Abstract
Mangel på tre-dimensjonale (3-D) high-throughput (HT) screeninganalyser utformet å identifisere anti-kreft invasjons narkotika er et stort hinder for å redusere kreftrelatert dødelighet, med sentral utfordring blir analysen standardisering. Presentert er utviklingen av et nytt 3-D invasjon assay med HT potensial som innebærer omgivende celle-kollagen kuler i løpet av kollagen for å skape en 3-D miljøet gjennom hvilke celler kan invadere. Standardisering ble oppnådd ved å utforme en etterbehandles 96-brønners plate for å skape en nøyaktig bestemt sted for celle-kollagen sfærer og ved hjelp av dialdehyd dekstran for å inhibere kollagen sammentrekning, opprettholde ensartet størrelse og form. Dette muliggjør automatisk avlesning for bestemmelse av effekten av hemmende forbindelser på kreftcelle invasjon. Sensitiviteten ble demonstrert ved evnen til å skille mellom forskjellige nivåer av invasivitet av kreftcellelinjer, og robusthet ble bestemt ved å beregne Z-faktor. En Z-faktor på 0,65 ble oppnådd ved å sammenligne effektene av DMSO og anti-β1-integrin antistoff, en hemmende reagens, på invasjonen av Du145 kreftceller, tyder dette nye analysen er egnet for storskala drug discovery. Som bevis på prinsippet ble NCI Diversity forbindelse Bibliotek skjermet mot menneskelige invasive kreftceller. Ni-forbindelser som utviser høy styrke og lav toksisitet ble identifisert, inkludert DX-52-1, en forbindelse som tidligere er rapportert å inhibere cellemigrering, en kritisk bestemmende faktor for kreft invasjon. Resultatene tyder på at dette innovative HT-plattformen er en enkel, presis og lett å gjenskape 3D-invasjonen assay for anti-kreft medisiner
Citation. Evensen NA, Li J Yang J, Yu X, Sampson NS, Zucker S, et al. (2013) Utvikling av en høy gjennomstrømming tredimensjonale Invasion analyse for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE 8 (12): e82811. doi: 10,1371 /journal.pone.0082811
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 12. september 2013, Godkjent: 06.11.2013; Publisert: 11.12.2013
Copyright: © 2013 Evensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av Baldwin Breast Cancer Foundation og National Cancer Institute (1R01CA166936). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er den viktigste dødsårsaken hos kreftpasienter, og en av de mest komplekse biologiske prosesser i menneskelige sykdommer [1]. En stor utfordring i utviklingen av anti-kreft narkotika for å forebygge metastaser er mangelen på effektive verktøy for legemiddelforskning. Drug Discovery programmene har primært fokusert på målet basert screening, noe som har resultert i nye kategorier av farmakologiske stoffer, primært tyrosinkinasehemmere og monoklonale antistoffer [2]. Men siden de fleste typer kreft utvikler mange mutasjoner i løpet av tumorprogresjon [3], enkelte kreftcellekloner ofte omgå hemmende forbindelser fokusert på enkelt målrettede molekyler [4]. Unnlatelse av å kommersialisere mange offentlig finansierte mål baserte legemiddel funn driver behovet for romanen tilnærminger for å fremskynde utvikling av legemidler for metastatisk kreft. Dermed utvikle nye verktøy som kan brukes til å identifisere effektive legemidler rettet mot invasiv fenotype av kreftceller, et krav på et tidlig stadium av metastaser [5], og senere stadium av kreft tilbakefall på grunn av selv-seeding fra mikro /makro- metastasized svulster [6], er avgjørende i å konvertere denne livstruende sykdom til en kronisk ett.
Effektiv målretting av kreft celle invasjon krever en mottagelig teknologi for å etterligne
in vivo
forhold. Monterings bevis har vist at tre-dimensjonal (3-D) matriser for kreftcellekultur nærmere etterligner
in vivo
betingelser sammenlignet med 2-D-celledyrkningsbetingelser. Derfor screening i 3-D dyrkningsforhold gir en høyere prediktiv verdi for fremtidig kliniske effekten av potensielle legemidler og gir bedre optimalisering [7,8]. Current 3-D high-throughput (HT) screeninganalyser fokuserer primært på å identifisere forbindelser som hemmer tumorvekst og spredning [9-15]. Forsøk er blitt gjort for å utvikle 3-D-invasjons analyser med HT evne [16-18]. Imidlertid har bruken av disse analyser for anti-kreft-celle invasjon drug discovery blitt hindret på grunn av den høye prisen for stor-skala screening [16,17], en forutsetning for lang inkubasjonstider (for eksempel 3 til 5 dager inkubasjonsperioder ) for endepunkt leselig bestemmes av lav signal: bakgrunnsforhold [17], tungvinte prosedyrer [16,18,19], og /eller mangel på standardiserte og automatiserte teknikker for å kvantifisere celle invasjon [20].
Heri, tilbyr vi en ny kollagen gel spheroid-baserte 3D-invasjonen HT screening verktøy for å identifisere stoffer som viser anti-invasjons evner. Ved å benytte en innovativt tooled plate, sammen med dialdehyd dekstran blandet med kollagen for å hindre sammentrekning, tillater denne romanen 3-D invasjonen analysen standardisering og automatisert avlesning, som er sentrale krav til HT screening. Vi gir bevis for at vår 3-D invasjon assay er reproduserbar, effektiv, lett og rask å utføre, og følsom nok til å identifisere forbindelser som hemmer kreftcelle invasjon. Potensialet for disse aktive hits til å ha en positiv innvirkning på pasienter med kreft ved å hindre spredning støtter bruken av denne analysen i dagens narkotikaforskning programmer.
Materialer og Metoder
Material
type I kollagen (eddiksyre ekstrahert innfødte type I kollagen fra rotte hale sene) og propidiumjodid (PI) ble kjøpt fra BD Bioscience Discovery laboratorium. Rekombinant tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) og anti-MT1-MMP hemopexin domene antistoff, ble innkjøpt fra Chemicon International, Inc. RNAi-Ready pSIREN Retro-Q vektor for spesifikk genet Slå og pQCXIP retroviral vektor for generering av stabile celler ble kjøpt fra Clontech. Hoechst atom flekken ble kjøpt fra Invitrogen. Den anti-β1 inte antistoff ble kjøpt fra GE Healthcare. Staurosporin, ble paclitaxel, og dekstran (Mw = 500000) som er kjøpt fra Sigma.
Cellelinjer og behandling av celler
Menneske fibrosarkom HT-1080, human prostatakreft LNCaP, Du145, og PC3, human bryst epitelial kreft MDA-MB-231-cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. De LNCaP celler som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) eller MT1-MMP-GFP kimære cDNA ble tidligere beskrevet [21]. Cellene ble holdt i DMEM-høy glukose eller RPMI 1640-medium (Invitrogen) inneholdende 10% FBS og 1% Pen /Strep. SK-3
rd celler og mammosphere dannelse ble tidligere beskrevet [22]. I korthet er disse cellene ble dyrket i ultra-lav feste retter (Corning) i suspensjon med DMEM-F12 (Cellgro) medium tilsatt B27 (01:50, Invitrogen), EGF (20 ng /ml BD Biosciences), 0,4% bovint serum albumin (Sigma), og 4 ug /ml insulin (Sigma) [22].
3-D Cell Spredning analysen
Denne analysen ble utført som tidligere beskrevet [21]. I korte trekk ble enkeltcellesuspensjoner av LNCaP-celler (4×10
4 celler /ml) som uttrykker GFP eller MT1-MMP-GFP blandet med type I kollagen (2,5 mg /ml sluttkonsentrasjon). Celle-kollagen gel kulturer fikk lov til å størkne i 24-brønners plater. Etter størkningen ble fullstendig medium tilsatt med eller uten indikerte inhibitorer. Cell spredning evne ble overvåket under et Nikon mikroskop over 6 dager.
3-D Multi-celle spheroid invasjon analysen
For å generere celleaggregater, SK-3
rd celler (1000 celler /ml) ble dyrket i ultra-lav adhesjon kulturskåler i 12 dager. Sfærer ble deretter overført til 24-brønns skåler inneholdende type I kollagen. De innebygde kuler ble deretter dyrket i 3 dager under normoksiske eller hypoksiske forhold. For hypoksiske forhold, ble cellene inkubert ved hjelp av en BioSpherix ProOx C21 satt til 1% O
2 og 5% CO
2. For multi-celle sfæroide fremgangsmåte som utnytter glass mikrobærerperler, de LNCaP MT1-MMP-GFP uttrykkende celler ble dyrket med glassperler i 24 timer med risting. De celle-perle aggregater ble deretter overført og integrert i type I kollagen og dyrket i ytterligere 3 dager.
3-D Invasion analysen
kreftceller (8×10
7 celler /ml ) ble blandet med et like stort volum av 3 mg /ml nøytralisert type i kollagen på is, etterfulgt av tilsetningen av dialdehyd dekstran-løsning (slutt 0,25% av totalvolum). Den celle-kollagenblanding ble deretter strødd inn i groper i midten av hver brønn av en 96-brønns plate. Den optimale størrelse av gropen i hver brønn er 2 mm i diameter og krever 4,18 mm
3 (il) [4 /3πr³, r = 1 mm] av celle-kollagen blanding for å lage et sfærisk dot i gropen. Etter størkning av celle-kollagen prikker ved 37 ° C, et lag av nøytralisert type I kollagen (80 ul, 1,5 mg /ml sluttkonsentrasjon) ble tilsatt for å dekke celle-kollagen halvkuler. Etter en 10 minutters inkubasjon ved 37 ° C, ble den sammensatte celle invasjon kompleks dekket med 80 ul medium med tilsatt hemmere eller kjøretøy.
Observasjon av invaderte celler
invadert kreft celler ble farget med begge Hoechst 33342 (25 ug /ml) for nukleær farging av totale celler og PI (2,5 ug /ml) for farging av døde celler, etterfulgt av grundig vasking med PBS. Invasjon av kreft celler ble deretter undersøkt ved hjelp av fluorescens mikroskopi. For å automatisere kvantifisering av invaderte celler, ble fasekontrast og Hoechst bilder for hele platen oppnås. En terskel fra fasekontrastrikt bilde av en kontroll (ubehandlet eller behandlet kjøretøy) brønn av 96-brønns plate ble justert basert på forskjellen i kontrast mellom utsiden og innsiden av gropen for å skape to binære lag. Det binære lag utenfor gropen ble kopiert for å danne en region av interesse (ROI), som så ble påført på Hoechst bildene. De invaderte celler i ROI var da automatisk telles ved hjelp av objekt teller. Dette ble gjort ved hjelp av NIS-Elements Br 3,2 Software.
Oksidasjon av Dextran å danne dialdehyd Dextran
2,5 g dekstran ble oppløst i 100 ml DIH
2o. Natriumperjodat (NaIO
4) (1,65 g) ble tilsatt i 18 timer inkubasjon med omrøring ved romtemperatur. For å stanse reaksjonen, ble 1 ml etylenglykol ble tilsatt. Oppløsningen ble dialysert med DIH
2O i 3 dager, lyofilisert og rekonstituert med DIH
2o til en sluttkonsentrasjon på 2,5% dialdehyd dekstran.
Protease Assay
Totalt cellulær proteolytisk aktivitet ble bestemt ved hjelp av en Fluorescent Detection Kit (Sigma). I korthet, ble cellelysater inkubert i 20 timer ved 37 ° C med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket kasein substrat. Lysater ble trikloreddiksyre (TCA) ble utfelt. Supernatanter inneholder fragmentert FITC-kasein ble deretter kombinert med analysebuffer og deres fluorescens intensitet ble målt med eksitasjon ved 485 nm og emisjon ved 535 nm ved hjelp av en SpectraMax Gemini EM (Molecular Devices) fluorescerende plateleser.
Statistiske analyser
Student uparet tosidig t-test ble brukt for å vurdere forskjeller med p-verdier 0,05 ansett som statistisk signifikant. Sammenslåtte data ble presentert som gjennomsnitt ± SD for alle analyser av tre uavhengige eksperimenter. GraphPad Prism 5 programmet ble brukt for denne analysen.
Resultater
Begrensninger av Current Invasion Analyser hindrer HT Screening Capabilities
For tiden brukt 3-D invasjon analyser er basert på overvåking celle spredningsevne og kan monteres på flere måter. Men de alle mangler viktige egenskaper som kreves for HT screening evne. For eksempel kan enkelte analyser ikke skille mellom inhibitorer av celleproliferasjon og invasjon. I disse assays, enkeltceller innleiret i matriser, slik som type I kollagen, blir undersøkt for deres invasive oppførsel basert på deres spredning vekstmønster etter proliferasjon. På figur 1A-a, LNCaP-celler, en mindre invasiv human prostatacancer cellelinje som stabilt uttrykker membrantype, en matriksmetalloproteinase (MT1-MMP) fusjonert med et grønt fluorescerende protein (GFP) (MT1-GFP) viste en spredning vekstmønster, indikerer invasiv oppførsel, sammenlignet med kontrollceller GFP at det i stedet dannes en celle aggregat inne i gelen. Dette er konsistent med tidligere rapporter som viser at MT1-MMP kan indusere invasjon av ikke-aggressive celletyper [23]. Imidlertid er både celle invasjon og proliferasjon som kreves for å danne det spredte vekstmønster, og det er en mangel på standardisering hindre automatisk avlesning. Derfor er dette enkelt celle spredning analysen ikke er egnet for HT anticancer-drug discovery spesielt rettet mot rettet mot kreft invasjon.
A) en. Encellede spredning analysen: Enkel, ble isolerte LNCaP celler blandet med kollagen og undersøkt daglig. MT1-GFP-uttrykkende celler som vises etter hvert en spredning vekstmønster etter 6 dager i kultur sammenlignet med den samlede veksten av GFP-uttrykkende celler. b. Aggregate spredning analysen: SK-3
rd celler ble dyrket i 12 dager for å danne mammospheres, overført og innebygd i kollagen, og deretter dyrket under normoxia eller hypoksi. En spredt mønster ble observert etter 3 dager under hypoksi. c. Mikro perle spredning analysen: MT1-GFP uttrykke LNCaP celler ble dyrket med perler i 24 timer, deretter overført og innebygd i kollagen. Invaderte celler ble sett på som et spredt mønster på dag 3. Scale barer = 20 mikrometer. B) Vurdering av kreftcelle invasivitet ved hjelp av nye 3-D invasjonen assay: LNCaP-celler som uttrykker vektoren kontroll (a) eller MT1-MMP (b), humane prostatakreft PC3-celler (c), og Du145-celler (d) ble suspendert i kollagen , strødd inn i brønnen i en 96-brønn plate og dekket med kollagen fulgt av media. Etter 18-timers inkubering, PC3 og Du145, samt MT1-MMP-uttrykkende LNCaP-celler, viste økt antall invaderte celler sammenlignet med LnCap vektorkontrollceller. Målestokk = 50 um.
For å unngå slike hindringer, multicelle sfæroide metoden [20] ble innført, noe som har vært anerkjent som å ha potensiale til å bli brukt som en HT invasjon assay. Imidlertid, som demonstrert ved bruk av SK-3
rd celler dyrket under hypoksiske betingelser, som er kjent for å øke handel med MT1-MMP til celleoverflaten [22], sfæroide formasjon til endepunkt vurdering av invasjon krever lang kultur tider, vanligvis tar 6 til 12 dager, og mangler ensartethet størrelse (figur 1A-b). For å unngå størrelsesvariasjon, kan glassmikrobærerperler med identiske størrelser benyttes som stillas for sfæroide formasjon [24], som vist i Figur 1 A-c ved hjelp av LNCaP MT1-GFP uttrykkende celler. Imidlertid kan plasseringen av kulene inneholdende celler etter overføring til en matrise ikke bli gjort ensartet. Selv om disse analysene kan brukes til overvåking kreftcelle invasjon, lange kjøretider og mangel på standardisering og automatiserte avlesnings evner hemme deres utnyttelse som HT screening verktøy.
Etablering av en kvantitativ 3-D invasjonen analyse for evaluering Cancer Cell Invasion
som erkjenner behovet for en 3-D HT-analyse som tester invasiv evne av celler med en raskere kjøretid, har vi utviklet en rask kollagen gel basert 3D-invasjonen analysen. For å demonstrere evnen til vår analyse for å påvise forskjeller i invasive kapasitet av forskjellige kreftcelletyper, humane prostatacancercellelinjer med varierende grad av aggressivitet, inkludert androgen uavhengig (Du145 og PC3) og avhengige (LNCAP) cellelinjer, så vel som MT1 -MMP uttrykker LNCaP celler, ble undersøkt. De angitte kreftceller ble kombinert med nøytraliserte naturlig type I kollagen, strødd inn i midten av hver brønn av en 96-brønners plate, og tillates å størkne, til slutt dannelse av en celle-kollagen dot /halvkule med en tydelig grense og form. Etter størkningen ble de celle-kollagen halvkuler innleiret i et dekksjikt av nøytralisert type I kollagen og tillates å størkne. Media ble deretter tilsatt til hver brønn og cellene ble tillatt å invadere inn i den omgivende grunnmasse i 18 timer. Som vist i figur 1B, viste de metastatiske Du145 og PC3-celler økt antall invasive celler som stikker ut utover den opprinnelige celle-kollagen grense, mens LNCaP-celler som uttrykker vektoren kontroll cDNA unnlatt å vise celle invasjon. Videre er effekten av MT1-MMP ekspresjon på celle invasjon ble lett bestemmes ved en økning i antallet av invaderte celler i MT1-MMP uttrykk LNCaP-celler i forhold til vektorkontrollceller (fig 1Ba . B).
For å direkte sammenligne vår nye 3-D invasjon assay for tiden anvendes 3-D-celle spredning assay den hemmende effekten av vevsinhibitor av metalloproteinase-2 (TIMP-2, en endogen inhibitor av MT1- MMP) [25] og det anti PEX-antistoff (rettet mot MT1-MMP hemopexin domene) [26] på MT1-GFP indusert LNCaP celle invasjon ble testet. For de nye 3-D invasjon analysen ble cellene satt opp som beskrevet for figur 1B med tilsetning av enten TIMP-2 eller anti-PEX-antistoff til cellekulturmediet. Kvantifisering av invadert-celler viste 61% og 76% reduksjon av MT1-GFP indusert celle invasjon av TIMP-2 og anti-PEX-antistoff, respektivt (figur 2A). Det 3-D-celle spredning assay, vist i figur 2B, viser kvalitativt inhibering av MT1-GFP-indusert celle invasjon via behandling med enten TIMP-2 eller anti-PEX-antistoff. Denne sammenligningen viser at selv om disse sprednings analysene gir klare, kvalitative data som viser kreftcelle invasjon, er de ikke egnet for HT drug discovery programmer som krever kvantitative resultater, som vår analyse kan gi
A B) Sammenligning av det nye 3-D invasjon assay og 3-D-celle spredning analyse: Virkningen av kontroll IgG (kanin, 10 ug /ml), tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) (10 nM), eller anti-MT1-MMP-hemopexin domene-antistoff (anti-PEX Ab) (10 ug /ml) på MT1-GFP-indusert LNCaP celle invasjon ble evaluert via 3-D-invasjon assay (A) og 3-D-celle spredning assay ( B). En invasiv vekstmønster ble fotografert på dag 1 (A) og dag 6 (B) respektivt. TIMP-2 og anti-PEX Ab redusert celle invasiv /spredende evne MT1-GFP uttrykkende celler. Scale bar = 20 mikrometer. C) Doseavhengig inhibering av human brystcancer MDA-MB-231-celler ved anti-β1-integrin-antistoff: MDA-MB-231-celle invasjon ble undersøkt ved bruk av 3-D invasjon assay i nærvær av anti-β1 integrin-antistoff hos ulike konsentrasjoner vs. kontroll IgG. Invaderte celler ble mikroskopisk undersøkt (venstre panel) og telles (høyre panel). Barer representerer gjennomsnittet + SD.
For å bestemme effektiviteten av vår analyse, ble en dose responstest utført ved anvendelse av MDA-MB-231, en invasiv brystkreft cellelinje, og et anti-β1 integrin antistoff, som er kjent for å hemme cellemigrering, et viktig skritt for kreftcelle invasjon. En doseavhengig inhibering av MDA-MB-231 celle invasjon etter behandling med det anti-integrin-antistoff β1 var lett kvantifisert (figur 2C). Sammen er disse data demonstrere evnen av det nye 3-D-invasjon assay for enkelt, effektivt, og kvantitativt vurdere invasive fenotype av forskjellige kreftceller, så vel som effekten av medikamenter på invasivitet.
Standardisering av de utviklede Invasion analysen
Som vist, de vanligste hindringene i å utvikle 3D-HT skjermer er standardisering og automatisert avlesning. Selv om vår analyse er enkel og rask, størrelse homogenitet og plassering av den celle-kollagen halvkule skape et hinder for disse kriteriene. For å standardisere og gi rom for automatisering, en etterbehandles 96-brønns plate med en grop diameter på 2 mm (4,18 mm
3) i midten av hver brønn ble konstruert (figur 3A). Gropen er av lik størrelse og plassering i hver brønn, tillater standardisering av 3-D invasjonen analysen og automatisert avlesning kontrollert av NIS Elements (Nikon) bildebehandlingsprogrammer sammen med en motorisert stadium.
A) Prinsippskisse (øvre panel) av 3-D invasjon assay med tooled plate: (a) celle-kollagenblanding er stiplet inn i de 2 mm i diameter groper i midten av hver brønn av etterbehandles 96-brønners plate, og skaper sfærer som opptar et volum på 4,18 mm
3; (B) fremspringende celle-kollagen hemisfærer er dekket med kollagen; (C) medium inneholdende forbindelser blir tilsatt og platen blir inkubert i 18 timer; og (d) invaderte celler utenfor pit grensen telles. Svarte prikker representerer celler. Diagram ikke i målestokk. Et bilde av en seksjon av en etterbehandles plate med et hull i midten av hver brønn blir vist (nedre panel). B) Inhibering av kollagen sammentrekning via dialdehyd dekstran: HT1080-celler ble blandet med kollagen med eller uten tilsetning av dialdehydet dekstran før overlegging med kollagen. Fag kontrast ble tatt ved 0 og 18 timer (venstre panel, Scale bar = 250 nm) og 18 timer i etterbehandles plate (høyre panel, Scale bar = 100 nm). Røde piler indikerer kanten av gropene. Røde pilspisser indikert kanten av celle-kollagen kuler. C) Fase kontrast og fluoriserende bilder av invaderte HT1080 celler i etterbehandles plate farget med Hoechst fargestoff. Scale bar = 100 mikrometer. D) Automatisert kvantifisering: Både fasekontrast og fluoriserende bilder (A og B) av HT1080 celler etter invasjonen ble anskaffet ved hjelp av en Nikon TE 2000-tallet som kontrolleres av NIS Elements bildebehandling. En terskel for fasekontrastrikt bilde av den første brønnen ble justert basert på kontrasten for å lage to binære lag, en inne i pit (markert med svart) og en utenfor pit (uthevet i rosa) (c). Det binære lag utenfor gropen (rosa område) ble kopiert for å danne en region av interesse (ROI), som så ble brukt til Hoechst bilde (d). De invaderte celler i ROI ble da automatisk regnet med telte celler vises lilla i fargen (e).
En vanlig begrensning av bruken av et kollagenbasert gel for 3-D cellekultur er sammentrekning på grunn av ombygging av kollagen fibriller ved hjelp av forskjellige celletyper [27,28] som endrer den totale størrelsen celle-kollagen-gel. For å demonstrere dette ble HT1080 human fibrosarkom celle-kollagen halvkuler avbildes ved tiden 0 og 18 timer. Den celle-kollagen halvkuler kontrahert, i betydelig grad avtagende diameter fra 0 til 18 timer og derfor forhindrer en nøyaktig kvantifisering av celle invasjon utover parameter av brønnen (figur 3B, øvre panel). For å overvinne dette, tilsetningen av dialdehyd dekstran, som har evne til å tverrbinde kollagen [29], ble vurdert. Dialdehyd dekstran ble blandet med HT1080 celle-kollagenblanding før punkteringen i hver brønn. Som vist i figur 3B (nedre panel), tilsetningen av dialdehyd dekstran inhiberte signifikant kollagen sammentrekning og opprettholdt den opprinnelige størrelse og grense av celle-kollagen halvkuler. Ingen hemmende effekt på cancercelle invasjon ble observert.
For å finne ut om denne romanen design er i stand til automatisk avlesning, en kombinasjon av tooled invasjonen plate, en automatisert mikroskopisk stadium (Før Scientific, Inc.), og bildebehandling (Nikon, NIS-Elements) ble benyttet . Etter 18 timer inkubasjon ble HT1080 celler farget med atom flekker Hoechst fargestoff etterfulgt av bildeopptak. Både fasekontrast og atom farget bilder av HT1080-celler ble tatt for hver brønn; et representativt bilde er vist på figur 3C. En terskel fra fase kontrast den ble justert basert på forskjellen i kontrasten mellom inne i pit og utenfor pit (invasjonen område) for å lage binære lag. Den definerte binære lag utenfor gropen området ble deretter kopiert for å danne en region av interesse (ROI), som så ble brukt til Hoechst bildet. Antallet celler i ROI, eller invasjon området, ble deretter automatisk regnet (trinnene i Fig. 3DA-e). Bruke Nikon 10x (0,25 NA) objektiv og en motorisert stadium installert på en Nikon TE2000s invertert mikroskop, kan skanningen av en hel 96-brønns plate med 4 bilder per vel være ferdig innen 6 minutter (data ikke vist). Evnen til hurtig å erverve og analysere data muliggjør screening av mange forbindelser i et kort tidsrom, som er nødvendig for HT screeninger.
For å bestemme robusthet, eller Z faktor [30], av våre 3-D invasjonen assay, effekter av DMSO og anti-β1 inte antistoff behandling på invasjon av Du145 celler eller MT1-GFP uttrykker LNCaP celler ble testet. Z faktor ble beskrevet av Zhang som Z faktor = 1-3xSSD /R (SSD: Summen av standardavvikene, R: absolutte verdi av forskjellen mellom positive og negative kontroller), med en Z-faktor verdi mellom 0,5 og 1,0 indikerer at analysen er pålitelig [30]. Data som samles på 5 forskjellige dager ble analysert ved hjelp av Z-faktor ligning (data ikke vist). En Z-faktor på 0,65 og 0,72 fra Du145 celler og MT1-GFP uttrykk LNCaP-celler, henholdsvis, ble beregnet som indikerer at vår 3-D invasjon analysen tilfredsstiller kriteriene til et utmerket analyse for screening HT. Sammen utgjør disse data viser evnen til vår 3-D invasjon assay for å bli brukt som en HT anti-invasivt legemiddel-screening.
Samtidig bestemmelse av forbindelser som hemmer kreftcelle invasjon fra de som er Cytotoksisk
evnen til å skille mellom forbindelser som hemmer kreftcelle invasjon og de som induserer celledød med den første skjermen ville omgå behovet for en sekundær cytotoksisitet skjerm, noe som reduserer totalkostnadene og øker effektiviteten. Ved ko-farging av celle kollagen halvkuler med Hoechst og propidiumjodid (PI), kan det totale antall invaderte celler, og den cytotoksiske virkning av medikamentet samtidig bestemmes. For å vurdere denne tilnærmingen, ble HT1080-celler som uttrykker GFP-cDNA ble behandlet med DMSO, anti-integrin-antistoff β1, staurosporin (STS), en kinase-inhibitor er kjent for å indusere apoptose [31,32], eller paclitaxel (taxol), et kjemoterapeutisk medikament som stabiliserer mikrotubuli og hemmer celledeling som fører til celledød [33,34]. Etter 18 timer, DMSO ble behandlet HT1080 GFP-celler viste invasjon i det omkringliggende kollagen matrise med minimal PI farging, et tegn på lav cytotoksisitet (figur 4A). I motsetning til dette hadde celler behandlet med anti-integrin-antistoff β1 redusert invasive egenskaper, men et tilsvarende nivå av PI-farging (figur 4B). Behandling med STS forårsaket en betydelig økning i celledød, noe som gjenspeiles ved intens farging PI, og cellene som vises avskaffet celle invasjon (figur 4C). Taxol, et langsommere virkende medikament, forårsaket en signifikant reduksjon i celle invasjon med en beskjeden økning i celledød (figur 4D). Disse data viser evnen til vår analyse for å skille medikamenter som bare hemmer celle invasjon av medikamenter som blokkerer kreft celle invasjon på grunn av en cytotoksisk effekt.
HT1080-celler som uttrykker GFP ble montert i den 3-D invasjon assay i nærvær av (A) DMSO, (B) anti-β1 integrin-antistoff (5 pg /ml), (C) staurosporin (STS) (500 nM), eller (D) paclitaxel (Taxol, 1 uM) i 18 timer. Cellene ble farget med Hoechst og propidiumjodid (PI) i 30 minutter, fulgt av mikroskopisk undersøkelse. Redusert celle invasjon observeres etter behandling med anti-β1 integrin antistoff, STS, og taxol. Men STS og taxol viser høyere nivåer av PI flekker, som indikerer økt celledød. Tall i høyre hjørne representerer det totale antall invasive celler (Hoechst bilder) eller celler som døde etter å invadere (PI bilder) innen feltet. Scale bar = 100 mikrometer.
Validering av HT Kapasitet av 3-D Invasion analysen
Som et bevis på prinsipp, National Cancer Institute Mangfold Set II forbindelse Library, som inneholder 1974 strukturelt forskjellige forbindelser, ble screenet ved anvendelse av MDA-MB-231 brystkreftcellelinje. Forbindelsene ble tilsatt til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 10 uM. DMSO, som er kjøretøy, og anti-β1 integrin-antistoff ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Positive treff ble fastsatt basert på en terskel på 50% hemming av invasjonen. Basert på dette ble 24 positive treff funnet, ni av disse ble bekreftet å være 25% cytotoksiske via en MTT analysen (figur 5A og data ikke vist). En av disse treff var en kjent anti-vandrende forbindelsen, quinocarmycin analog DX-52-1 [35], noe som gir ytterligere bevis på at vår analyse kan lykkes å identifisere forbindelser i stand til å inhibere kreftcelle invasjon (figur 5B).
A) NCI Diversity Set II forbindelse Library ble vist ved hjelp av 3-D invasjonen analysen og MDA-MB-231 celler, noe som resulterer i 24 positive treff, hvorav 9 var hemmende, men ikke cytotoksiske. B) En quinocarmycin analog, ble DX-52-1 positivt identifisert som et anti-invasiv forbindelsen. Representative bilder vises for DMSO kontroll og DX-52-1 (10 mm) etter 18 timer inkubasjon. Avskaffet celle invasjon og lav cytotoksisitet ble observert i celler behandlet med DX-52-1. Tall i høyre hjørne representerer det totale antall invasive celler i feltet. Scale bar = 100 mikrometer. C) Transwell kammer migrering ble utført med MDA-MB-231-celler behandlet med DMSO eller DX-52-1 i 18 timer. Representative bilder av membraner (8 mikrometer porestørrelse) er vist i venstre panel. Kvantifisering av cellemigrering er vist i panel høyre. DX-52-1 behandlede celler hadde sunket vandrende evne. Barer representerer gjennomsnittet + SD. D) Fluorescerende Protease Deteksjon analyse (Sigma) utført med cellelysater fra MDA-MB-231-celler behandlet med DMSO eller DX-52-1 i 18 timer. Ingen effekt på proteolytisk aktivitet ble observert etter behandling med DX-52-1. Barer representerer gjennomsnittet + SD. ** Refererer til
p
0,01.
På grunn av det faktum som er rettet mot identifikasjonen er nyttig for å forutsi bivirkninger, og optimalisering av bly kandidater, er det viktig å ha nedstrøms analyser som kan bidra til å belyse mulig mekanisme (r) for virkning av de positive treff . Siden invasjonen krever både trekkende og proteolytiske aktiviteter, er et viktig neste steg er å skille mellom disse to celleegenskaper. Anvendelse av DX-52-1 som et eksempel, ble den konvensjonelle Transwell kammeret migrasjon analysen og en ikke-spesifikk protease-analyse (Sigma) anvendes. Som vist i figur 5C D, DX-52-1 opphevet betydelig MDA-MB-231 cellemigrasjon, men hadde ingen signifikant effekt på protease aktiviteter. Disse data indikerer at inhibering av invasiv oppførselen til MDA-MB-231 celler ved DX-52-1 er på grunn av en reduksjon av vandrende evne, som er støttet av tidligere publiserte rapporter [35].
