Abstract
Motstand mot cisplatin-basert terapi er en viktig årsak til behandlingssvikt i menneskelig eggstokkreft. En bedre forståelse av mekanismene for cisplatin motstand vil gi ny innsikt for nye terapeutiske strategier for denne dødelige sykdommen. Akt og p53 er determinanter av cisplatin følsomhet. Rictor er en komponent av mTOR-proteinkinase kompleks 2, som er nødvendig for Akt-fosforylering (Ser473) og full aktivering. Men forblir den nøyaktige rolle rictor og forholdet mellom rictor og p53 i cisplatin motstand dårlig forstått. Her, ved hjelp av følsomme vill-type p53 (OV2008 og A2780s), motstandsdyktig vill-type p53 (C13 * og OVCAR433), og p53 kompromittert (A2780cp, OCC1, og SKOV-3) eggstokkreft celler, har vi vist at (i) rictor er en determinant av cisplatin motstand i kjemosensitiv menneskelige eggstokkreft celler; (Ii) cisplatin nedregulerer rictor innhold av caspase-3 cleavage og proteasomal degradering; (Iii) rictor nedreguler sensitizes chemo-resistente eggstokkkreftceller til cisplatin-indusert apoptose i en p53-avhengig måte; (Iv) rictor undertrykker cisplatin-indusert apoptose og gir resistens ved å aktivere og stabilisere Akt. Disse funnene utvide dagens kunnskap om molekylære og cellulære grunnlag av cisplatin motstand og gi en begrunnelse grunnlag for rictor som en potensiell terapeutisk mål for kjemoresistent eggstokkreft
Citation. Im-Aram A, Farrand L, Bae SM, Song G, Song YS, Han JY, et al. (2013) The mTORC2 Component Rictor Bidrar til Cisplatin Resistance i Human eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10,1371 /journal.pone.0075455
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: May 24, 2013; Godkjent: 15 august 2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Im-aram et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av World Class University (WCU) program gjennom departementet for utdanning, vitenskap og teknologi, og finansiert av National Research Foundation of Korea (R31-10056) og via den kanadiske Institutes of Health Research (M0P-126144). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er den mest dødelige gynekologisk kreft blant kvinner over hele verden [1]. Til tross for fremskritt i vår forståelse av tumorbiologi, forblir den generelle dødeligheten av kreft i eggstokkene (OVCA) høy. Foreløpig kjemoterapi i kombinasjon med kirurgisk debulking er den foretrukne alternativ behandling og derivater av cisplatin (CDDP: cis-diamminedichloroplatinum) er førstelinje kjemoterapeutiske behandlingsformer. CDDP induserer cytotoksiske celledød gjennom dannelsen av DNA-platina-addukter, noe som resulterer i DNA-skade og aktivering av apoptotiske reaksjonsveier [2].
Den effektive behandling av OVCA blir ofte hemmet av sen diagnose og fremveksten av motstanden mot cellegift etter påfølgende runder med behandling. Motstand mot kjemoterapeutika involverer komplekse mekanismer som kan oppstå ved feilregulert signale, forbedret DNA-reparasjon, endret kreft celle metabolisme [3,4], narkotika transport og metabolisme [5], og feilregulering av overlevelsesfaktorer, inkludert FLIP, Xiap og Akt [6 -9]. Disse molekylære og cellulære hendelser endre den generelle responsen av cellen til gentoksiske stoffer som CDDP og innflytelse cellen mot pro-overlevelse beslutninger.
mammalian target of rapamycin (mTOR) veien har dukket opp som en kritisk regulator av mobilnettet metabolisme, vekst, proliferasjon og overlevelse. Dets avvik, noe som er til stede i opp til 50% [10] fra OVCA pasienter, har vist seg å gi resistens mot CDDP basert behandling og er forbundet med en ugunstig prognose [11-14]. Den mTOR pathway involverer to signalkomplekser: mTORC1 og mTORC2. mTORC1 er følsom for rapamycin og kontroller proteinsyntese og cellulær metabolisme, mens mTORC2 er essensielt for cellelevedyktighet [15]. mTORC2 er også kjent for sin rolle i fosforylering av Akt på Ser473 slik at full aktivering og proteasomal degradering [16-18]. Akt aktivering og /eller over-uttrykk er med på å bestemme CDDP følsomhet i menneske OVCA. Akt aktivering resulterer i stabilisering av en rekke kaspaseinhibitorer [19,20] hemmer mitokondriell p53-akkumulering og frigjøring av død proteiner [21,22], og demper p53 fosforylering og atom funksjon [8]. I kontrast, øker Akt hemming p53 fosforylering (Ser
15) og CDDP følsomhet [8,23].
rapamycin-insensitive følgesvenn av mTOR (Rictor) er en viktig del av komplekset mTORC2, og er nødvendig for sin fulle funksjon [24]. Over-uttrykk for rictor øker mTORC2 aktivitet og fremmer cellevekst og motilitet [25]. Omvendt, rictor nedregule undertrykker celleproliferasjon og tumordannelse i visse kreft [26-28]. Rictor samhandler også med intebundet kinase (ILK) for å fremme kreft celle overlevelse gjennom Akt Ser473 fosforylering, og med PKCζ for kreft celle invasjon og metastase [29,30]. Rictor er nødvendig for prostatakreft utvikling indusert av PTEN tap [31]. Målrette rictor induserer cellesyklus arrest i G1 fase og reduserer cyclin D1 uttrykk i bryst, tykktarm og prostata kreft celler [27,32]. Dessuten, nedregulering av mTORC2 forenkler kjemoterapeutisk medikament-indusert apoptose i brystkreftceller [33]. Men fortsatt ukjent rolle rictor i CDDP motstand i OVCA.
p53 er en tumor suppressor protein som påvirker nedstrøms effektorer av apoptose gjennom både transkripsjon avhengig og-Uavhengig mekanismer [8,21]. Det er normalt aktiveres av CDDP via fosforylering på Ser15 og Ser20, som er avgjørende for sine pro-apoptotiske egenskaper, og undertrykkelse av murine dobbel minutt 2 (MDM2) og dens ubiquitinering og proteasomal degradering [34-36]. Vi har nylig vist at tap av p53-funksjon ved inaktivering eller mutasjon påvirker apoptose og kjemosensitivitet [7,37] negativt. Celler som mangler funksjonell p53 mislykkes i å hemme mTORC1 i respons til DNA-skade [38]. Imidlertid er koordinering og kommunikasjon mellom p53 status og rictor i reguleringen av chemoresistance dårlig forstått.
I denne studien, hypoteser vi at rictor spiller en viktig rolle i å regulere kjemosensitivitet av OVCA celler og at ned- regulering sensitizes kjemoresistent OVCA celler til CDDP behandling ved å tilrettelegge Akt-avhengig proteasomal nedbrytning, på en måte avhengig av p53 status. Resultatene av denne studien øke muligheten for at rictor kan være et terapeutisk mål for OVCA, selv om effektiviteten av en slik søknad vil trolig være avhengig av p53 status.
Materialer og metoder
reagenser
RPMI 1640 og DMEM /F12 kultur media, føtalt bovint serum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer, penicillin, streptomycin, og amfotericin B var fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, dimetylsulfoksid (DMSO), Hoechst 33248, aprotinin, natriumortovanadat (Na
3VO
4), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Kanin polyklonale antistoffer: anti-fosfor-Ser
473-Akt, anti-fosfor-Ser
450-Akt, anti-Akt, anti-fosfor-Ser
15-p53, anti-PARP og kanin monoklonalt anti-rictor antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Mus monoklonalt anti-p53 og anti-GAPDH antistoffer var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA) og Abcam (Cambridge, MA, USA), henholdsvis. Geit-anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Rictor og p53 siRNA ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Kontroll siRNA var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Lipofectamine 2000, RNase A, N, N, N «, N»-tetrametyl-etan-1,2-diamin (TEMED), TRIzol og ROX fargestoff var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNeasy Mini Kit var fra Qiagen (Valencia, CA, USA). Adenovirus konstruksjoner som inneholder WT-p53 og EGFP transkripsjoner var fra Vector Biolabs (Philadelphia, PA, USA). Epoxomycin og laktacystin var fra EMD Chemical (Gibbstown, NJ, USA). Z-DEVD-FMK og Z-VAD-FMK var fra Tocris Biovitenskap (Ellisville, MO, USA). Rictor og GAPDH RNA primer var fra Bioneer (Daejeon, Korea) og humant rekombinant aktiv caspase 3 var fra BioVision (Mountain View, CA, USA). Rør, DL-ditiotreitol (DDT), Etylen-tetra Acid (EDTA) og 3 [(3-cholamido-propyl) dimethyallonio] -1-propan hydrat (Chaps) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, USA) .
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur
CDDP sensitive (OV2008 og A2780s) og resistente (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-en, og SKOV3) menneskelige OVCA cellelinjer ble sjenerøst gitt av legene. Rakesh Goel og Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Canada). Cellene ble holdt i RPMI 1640 og DMEM /F-12 som tidligere rapportert [20,21,36]. Den OV2008 cellelinje og dens motstandsdyktig motstykke C13 * ble stammer fra eggstokkene endometrioid adenokarsinom med plateepitel differensiering. OCC-1, A2780s og A2780cp celler stammer fra udifferensierte ovarialcancer svulster. SKOV3-celler var av en klar cellekreft opprinnelse [39] og OVCAR433 cellene var av serøse cystadenocarcinomas i eggstokken [23]. Etter de angitte behandlinger, ble cellene høstet for analyse.
Protein utvinning og Western blotting-analyse
Prosedyrene for protein utvinning og Western blotting-analyse ble utført som tidligere beskrevet [40]. Membranene ble inkubert ved 4 ° C over natten med anti-rictor (1: 100), fosfo-Ser
473-Akt (1: 1000), fosfo-Ser
450-Akt (1: 1000), p53 ( 1: 5000), fosfo-Ser
15-p53 (1: 1000) og PARP (1: 2000) antistoffer og 1 time ved romtemperatur for anti-GAPDH (1: 10.000) og HRP-konjugert kanin eller mus sekundær antistoffer (1: 5000-1: 10000). GAPDH ble valgt som lasting kontroll siden den cellulære innhold i OVCA cellene undersøkt i dagens studier ikke påvirkes av CDDP behandling. Band tettheter ble analysert for kvantifisering ved hjelp av en ChemiDOC
TM XRS + (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
Vurdering av apoptose
Apoptose ble vurdert basert på mobilnettet morfologi bruker nukleær flekk Hoechst 33258. Fremgangsmåten måten~~POS=HEADCOMP ble utført som tidligere beskrevet [20,36]. Et minimum av 400 celler per behandlingsgruppe ble talt og telleren ble blindet for å unngå eksperimentell skjevhet
siRNA transfeksjon
OVCA celler ble transfektert med rictor siRNA (0-100 nM; 48 h). , p53 siRNA (100 nM; 48 h) eller styre siRNA (0-100 nM; 48 h) og deretter behandlet med CDDP (0-10 pM; 24 h), som beskrevet tidligere [20], og høstet for videre analyse .
adenoviral infeksjon
A2780cp og SKOV3 celler ble infisert med adenovirus wt-p53 (MOI = 10, 24 h, GFP som kontroll) som tidligere beskrevet [9,20] Hotell.
in vitro caspase-3-aktivitet
in vitro caspase-3-aktivitet analysen ble utført med helcellelysater av OV2008 som tidligere beskrevet [23].
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført av paret t-test, og enveis eller toveis ANOVA som hensiktsmessig, bruker SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, USA). Forskjeller mellom flere eksperimentelle grupper ble bestemt ved Bonferroni post-hoc test. Statistisk signifikans ble utledes på P 0,05.
Resultater
CDDP nedregulerer Rictor innhold og induserer apoptose i kjemosensitiv men ikke bestandig OVCA celler
For å avgjøre om rictor innhold er endret under CDDP behandling i OVCA, kjemosensitiv OVCA (OV2008 og A2780s) og kjemoresistent (C13 *, A2780cp *, OVCAR433, OCC1 og SKOV-3) OVCA cellelinjer ble behandlet med CDDP (0-10 pM; 24 h) og rictor innhold ble bestemt ved immunoblotting [Figur 1 ]. CDDP vesentlig nedregulert intakt rictor innhold (200 kDa) og induserte apoptose i kjemosensitiv (OV2008, *** P 0,001; og A2780s, ** P 0,01), men ikke i kjemoresistent OVCA uavhengig av CDDP konsentrasjon (C13 *, A2780cp, OVCAR433, OCC1 og Skov-3; p 0,05). Disse resultater viser at rictor ikke er utsatt for nedregulering av CDDP i kjemoresistent OVCA celler, et fenomen som kan bidra til den resistente fenotype.
Rictor protein-ekspresjon nedregulert i kjemosensitiv (OV2008 og A2780s), men ikke kjemoresistent OVCA (C13 * og A2780cp *) under CDDP behandling (0-10 uM CDDP; 24 timer). Redusert rictor innhold i OV2008 og A2780s følgende CDDP behandling var assosiert med økt apoptose. Rictor proteininnhold i kjemoresistent OVCA (OVCAR433, OCC1 og SKOV3) ble ikke påvirket av CDDP. Rictor innhold ble normalisert mot GAPDH (lasting kontroll). En representant Western blot fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, # p 0,05 (vs CTL i følsomme celler). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
CDDP induserer rictor behandling og kjemosensitivitet i et caspase-3- og proteasome avhengig måte
For å finne ut om CDDP-indusert rictor nedregulering kan skyldes post-translasjonell prosessering, vi først undersøkt muligheten for caspase-avhengig spaltning av rictor i OV2008 og A2780s når de behandles med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD FMK (10 uM) før ( 30 min), og i løpet av CDDP utfordring (0-10 pM; 24 timer). OV2008 celler behandlet med CDDP alene oppviste en intakt rictor (200 kDa) og to immunoreaktivt spaltede produkter som migrerte ved 160 kDa og 130 kDa [Figur 2]. CDDP reduserte intakt rictor innholdet og 160 kDa-protein, men markert øket nivåene av 130 kDa bånd. Selv om behandling av A2780s med CDDP resulterte også i nedregulering av intakte rictor (200 kDa), ble nivået av 160 kDa-proteinet sterkt forhøyet, mens det av den 130 kDa ikke var signifikant påvirket. Forbehandling av cellene med det kaspaseinhibitor dempes i betydelig grad CDDP-induserte forandringer i intakte og spaltede rictor innholdet i begge følsomme celler (P 0,05 og P 0,01 i OV2008 og A2780s henholdsvis figur 2), noe som tyder på at CDDP ned -regulates rictor delvis av økt caspase aktivitet og at cleavage på ulike caspase konsensus nettsteder kan være involvert. I tillegg forbehandling av OVCA celler med spesifikke kaspase-3 inhibitor Z-DEVD-FMK produsert lignende resultater, noe som indikerer at caspase-3 er involvert i CDDP-indusert rictor behandling. Interessant, mens CDDP indusert apoptose i begge kjemosensitiv cellelinjer, forbehandling av cellene med enten den pan-caspase eller spesifikk kaspase-3 inhibitor svekkede denne reaksjon, noe som tyder på at CDDP induserer rictor behandling av kaspase-3 og feilregulering av denne prosessen confers chemoresistance i OVCA celler
OV2008 og A2780s ble forbehandlet med Z-VAD FMK (10 uM) og Z-DEVD FMK (50 uM) i 30 minutter før og i løpet av CDDP utfordring. (0-10 pM; 24 h) og rictor innhold og apoptose ble vurdert. OV2008 celler behandlet med CDDP alene oppviste en intakt rictor (200 kDa) og to spaltede produkter (160 kDa og 130 kDa). CDDP reduserte intakt rictor innhold og 160 kDa-protein, men betydelig økte nivåer av 130 kDa bånd. Behandling av A2780s med CDDP resulterte i nedregulering av intakte rictor men økte nivået av 160 kDa-protein, og hadde ingen effekt på 130 kDa-proteinet. Forbehandling av cellene med det pan-kaspase-inhibitor (Z-VAD) eller den spesifikke caspase-3-inhibitor (Z-DEVD) dempes i betydelig grad CDDP-induserte forandringer i intakte og spaltede rictor innholdet i begge sensitive celler, og CDDP- apoptose var signifikant, men ikke fullstendig dempet ved tilstedeværelsen av inhibitorer i begge kjemosensitiv cellelinjer. Rictor innhold ble normalisert mot GAPDH (lasting kontroll). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3 og n = 5 i OV2008 og i A2780s, henholdsvis). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive kontroller). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
For å avgjøre om proteasomal degradering spiller en rolle i CDDP-indusert rictor nedregulering, OV2008 celler dyrket [30 min pre- behandling; 24 timer i løpet av behandling med CDDP (0-10 mm)] med proteasomhemmere epoxomycin (10 nM) og laktacystin (4 mm). Mens CDDP alene signifikant nedregulert intakt rictor og induserte apoptose, som forventet, tilstedeværelse av inhibitorene fullstendig blokkert CDDP-indusert rictor nedregulering og en betydelig, men ikke helt svekkede apoptose, som vist ved PARP-spaltning og kjernemorfologi (P 0,001 Figur 3:. A)
A. OV2008 celler ble forbehandlet (30 min) med proteasomal inhibitorer [epoxomycin (10 nM) og lacytasystin (4 uM)] og underkastet CDDP utfordring (0-10 pM; 24 timer). Rictor innhold og apoptose ble analysert ved Western blotting og kjernemorfologi vurdering. Både epoxomicin og laktacystin effektivt blokkert CDDP-indusert rictor nedbrytning (P 0,001), men bare delvis svekket apoptose. B. OV2008-celler ble dyrket under de samme betingelser som i A, men forbehandlet med proteasominhibitor og /eller Z-DEVD (50 uM). Ingen synergistisk effekt mellom de to hemmere ble observert. C. Inkubering av OV2008 hele cellelysatet (30 min, 30 ° C) med rekombinant aktiv caspase-3 (5-20 ug /ml) resulterte i Rictor spalting som vist ved redusert intakt rictor innhold (200 kDa) og øket i den spaltede former (130 kDa og 160 kDa). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive kontroller). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
Vi undersøkte videre om rictor behandling av caspase-3-aktivitet og proteasomal nedbrytning skjer i egne veier. OV2008 celler ble dyrket [30 min før behandling; 24 timer i løpet av behandling med CDDP (0-10 mm)] med proteasomhemmere og /eller spesifikk caspase-3-inhibitor. De samme resultater ble observert når enten inhibitor var til stede. Imidlertid ble det ikke observert noen ekstra effekt når begge hemmere ble brukt sammen [Figur 3: B]
I tillegg til å gi ytterligere bevis på at rictor behandling indusert av CDDP behandling er caspase-3 avhengig, hele cellelysater fra. OV2008 celler ble anvendt til å utføre en
in vitro
caspase-3 aktivitetsanalyse.
in vitro
data var enige med det som oppnås fra cellelinjen eksperiment [Figur 3: C]. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at CDDP nedregulerer intakt rictor på proteinnivå via caspase-3 cleavage og proteasomal degradering.
Rictor knockdown sensitizes chemo-resistente OVCA til CDDP-indusert apoptose
for å fastslå rollen til rictor i OVCA chemoresistance, ble rictor ekspresjon i en vill-type p53 kjemoresistent OVCA cellelinje (C13 *) slås av ved siRNA (0, 50 og 100 nM; 48 h) før behandling med CDDP (10 uM; 24 h), og apoptose ble bestemt. Intakt rictor og dens spaltede formene ble signifikant nedregulert ved siRNA på en konsentrasjonsavhengig måte. En betydelig reduksjon i intakte rictor og spaltet rictor ble observert ved 50 nM (p 0,05) og til en tilnærmet 30% reduksjon ved 100 nM, uavhengig av tilstedeværelsen av CDDP. Disse funnene ikke bare bekreftet at 160kDa og 130 kDa immunoreaktive bånd ble faktisk spaltet produkter av rictor, men også demonstrert at rictor knockdown apoptose (p 0,05), så vel som forbedret CDDP-indusert apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte (p 0,001) [Figur 4]. Disse resultater antyder at rictor er en viktig determinant for CDDP motstand i OVCA
C13 *-celler ble transfektert med rictor siRNA. (0-100 nM; 48 h) og dyrket med eller uten CDDP (10 mM; 24 h ). Rictor knockdown betydelig forbedret CDDP-indusert apoptose i C13 * celler i en konsentrasjonsavhengig måte. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
apoptotisk respons på CDDP følgende rictor nedregulering er avhengig av p53 status
tumor suppressor p53 er en viktig formidler av CDDP-indusert apoptose [9,22]. Siden ca 50% av pasientene OVCA bære
TP53
mutasjon (er) [41], er det av interesse å bestemme om CDDP-indusert apoptose i celler kjemoresistent følgende rictor knockdown er avhengig av tilstedeværelsen av en funksjonell p53 . For å undersøke denne muligheten, rictor uttrykk i kjemoresistent OVCA cellelinjer med varierende p53 status (wt-p53, C13 * og OVCAR433; p53-mutant, OCC1 og A2780cp; p53-null, SKOV3) ble brakt til taushet med rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) før behandling med CDDP (0-10 uM, 24 h). Rictor knock-down betydelig sensibilisert kjemoresistent wt-p53-celler (C13 * og OVCAR433, Figur 5: A, P 0,001), men ikke p53-manglende celler (OCC1, Figur 6: A; A2780cp og SKOV3, Figur 5: B) til CDDP-indusert apoptose, noe som tyder på at kanskje trengte en funksjonell p53 for CDDP-indusert apoptose i kjemoresistent OVCA celler med rictor knockdown. For ytterligere å undersøke denne hypotese, CDDP-resistente cellelinjer OVCA skjuler en p53-mutasjon (A2780cp) og et p53-null-linje (SKOV-3) ble behandlet med rictor siRNA (0-100 nM; 48 timer), etterfulgt av rekonstituering av vekt- -p53 via adenovirus-infeksjon (MOI 0-10, 24 h) og CDDP behandling (0-10 uM CDDP; 24 timer). Som vist i figur 5: B, mens rictor knockdown alene ikke i betydelig grad øke CDDP følsomhet i fravær av vill-type p53, vill-type p53 rekonstituering forbedret virkningene av rictor-knockdown på CDDP-indusert fosfo-p53 Ser15 innhold og apoptose i betydelig både p53-mangelcellelinjer (p 0,001).
kjemoresistent OVCA cellelinjer med varierende p53 status (wt-p53, C13 * og OVCAR433; p53-mutant, OCC1 og A2780cp, p53-null, SKOV3) ble transfektert med rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) med eller uten adenovirus vill-type p53-infeksjon (MOI 0-10; 24 timer; p53-manglende celler) og CDDP behandling (0-10 uM CDDP; 24 timer). Rictor, p-p53 ser15, p53, PARP og GAPDH-innhold, så vel som apoptose ble vurdert. Rictor knock-down betydelig sensibiliserte kjemoresistent wt-p53-celler (A, C13 * og OVCAR433; P 0,001), men ikke p53-difficient celler (A, OCC1, B, A2780cp og SKOV3) til CDDP (10 mm) indusert apoptose. Rekonstituering i A2780cp og SKOV-3 av vill-type p53 betydelig forbedret CDDP-indusert apoptose (P 0,001). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA), # # # p 0,05 (vs styrer Adenoviral infeksjon). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
kjemoresistent OVCA celler (C13 *) ble transfektert med rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) og forbehandlet med epoxomycin (0 -12.5 nM) 30 minutter før behandling CDDP (0-10 uM CDDP; 24 timer). Rictor, ble Akt, fosfo Akt (Thr450 og Ser473), og GAPDH innhold, samt apoptose vurdert. Rictor knock-down betydelig forbedret CDDP-indusert apoptose i kjemoresistent OVCA celler (P 0,01 og P 0,001, henholdsvis) og denne effekten ble reddet av epoxomycin (P 0,05 og p 0,001, henholdsvis) Total-Akt ble betydelig redusert i løpet av rictor tie med CDDP behandling (P 0,05) og en massiv økning i forholdet mellom fosfor-Akt (Ser473) og total-Akt ble også observert, noe som betydelig redusert når epoxomycin ble lagt (P 0,001 og P 0,05, henholdsvis) resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs respektive CTL siRNA) # # p 0,01, # # # p 0,05 (vs uten epoxomycin). Hoechst 33258 farging ble brukt for vurdering av apoptose som nevnt i eksperimentelle prosedyrer.
Rictor nedregule sensitizes kjemoresistent celler til CDDP-indusert apoptose ved å tilrettelegge Akt proteasomal degradering
Rictor er kjent å være nødvendig for mTORC2 å fosforylere Akt på Ser473. For å undersøke om og hvordan Akt er relevant for dette fenomen, ble kjemoresistent OVCA-celler (C13 *) rictor ekspresjon slås av ved siRNA (100 nM; 48 h) før forbehandling med epoxomycin (12,5 nM; 30 min) og behandling med CDDP (10 uM; 24 timer), og apoptose ble bestemt. Rictor knockdown alene økte fosfo-Akt (Ser473) innhold, men reduserte nivåene av fosfo-Akt Ser450 [Figur 6], et fosforyleringssete kjent for å bli regulert i Akt stabilitet [18]. Økningen i Akt-fosforylering ved Ser473 følgende rictor stanse uten proteasomal inhibitor ble ledsaget av Akt nedregulering (P 0,05 i behandlingsgruppe) og ble reddet av proteasomal inhibitor (p 0,05). Apoptoseinduksjon uavhengig av tilstedeværelsen av CDDP, to reaksjoner reduseres av nærværet av den proteasominhibitor epoxomycin (figur 6; p 0,05 og P 0.001 i kontroll og CDDP behandlingsgruppene henholdsvis). Dessuten er forholdet mellom fosfo-Akt ved Ser473 og total Akt ble også markert øket i rictor knockdown med CDDP-behandling og betydelig redusert når epoxomicin ble det tilsatt (P 0,001 og p 0,05, med og uten epoxomycin, henholdsvis). Disse resultatene tyder på at rictor spiller en rolle i Akt stabilisering og CDDP motstand i menneskelig OVCA og dens knockdown fremmer Akt proteasomal degradering og forbedrer CDDP følsomhet.
Diskusjoner
Chemoresistance er en viktig terapeutisk hinder i eggstokkene kreft og dens cellulære mekanisme er komplisert og dårlig forstått. Selv om mTOR-signalveien er kjent for å fremme celleproliferasjon og overlevelse, enten rictor er involvert i kontrollen av kjemosensitivitet er ukjent. I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle rictor i CDDP motstand ved hjelp av CDDP-sensitive og resistente OVCA cellelinjer med ulik p53 status. Vi har vist for første gang at rictor er en determinant av CDDP motstand i OVCA. CDDP nedregulerer rictor innhold i kjemosensitiv celler ved kaspase-3 og proteasom-avhengig nedbrytning, men ingen tilsvarende effekt ble observert i resistente celler. I tillegg har vi vist at rictor undertrykker CDDP-indusert apoptose og gir resistens ved å aktivere og stabilisere Akt. Dempe rictor sensitizes kjemoresistent OVCA celler til CDDP-indusert apoptose i celler som inneholder vill-type-p53, men ikke på p53-kompromitterte celler med mindre rekonstituert med en funksjonell p53. Samlet utgjør disse data støtter hypotesen om at rictor nedregule sensitizes kjemoresistent OVCA celler til CDDP behandling ved å tilrettelegge Akt-avhengig proteasomal nedbrytning, på en måte avhengig av p53 status.
Vår nåværende undersøkelse viser at rictor er nede -regulated på protein, men ikke mRNA nivå (data ikke vist), og denne prosessen er forbundet med CDDP-indusert apoptose i følsomme OVCA celler og at rictor spiller en rolle i celle skjebne bestemmelse. Denne observasjonen er videre støttet med resultatene ved anvendelse av forskjellige kjemoresistent OVCA cellelinjer med forskjellig p53 status, ved at svikt av CDDP for å ned-regulere rictor innhold gjør det mulig for cellene å overleve CDDP behandling. Rollen rictor i celle overlevelse har tidligere blitt vist, og en studie har adressert den oppfatningen at rictor og proteiner i mTOR veien er nedregulert via proteasome-ubiquitin sti i lungekreftceller etter kjemoterapeutisk utfordring, den mulige involvering av rictor behandling i kontroll av kjemosensitivitet ble ikke adressert [26]. Våre resultater viser at CDDP induserer rictor nedregulering via proteasome er i samsvar med dette funnet. Dessuten har vår nåværende studier utvidet ovennevnte funn ved å vise at caspase-3 kreves for CDDP-indusert rictor behandling i kjemosensitiv humane OVCA celler. Tatt sammen tyder disse resultater på at rictor overfører CDDP motstand i human OVCA og CDDP-indusert rictor nedreguleringen er avhengig av både caspase-3 aktivitet og proteasomal degradering i kjemosensitiv, men ikke i kjemoresistent OVCA cellelinjer.
tumor suppressor
TP53
er også en av de mest hyppigst muterte gener i humane OVCA, og kan være så høyt som 50% i OVCA pasienter [41]. Tap eller mutasjon av p53 kan ha en enorm innvirkning på tumor aggressivitet, prognose og vellykket implemention av behandling [42]. Ettersom mekanismen for CDDP-resistens er multifaktoriell og p53 status er en av de store bekymringer i human OVCA, har vi undersøkt forholdet mellom rictor og tumor suppressor p53, i aspekt av chemoresistance. Vår etterforskning, derfor ytterligere adresser rollen til rictor i CDDP motstand og viser at rictor knockdown ikke bare fremmer apoptose, men også forbedrer CDDP-indusert apoptose i humane OVCA celler. Dette resultatet samsvarer med en fersk studie som viser at satsing på rictor hindrer celle migrasjon og fremmer apoptose i brystkreft [23]. Resultater fra vår nåværende studie viser også at allergi kjemoresistent OVCA celler ved å kneble rictor ser ut til å være avhengig av p53 status. Dette begrepet er videre støttet av den observasjon at en kombinasjon av rictor knockdown og rekonstituering av vill-type p53 fremmer apoptose i p53-kompromitterte celler når de induseres med CDDP behandling, et resultat som ikke eventuate uten vill-type p53. Den sistnevnte reaksjon er samtidig med en økning i p53-aktivering gjennom fosforylering ved ser15 rest som endrer p53 struktur og hemmer p53-MDM2 interaksjon, for derved å stabilisere p53 [35]. Dette kan være grunnen til p53 stabilisering observert i A2780cp og SKOV-3, i nærvær av fosfo-p53 (ser15). Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at rictor knockdown induserer apoptose og forbedrer CDDP-indusert apoptose i en p53-avhengig måte.
Akt signalveien er en determinant av chemoresistance og dens aktivisering fremmer en kjemoresistent fenotype, ofte påvises i så høyt som 87% av tilfellene i human OVCA [10].
