-synonyme og 14 synonymt) nådde statistisk signifikante forskjeller (p 0,05, figur 1), som ligger i
CagA
,
Cage
,
caggamma
og
cagL
, mens ingen ble plassert i
cagC
,
cagT
eller
cagV
. Vi deretter brukt en studie messig terskel på p = 1,31 × 10
-4 (0,05 /381) justert for multiple sammenligninger, og bare to SNPs, i posisjon 1039 og 1041 i
Cage
, viste en p-verdi lavere enn denne grensen. En SNP i
Cage
genet (posisjon 1905) viser en p verdi på 2,55 × 10
-4 svært nær studie-messig statistisk signifikans.
Fargekoden er som følger : SNPs i grønt er synonymt varianter, SNPs i blått er ikke synonymt varianter og SNPs i rødt er de med sterk statistisk signifikans (studie-messig terskelen til P = 1,31 × 10
-4)
CagA
polymorfismer og Epiya typer
den C-terminale regionen (posisjonene 2670 til 3100) var svært variabel i de kliniske isolater i henhold til mønsteret av Epiya motiver (figur 2). Vi observerte 524 polymorfe områder som vi analysert 148 valgt til kriteriene beskrevet tidligere (komplett katalog av
CagA
SNPs er vist i supplerende fil S1). Interessant, to SNP’er viser en annen gjentakelse mellom gastritt og kreft tilfeller med p 0,05, selv om de ikke ble betraktet som statistisk signifikant på grunn av det store antall tester; Den ene er en ikke-synonyme SNPs (A2033G bestemme en aminosyre forandring T /A, se tabell 3) og ett synonymt SNPs (A2547G, se tabell 4).
Analysen av Epiya regionen bekreftet at alle sekvenser var av den vestlige typen CagA, dvs. ABC (82%), ABCC (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) og ABCCC (1%). Vi observerte ikke en annen fordeling av disse CagA typer mellom kreft og gastritt tilfeller (p = 0,2342), er detaljerte resultater vist i tabell 5 og figur 2. Vi observerte 3 varianter av Epiya motiv: en gastritt prøven hadde EPIYV i en en motiv, 50% av B motiver viste EPIYT variant (ikke statistisk forskjellig fordeling i kreft og gastritt tilfellet) og en C motiv av en kreft saken viste en EPLYA variant.
Resultater i den andre
CAG
PAI gener
Genetisk variasjon av
cagC Cage
,
cagT, cagV Hotell og
CAG Gamma
ble vurdert av 454 sekvensering og av c
AGL
av Sanger-sekvensering. Den komplette katalog av polymorfismer observert i disse sju gener er vist i supplerende fil S1.
I
cagC
gen oppdaget vi 83 SNPs, 25 av disse ble valgt som beskrevet ovenfor. Ingen av disse SNPs viste en differensial fordeling mellom gastritt og krefttilfeller.
I
Cage
gen vi har katalogisert 308 polymorfe nettsteder, 97 av disse polymorfismer ble analysert. C1039T og T1041G viste en statistisk signifikant forskjellig tilbakefall mellom gastritt og krefttilfeller med p = 9,97 × 10
-6. Videre en annen SNP T1905C viste en annen gjentakelse med en p-verdi på 2,55 × 10
-4, som er svært nær til studiet messig terskel. Ni andre SNPs viser en annen gjentakelse mellom gastritt og krefttilfeller med p 0,05, seks synonymt polymorfismer (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A og A2286G) og 3 ikke-synonyme varianter: A76C (aminoacidic endring fra lysin til glutamin), T1853C (aminoacidic endring fra valin til alanin) og A2032G (aminoacidic endring fra asparagin til asparaginsyre).
C1039T variant, når analysert som én endring, spår en aminosyre endring av lysin til phenilalanine (kodon endring av CTT til TTT), mens SNP T1041G ligger ved den tredje posisjonen av den samme kodon og hvis analysert som enkelt endring det forutsies et synonymt variant (kodon endre CTT CTG til). Men i alle prøvene som vi har analysert de to variant alleler ble observert sammen, derfor har vi observert kun to variant kodoner (CTT) og TTG som koder for den samme aminosyre, lysin. Den T1905C polymorfisme er en synonymt variant på tredjeplassen på GTT kodon (variant kodon GTC), som koder for valin.
I
cagL
genet observerte vi 74 polymorfismer og 24 av disse ble analysert, 4 viste en differensial fordeling mellom tilfeller av kreft og gastritt (P 0,05). To av dem var ikke synonymt: G166A (aminoacidic endring av alanin til treonin) og A172G (aminoacidic endring av asparagin til asparaginsyre) og to synonymt. (A228G og C516T)
I
cagT
genet analyserte vi 23 av de 81 polymorfismer observert, mens i
cagV
genet vi analyserte 11 av de 61 polymorfismer, og i begge genene ingen av polymorfisme viste en differensial fordeling mellom gastritt og krefttilfeller.
i
CAG Gamma
genet observerte vi 111 polymorfismer, 53 av disse ble videre analysert og fire synonymt (A195TorC, T207A, C264T og A468G) og fem ikke-synonyme (A38G, C47G, A200 /201T, A367C og G457A) viste en p. 0,05 for differensial fordeling mellom gastritt og krefttilfeller (figur 1)
Diskusjoner
Siden den ble oppdaget i 1996 [25], den cagPAI, som havner i virulens gener HP, har trolig vært den mest intensivt studert en del av HP genomet. Den type IV sekresjon system koder for proteiner som danner en nål-lignende struktur som forbinder HP til cytoplasma i epiteliale gastrisk cellen for å injisere den onkogene CagA protein og peptidoglykaner. Komponenter i denne struktur omfatter a) pilus komponenter, CagC (homolog av
Agrobacterium tumefaciens
VirB2) som danner den viktigste ekstracellulære struktur, hvortil tuppen CagL er festet til samvirke med β-1 integrin; b) kjernen komplekse proteiner, CagW (VirB6), CagT (VirB7), CagV (VirB8), CagX (VirB9) og CagY (VirB10) som danner den indre kjerne av pilus; c) energiske faktorer Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) og bur (VirB3 /VirB4), ATPaser leverer energi for at systemet skal fungere [26]. I denne studien har vi sekvensert
cagC product: (
HP0546
),
cagL product: (
HP0539
) fra pilus,
cagV
(
HP0530
),
cagT product: (
HP0533
), og
CAG Gamma product: (
HP0523
) fra kjernen komplekse, og
Cage product: (
HP0544
) fra energiforsynings enzymer fra HP stammer isolert fra gastritt og mage kreftpasienter. Disse genene ble valgt fordi deres produkter er kjent for å være essensiell for T4SS funksjon og noen er presentert ekstracellulært av
H. pylori plakater (CagA, CagL, CagC), noe som tyder på mulige interaksjoner med vertscellen [27].
Vi fant den minste variasjon, både på nukleotid og aminosyre-nivå, i indre kjernen T4SS komponenter (CagT , CagV, og bur, 5,7%, 5,9% og 5,9% aminosyre-variant, henholdsvis), og den største variasjon i de eksponerte deler: integrin-bindende protein CagL, ekstracellulære pilus hovedkomponent CagC og utskilt protein CagA (12,2%, 23,5% og 31%, aminosyre-variant, henholdsvis). Disse resultatene understøtter den genetiske variasjon i cagPAI komponenter er hovedsakelig påvirket av deres lokalisering i T4SS, med større variasjon i proteiner eksponert i den bakterielle overflate, kanskje som en respons på immunologisk trykk. Interessant, Cag Gamma var et unntak (19,5% aminosyre-variant), dette proteinet har blitt foreslått for å ligge innenfor den HP periplasmaet, hvor den fungerer som en peptidoglykan hydrolase, gjennomhulling av HP ytre membranen og dermed bidra til å eksponere T4SS pilus til det eksterne mediet [28]. Det er mulig at Cag Gamma oppfyller denne funksjon også som en strukturell komponent av den eksponerte pilus, hvor det kan også fungere over vertscellemembran.
Studies fra Afrika [21], Italia [14], USA [ ,,,0],8] og Brasil [29] har antydet en sammenheng mellom økt antall Epiya C motiver og HP tilhørende sykdommer. Videre Sicinschi et al. [30] observerte en sammenheng mellom økte Epiya C segmenter og tilstedeværelsen av mage forstadier til kreft. I kontrast til studier i Colombia [8], [31], Mexico (J. Torres, personlig kommunikasjon), og Korea [32] har ikke funnet en slik sammenheng. I vår studie, over 80% av alle prøver fra Mexico og Venezuela var av typen ABC, og ingen forbindelse var tydelig mellom magekreft progresjon og høyere antall Epiya C motiver. Videre har nylige studier [15] har vist viktigheten av punkt variasjoner i Epiya B motiv for aktivitet på epitelceller, observerte vi fire ikke synonyme variasjoner i dette motiv, men disse polymorfismene viste ingen assosiasjon med magekreft.
Nyere studier har rapportert viktige proinflammatoriske og pro-onkogene aktiviteter CagA som er uavhengige av Epiya motiver og som kan være like viktig for sykdom [30]; disse funnene kan forklare mangelen på sammenslutning av C motiver med kreft som presenteres her og i tidligere studier. C-terminalen til CagA protein inneholder også den C-MET-motivet som er blitt foreslått å ha flere funksjoner: mediere CagA multimerization og membran målretting [33], [34], interagere med kinase Par1b /Mark2 [35], og alle disse aktivitetene er CagA-fosforylering uavhengig [36]. Men i vår studie fant vi ikke signifikante forskjeller mellom gastritt og magekreft, enten i rekkefølge eller i antall multimerization motiver.
C-terminal og N-terminale områder i CagA er både nødvendig for å utnytte den fulle aktivitet av proteinet, selv om de har forskjellige funksjoner. Nylig har det blitt vist at N-terminus av CagA samvirker med tumor suppressor apoptose-stimulerende proteiner av p53 (ASPP2) [37].
Tilstedeværelsen av alle disse interaksjoner mellom CagA og bakterielle og humane proteiner foreslår at kan det være meget vanskelig for bakterien å opprettholde et bredt spekter av biologisk aktivitet i nærvær av høye nivå av mutasjoner, hvorav de fleste antagelig føre til tap eller dempning av funksjon.
Selv
CagA
er den mest etablerte cagPAI virulens markør,
CagA
status alene er ikke tilstrekkelig til å forutsi klinisk utfall hos høyrisikogrupper der flertallet av HP er
CagA
-positive stammer. I denne sammenheng til identifisering av nye HP-molekylær virulens markører forutsi magekreft risiko vil være svært viktig. Framskritt i genotyping metode gjør oss i stand til å bruke DNA fra mage biopsier å studere HP sekvens microvariabilities, som har vært nesten utelukkende studert i dyrkede stammer. Genotyping av et høyere antall av mageprøver tillater oss å utvide cagPAI genetisk variant deteksjon til andre potensielt viktige T4SS gener. Dette er relevant fordi tidligere studier har fokusert hovedsakelig på
CagA Hotell og nytten av andre cagPAI gener som markører for sykdomsrisiko er neppe studert. Få studier har sett for foreningen av tilstedeværelsen av cagPAI gener og sykdom, og ingen har studert polymorfismer i cagPAI gener, annet enn
CagA.
Cage
er en unik genet som koder for to T4SS komponenter, VirB3 (N-terminale) og B4 (C-terminal) som et fusjonsprotein [38], og B4 er den største ATPase blant flere T4SS komponenter. Den genererer energi for sekresjon prosessen, og dermed er nødvendig for substratet trans [39] og virker sammen med mange andre proteiner, inkludert T4SS VirB2 [40]. Til tross for sin relativt indre lokalisering, og dens sentrale rolle i IL-8 induksjon blitt godt dokumentert [41], [42], [43]. Interessant, observerte vi en sterk sammenheng mellom to SNPs (C1039T og T1041G) av
Cage Hotell og magekreft, et funn ikke rapportert tidligere. Disse SNP’er er i posisjon en og tre av de samme kodon og vi alltid observert disse to variant kodoner (CTT TTG og) som kodifisere for den samme aminosyre, lysin. Denne varianten kodon ligger i homologi domene med VirB3 av
Agrobacterium
. Den nest sterkeste krets ble påvist i en annen synonymt SNP i posisjon 1905, og i dette tilfelle de to mulige kodoner var GTT og GTC, som koder for valin. Det har vært kjent i lang tid at alternative synonyme kodoner er ikke brukes med like frekvenser og mønstre for kodonbruk variere mellom arter [44]. Kodonbruk er mer forspent i gener som blir uttrykt i større mengder [45], [46]. Bruken av optimale kodoner muliggjør mer effektiv bruk av ribosomer og fører til raskere veksthastighet [47]. Selv om genomet av HP er blitt rapportert å inneholde kodon skjevhet for høyt uttrykte gener [48], Kloster og Tang [49] identifisert en skjevhet i ekspresjonsnivået av gener hvor TTG kodonet er foretrukket over CTT kodonet, så vel som av GTC kodon over GTT. Derfor, basert på disse dataene kan vi spekulere i at forskjellen i kodon bruk kan ha en innvirkning på nivået av uttrykk av et gen med en sterk funksjonell relevans for T4SS sekresjon system som
Cage
.
CagL er en spesialisert pilus protein som binder seg til og aktiverer grin α5β1 reseptor på mage epitelceller først og fremst ved sin arginin-glysin-aspartat (RGD) motivet, guiding riktig plassering av T4SS og som letter translokasjon av CagA [9], [50 ]. CagL aktiverer også vertscelle kinaser fokal adhesjonskinase (FAK) og Src for å sikre CagA fosforylering ved injeksjonsstedet, mens β1 integrin er nødvendig for CagA-induserte vertscelle motilitet og forlengelse [51]. CagL kan også være ansvarlig for HP-indusert hypochlorhydria gjennom aktivering av en disintegrinproteinet og metallprotease 17 og NFkB [52]. Av de to
cagL
SNP’er vi funnet assosiert med magekreft, den A172G SNP (N58D) er i den samme stilling hvor Yeh et al [53] har vist at den samtidige tilstedeværelse av tyrosin i aminosyreposisjon 58 og glutaminsyre i posisjon 59 (Y58E59) sammenlignet med kombinasjonen asparaginsyre (D58) og Lysin (K59), induserer mer effektivt en corpus forskyvning av maveintegrin α5β1 som har vært knyttet til magekreftutvikling. Vi observerte ikke tyrosin (Y) aminosyren i posisjon 58 i hvilken som helst prøve, selv om vi har funnet ut at bærere av asparaginsyre (D) i denne posisjon er i lavere risiko for magekreft i sammenligning med asparagin (N) bærere. Videre observerte vi polymorfisme i aminosyre 59 på lavere frekvens og uten noen forskjell mellom kreft og gastritt prøver.
I tidligere studier [54] sekvensanalyse av
cagGamma
gen viste at det havner en typisk SLT katalytisk domene mellom restene 33 og 165, hvis «ES» og «AVGAY» motiver ble svært konservert blant ortolog enzymer. Vi observerte fem nonsynonymous varianter med en annen fordeling i kreft og gastritt tilfeller. Tre av de som kartet i katalytiske domene, likevel ingen av dem ligger i de mest konserverte deler av domenet.
Selv om denne studien har begrensninger i utvalgsstørrelsen, er det den største til nå i form av
