Abstract
Analyser av NY-ESO-1-spesifikke spontane immunresponser hos kreftpasienter viste at antistoff og både CD4
+ og CD8
+ T-celle responser ble indusert sammen i kreftpasienter . For å undersøke om slike integrerte immunresponser er også spontant indusert for andre tumorantigener, har vi vurdert antistoff og T celle respons mot selv /tumor antigen p53 i eggstokkreft pasienter og friske personer. Vi fant at 21% (64/298) av ovarian kreftpasienter, men ingen friske donorer viste spesifikke IgG responser overfor vill-type p53-protein. Mens ingen av 12 pasienter med høyt titer p53 antistoff viste spontane p53 spesifikke CD8
+ T-celle responser etter en enkelt
in vitro
allergi, betydelig p53-spesifikk IFN-γ produserende CD4
+ T -celler ble detektert i 6 pasienter. Overraskende, tilsvarende nivåer av p53-spesifikke CD4
+ T celler, men ikke CD8
+ T-celler ble også påvist i 5/10 seronegative kreftpasienter og 9/12 friske donorer. Viktigere, p53-spesifikke CD4
+ -T-celler i friske givere stammer fra en CD45RA
– antigen-erfaren T-cellepopulasjon og anerkjente naturlig behandlet villtype p53-protein. Disse resultatene øke muligheten for at p53-spesifikke CD4
+ T-celler gjenspeiler unormaliteter i p53 som forekommer i normale individer, og at de kan spille en rolle i prosesser av immunosurveillance eller immunregulering av p53-relaterte neoplastiske hendelser.
Citation: Tsuji T, Matsuzaki J, Ritter E, Miliotto A, Ritter G, Odunsi K, et al. (2011) Split T-celletoleranse mot en selv /Tumor Antigen: Spontan CD4
+ men ikke CD8
+ T celle responser mot p53 hos kreftpasienter og friske donorer. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10,1371 /journal.pone.0023651
Redaktør: Mauricio Martins Rodrigues, føderale universitetet i São Paulo, Brasil
mottatt: 04.03.2011; Godkjent: 22 juli 2011; Publisert: 12. august 2011
Copyright: © 2011 Tsuji et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Cancer Research Institute Eggstokkreft Working Group Grant og Kreft Vaccine Collaborative finansiert av Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelsen av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Økende bevis viser at både tumor antigen-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celler spiller en avgjørende rolle i å utrydde kreft [1], [2]. Vi har grundig undersøkt spontane eller vaksineinduserte immunresponser mot kreft-testikkel antigen NY-ESO-1 som en prototype tumorantigen i humant [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. Naturlig forekommende NY-ESO-1-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celleresponser ble påvist vanligvis bare i pasienter som hadde serum antistoff mot NY-ESO-1, noe som indikerer at spontane immunresponser mot NY-ESO- 1 i kreftpasienter med NY-ESO-1 uttrykker svulster ble svært integrert [3], [4]. Nylig ble det vist at etter vaksinering med NY-ESO-1-protein og CpG, NY-ESO-1-spesifikke CD4
+ -T-celler ble detekterbar først, etterfulgt av utseendet av antistoff og CD8
+ T-celler , noe som tyder på en rolle for NY-ESO-1-spesifikk CD4
+ T-celler i å tilrettelegge antistoff og CD8
+ T-celle responser etter immunterapi [8]. I tillegg har vi nylig funnet ut at vaksinering med MAGE-A3 protein indusert integrert MAGE-A3-spesifikt antistoff, CD8
+ og CD4
+ T-celle responser [9]. I ikke-småcellet lungekreft pasienter som fikk MAGE-A3 protein formulert i adjuvanssystemet AS02B, ble CD8
+ T-celle responser indusert kun til pasienter som utviklet svært høy titer antistoff og sterke CD4
+ T-celle responser . Men en slik sammenheng mellom antistoff og T-celle responser har ikke vært fullt opp for andre humane tumorantigener.
I løpet av de siste tiårene har immunresponser mot p53 blitt grundig undersøkt [10], [11], [12 ], [1. 3]. P53-protein ble påvist i vårt laboratorium som et immunogen tumor-spesifikt antigen ved serologisk undersøkelse av tumorbærende mus [14], og samtidig i to andre laboratorier ved hjelp av andre metoder, [15], [16]. Det ble senere oppdaget at p53-genet er mutert ofte i forskjellige kreftformer, noe som fører til tap av heterozygoty, feilregulering av p53 tilbakekoblingsnettverk, og til slutt resulterer i langsommere p53 omsetning og dermed akkumulering av mutant p53-proteinet i tumorceller. Hos mennesker er p53 akkumulert i opp til 70% av svulster fra pasienter med visse kreftformer som tykktarmen eller hode- og halskreft, og denne ansamling er en svært immunogen hendelse, spontant utløser høy-titrert spesifikke antistoffresponser [12]. Faktisk har p53 vært en av de mest hyppigst detektert antigener som gjenkjennes av naturlig forekommende antistoffer hos kreftpasienter ved screening av cDNA-ekspresjonsbibliotek erholdt fra humane tumorer med autolog antistoff (Serex) og ved hjelp av ELISA i vårt laboratorium [17], [18] , [19], [20]. Naturlig forekommende p53 antistoffer hos kreftpasienter er kjent for å gjenkjenne villtype N-terminale eller C-terminale sekvenser av p53, men ikke det sentrale område av proteinet, hvor 90% av mutasjoner forekommer. Vi og andre har også undersøkt T-cellerespons mot villtype p53 og mange epitoper til både CD8
+ og CD4
+ T-celler har blitt bestemt ved revers immunologi metoder og gjentatt stimulering av T-celler med syntetiserte peptider [10 ], [21], [22]. Nyere resultater fra T-celle immunomonitoring av eggstokkreft og tykktarmskreftpasienter vaksinert med p53 overlappende peptider viste sterk induksjon av p53-spesifikke CD4
+ T-celle responser, som var enda registreres av
ex vivo
analyser av perifert blod mononukleære celler (PBMC) etter vaksinasjon uten å fremkalle noen påviselig p53 spesifikke CD8
+ T-celler [23], [24].
i denne studien har vi undersøkt spontan antistoff og T-celle respons mot p53 i eggstokkreft pasienter med tumorer ofte akkumulere p53 protein [25], og friske donorer. Å sammenligne
in vivo
immunogenisitet av p53 med at av NY-ESO-1, overvåket vi p53-spesifikke CD4
+ og CD8
+ T-celle responser ved hjelp av immunomonitoring prosedyrer som ble utviklet for å overvåke spontane NY-ESO-1-spesifikke T-celleresponser. Disse standardiserte metoder ble tidligere vist å oppdage NY-ESO-1-spesifikk sirkulerende CD4
+ og CD8
+ T celle responser bare i NY-ESO-1-seropositive pasienter med NY-ESO-1-uttrykke svulst, men ikke i friske donorer med lav hyppighet av forløpere [4], [26]. Ved hjelp av denne protokollen, har vi funnet at IFN-γ-produserende CD4
+ T-celler mot villtype p53-sekvenser ble påvist ofte i seropositive kreftpasienter. Overraskende, spontan p53-spesifikke CD4
+ T-celleresponser med lignende størrelse ble også funnet i de fleste seronegative pasienter og friske donorer. I motsetning til dette ingen spontan CD8
+ T-cellerespons mot villtype p53 eller mot pasientens egne muterte p53-sekvenser ble påvist i alle donorer som ble testet, noe som antyder at spontan aktivering av CD8
+ T-celle-responser overfor p53 er sterkt styrt
in vivo
.
Materialer og metoder
pasienter og sunne givernes prøver
PBMC og serum ble oppnådd fra eggstokkreft pasienter ved Roswell Park Cancer Institute, under en godkjent protokoll fra Institutional Review Board. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. PBMC og serum fra friske donorer ble erholdt fra New York Blood Center.
Måling av serum p53-spesifikke antistoff
Rekombinant villtype p53 ble produsert og p53-spesifikke serum-antistoffnivået ble målt tidligere beskrevet [20]. En gjensidig titer ble estimert fra målinger optisk tetthet på serielt fortynnede prøver og kontroller som beskrevet [20].
Overlappende peptider
Sekvenser av overlappende peptider fra villtype p53 protein som brukes for presensitization og deteksjon er vist i tabell S1. Alle peptider ble syntetisert ved Biosyntese (Lewisville, TX) og ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved 10 mM konsentrasjon og lagret ved -80 ° C. De ble utformet for å være 25 aminosyre lengde, bortsett fra # 1 (19-mer) og # 30 (22-mer), og har 15 aminosyre overlapper. Aminosyre for kodon 72 av villtype p53 viser ofte Arg Pro til polymorfisme [27]. For å håndtere dette polymorphism, to forskjellige peptider med Arg eller Pro i posisjon 72 ble utarbeidet for peptid # 6 og ble blandet på en 1:01 ratio.
Presensitization
In vitro
presensitization ble utført som tidligere beskrevet [28]. CD8
+ og CD4
+ T-celler ble skilt fra PBMC ved hjelp Dynabeads (Invitrogen-Dynal AS) og ble uavhengig stimulert med CD8
-CD4
– celler som ble pulsert over natten med en pool ( # 1 # 30), 2 bassenger (# 1- # 15 og # 16- # 30), eller 3 bassenger (# 1- # 10, # 11- # 20 og # 21- # 30) av overlappende peptider i henhold til antallet celler etter separasjon og bestrålt. Cellekulturer ble supplert med 10 U /ml IL-2 og 20 ng /ml IL-7 ganger i uken. Parallelt ble en del av CD4
+ T-celler ble polyclonally utvidet med fytohemagglutinin (PHA, Remel) i nærvær av lavdose IL-2 og IL-7, for å bli brukt som målceller (T-APC) i ELISPOT analyse. I noen eksperimenter, CD4
+ T-celler ble ytterligere separert i CD45RA
+ og CD45RA
– undergrupper av fykoerytrin (PE) -konjugert anti-CD45RA monoklonalt antistoff (mAb) (BD Biosciences) og anti-PE -magnetic perler (Miltenyi Biotec).
Påvisning av p53-spesifikk T-celle respons
p53-spesifikk IFN-γ produksjonen ble evaluert av ELISPOT-analysen ved dag 9-12 for CD8
+ T-celler og dag 18-25 for CD4
+ T-celler. Først, ble T-celler evaluert for deres reaktivitet mot 6 dammer av 5 peptider (# 1- # 5, # 6 # 10, etc.). I noen eksperimenter, ble en pool av 17 overlappende peptider fra NY-ESO-en brukes som irrelevante peptider. Hvis IFN-γ produksjon ble detektert mot noen av peptid-ansamlinger ble selvstendige peptider i bassenget testes for å fastslå et enkelt peptid gjenkjent. Alle resultater fra ELISPOT-analyser ble presentert som gjennomsnittlig antall IFN-γ spot-dannende celler fra to brønner uten å trekke antallet bakgrunns flekker mot unpulsed målceller. Responser ble betraktet som positive hvis antallet flekker mot peptid (er) -pulsed målceller var 3 ganger mer enn det mot unpulsed målceller og mer enn 25 flekker /50000 effektor-T-celler. For noen pasienter, ble p53-spesifikke T-celler påvises ved intracellulær cytokin farging og CD107a uttrykk analyser. Intracellulær cytokin farging for IFN-γ, IL-4 og TNF-α ble utført som beskrevet tidligere [28]. For CD107a uttrykk assays, presensitized CD8
+ T-celler ble stimulert på nytt i nærvær av 40 ul /ml PE-konjugert anti-CD107a mAb (BD Biosciences) og 0,66 ul /ml GolgiStop (BD Biosciences). I noen eksperimenter ble p53-peptid-spesifikke CD4
+ T-celler isolert ved flow-cytometrisk sortering av CD154 uttrykkende celler etter restimulering med p53-peptider og de ble polyclonally utvidet med PHA som tidligere beskrevet [28]. Anerkjennelse av naturlig behandlet p53 protein og cytokin produksjon av p53-spesifikke CD4
+ T-cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av autologe moncyttavledede dendrittiske celler (mo-DCS) pre-pulset over natten med p53 overlappende peptider (3,3 mm), rekombinant p53-protein (20 pg /ml) eller kontroll NY-ESO-1-protein (20 pg /ml). Cytokin-nivåer i supernatantene ble målt ved sandwich-ELISA ved anvendelse av følgende mAb par: umerket og biotinylert-anti-IFN-γ (BD Biosciences), umerket og biotinylerte-anti-GM-CSF-mAb (BD Biosciences), umerket og biotinylert-anti -il-4 mAbs (BD Biosciences), umerket og biotinylert-anti-IL-13 mAb (eBioscience), umerket og biotinylert-anti-IL-10 mAb (eBioscience), umerket og biotinylert-anti-TGF-p-mAb (eBioscience umerkede), og biotinylerte-anti-IL-17-mAb (eBioscience), og umerkede og biotinylert-anti-IL-9-mAb (eBioscience). Standard cytokin proteiner ble hentet fra eBioscience.
Resultater
Anti-p53 antistoffrespons
For å evaluere spontan immunitet mot p53, vi målt serum antistofftitre mot p53 og NY-ESO -1 proteiner i 298 avanserte epiteliale kreftpasienter på eggstokkene og 153 friske personer med ELISA. Som vist i figur 1, 21% av pasientene, men ingen av de friske individer viste betydelig anti-p53-serum-antistoff, som var svært lik frekvensen av anti-NY-ESO-1-antistoffresponser observert (21%). Disse frekvenser av spontan antistoffresponser mot p53 og NY-ESO-1 er i området av de som er rapportert for ovarian cancer pasienter i ulike studier [29]. I motsetning til dette, et mindre antall pasienter (7%) viste signifikant serum-antistoff mot kreft /testikkel antigen MAGE-A3 (data ikke vist). Hyppigheten av pasienter som viste både NY-ESO-1 og p53-serum antistoff var 4,7%, som ligger i nærheten av den beregnede frekvens fra frekvensene mot hverandre antigen forutsatt at induksjonen av disse responsene er uavhengig (0,21 (21% mot p53) x 0,21 (21% mot NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% mot begge antigener)).
Sera fra 298 ovarian cancer-pasienter og 153 friske individer ble evaluert med hensyn på antistoff mot villtype p53 og NY -ESO-1-proteiner ved hjelp av ELISA. Gjensidig titere beregnes som beskrevet i referanse [20].
Ikke målbart spontan CD8
+ T-cellerespons hos kreftpasienter og friske donorer
For immunomonitoring av spontan T celle responser, er det viktig å velge en metode som kan skille
in vivo
-primed T-celler fra
in vitro
-indusert T-celler. For å overvåke spontant-induserte T-celle responser mot p53, vi ansatt en enkelt
in vitro
allergi protokoll som har blitt utviklet og validert for å oppdage spontane NY-ESO-1-spesifikke T-celle responser bare i NY-ESO- 1 seropositive kreftpasienter, men ikke hos friske individer. Ved hjelp av denne protokollen, NY-ESO-1-spesifikke CD8
+ T-celler ble ofte detektert fra NY-ESO-1 seropositive eggstokkkreftpasienter, men ikke fra friske individer i denne studien kohort (figur S1 (A)). I kontrast, kan flere runder med stimulering av profesjonelle antigen prosesserings celler (APC) som mo-DC indusere NY-ESO-1-spesifikke T-celler fra naive NY-ESO-1-spesifikke forløpere hos friske donorer [30], [31 ]. På grunn av den hyppige forekomsten av spontan serum antistoff mot p53 i eggstokkene kreftpasienter, vi først analysert p53 spesifikke CD8
+ T-celle responser hos disse pasientene. Fra det funn at spontane NY-ESO-1-spesifikke T-celler kan påvises bare i seropositive pasienter ble 12 eggstokkkreftpasienter med spontan antistoffresponser mot p53 valgt for vurdering av T-celle-responser. CD8
+ og CD4
+ T-celler ble isolert fra PBMC som beskrevet i materialer og metoder, og de ble separat stimulert med p53 peptid-pulset CD4
-CD8
– celler. Etter dyrking i ca 10 dager, ble antallet av IFN-γ-produserende p53-spesifikke CD8
+ T-celler bedømt ved ELISPOT-analyse. Som vist i figur 2A, to representative seropositive pasienter viste ingen påvisbar anti-p53-CD8
+ T-cellerespons ved vår standard immunomonitoring protokoll. Tilsvarende ingen signifikant IFN-γ produksjon fra CD8
+ T-celler ble påvist fra 10 flere seropositive pasienter (figur 2B). Ti seronegative ovarian cancer-pasienter og 12 friske donorer ble også testet med hensyn til deres spontane CD8
+ T-cellerespons mot p53 og som forventet, var det ingen indikasjon på p53-spesifikke CD8
+ T-celler (figur 2B). Det er mulig at p53-spesifikke CD8
+ T-celler som mangler IFN-γ-produserende evne, og at de kan påvises ved ekspresjon av andre molekyler. For å teste om p53 spesifikke CD8
+ T-celler kunne påvises av andre aktiverings-indusert molekyler, 5 seropositive og 5 seronegative pasienter ble analysert for TNF-α produksjon og CD107a uttrykk etter restimulering med peptider. Som vist i figur 2C, ikke p53-spesifikke CD8
+ T-cellerespons ble detektert på grunnlag av TNF-α og CD107a uttrykk.
(A) CD8
+ T-celler fra antistoff-positiv kreft i eggstokkene pasienter ble presensitized med en pool av 30 p53 overlappende peptider. Etter 9-12 dager ble p53-spesifikke IFN-γ produserende T-celler bedømt ved ELISPOT-analyser. Feilfelt representerer standardavvik (SD) av to brønner. Autolog T-APC ble anvendt som målceller i ELISPOT-analyser. (B) CD8
+ T-celle responser i 7 seropositive og 5 seronegative kreftpasienter på eggstokkene og 12 friske givere er vist. (C) Presensitized CD8
+ T-celler ble analysert ved intracellulær TNF-α flekker og CD107a uttrykk analyser etter restimulering med p53-peptider-pulserende, irrelevante (NY-ESO-1) peptider-pulserende eller unpulsed målceller.
Disse resultater indikerer at spontan IFN-γ-produserende CD8
+ T-cellerespons mot villtype p53 var ikke påvisbar selv i seropositive kreftpasienter etter vår presensitization protokoll i motsetning til den hyppige påvisning av NY -ESO-1-spesifikke CD8
+ -T-celleresponser i NY-ESO-1-seropositive pasienter (fig S1 (A)). Akkumulering av mutert p53-proteinet i tumorceller er kjent for å korrelere med antistoffrespons [32]. Siden muterte peptider anses å være immunogent grunn av fravær av toleranse og immunogenisitet av mutant p53 induserer CD8
+ T-celleresponser ble påvist i mus [33], [34], vi neste søkt CD8
+ T-celle- responser mot mutert p53. For å gjøre dette, ble eksoner 5-7 av p53-genet fra tumorvev og normale lymfocytter i ovarier kreftpasienter sekvensert for å identifisere potensielle p53 mutasjoner i tumor (data ikke vist). Blant de mutasjonene oppdaget, tre hyppig forekommende mutasjoner, S127F, R273C, og R282W, ble valgt ut til å lete etter spesifikke CD8
+ T-cellerespons mot epitoper som omfatter disse mutasjonene. CD8
+ T-celler fra tre pasienter som hadde tumor med S127F, R273C eller R282W mutasjon ble stimulert med peptider inneholdende pasientens p53 mutasjon eller med peptider inneholdende det tilsvarende villtype-sekvensen. Ingen mutert peptid-spesifikke CD8
+ T-cellerespons ble detektert hos disse tre pasienter (data ikke vist).
CD4
+ T-celleresponser hos kreftpasienter og friske individer
For å detektere naturlig forekommende CD4-
+ T-cellerespons mot p53, CD4
+ T-celler fra seropositive kreftpasienter ble stimulert med overlappende peptider pulsert på autologe T-celle-fratatte PBMC anvendt som APCer. Etter 20 dagers dyrking i nærvær av lavdose IL-2 og IL-7, IFN-γ-produserende CD4
+ T-celler ble nummerert ved ELISPOT-analyse mot subpools av overlappende peptider og deretter mot enkelte peptider fra reaktive subpools . I motsetning til den ikke-detekterbar p53-spesifikke CD8
+ T-celler, betydelig IFN-γ-produserende p53-spesifikke CD4
+ T-celle responser på subpools av overlappende peptider ble funnet i 6 av 12 seropositive pasienter (figur 3A og data ikke vist), med tilsvarende størrelse til spontan CD4
+ T-cellerespons mot NY-ESO-1 i NY-ESO-1 seropositive kreftpasienter eggstokk i denne studien kohort (fig S1 (B)). Vi evaluerte neste spontan CD4
+ T-celle responser mot p53 i 10 seronegative pasienter og 12 friske individer. Overraskende, selv om vår presensitization metoden ikke detektere NY-ESO-1-spesifikke CD4
+ T-celler i friske individer (fig S1 (B)), den samme prosedyre detektert signifikant IFN-γ-produserende CD4
+ T celle responser i 5/10 seronegative pasienter og 9/12 friske individer testet (Tall 3B og C og data ikke vist). I utvalgte pasienter, p53-spesifikke CD4
+ T-celler kunne påvises ved TNF-α produksjon følgende intracellulære cytokin-farging (figur S2).
CD4
+ T-celler fra antistoff positiv (A) og negativ (B) eggstokkreft kreftpasienter og friske donorer (C) ble presensitized med basseng (r) av p53 overlappende peptider. Etter 18-25 dager, ble p53-spesifikk IFN-γ produserende T-celler vurdert mot peptid-pulset eller unpulsed (
φ
) målceller ved ELISPOT-analyser. Feilfelt representerer SD av to brønner. Autolog T-APC ble anvendt som målceller i ELISPOT-analyser. T-celle responser ble først vurdert opp mot subpools av peptider (første assay) og deretter mot uavhengig peptid i en reaktiv subpool (andre assay). For frisk donor vist i (C), gjorde CD4
+ T-celler som ble presensitized med # 1 # 10 eller # 21- # 30 peptid viser ingen signifikante responser (data ikke vist).
Figur 4 oppsummerer epitoper gjenkjent av CD4
+ T-celler fra seropositive og seronegative kreftpasienter og friske donorer. Som vist i figur 4, ble epitoper som finnes i både seropositive og seronegative kreftpasienter og friske donorer fordelt over hele sekvensen av p53-proteinet. Visse peptider som # 9, # 13 og # 26 indusert hyppigere CD4
+ T-celleresponser i 4 (20% av respondere), 6 (30%) og 7 (35%) donorer, henholdsvis. Noen seronegative kreftpasienter og friske donorer viste multiple epitop-spesifikke CD4
+ T-celle responser, slik det fremgår av seropositive kreftpasienter. For å vurdere hyppig observert polymorfisme på et kodon 72, brukte vi en blanding av to variant peptider for peptid # 6 (tabell S1), som kan indusere
de novo
responser hos individer med en p53 homozygot genotype på et kodon 72. det ble imidlertid ingen T-celle respons mot # 6 peptider påvist i denne studien indikerer at våre kortsiktige kultur protokollen ikke synes å indusere
de novo
CD4
+ T-celle responser. Omfanget av tiltak og fordeling av epitoper var like i kreftpasienter og friske individer. Det er vel kjent at epitoper som gjenkjennes av p53-spesifikt antistoff er begrenset til den N-terminale og C-terminale region av proteinet [32], [35]. Det var imidlertid ingen sammenheng mellom kart epitoper for CD4
+ T-celler og antistoffer (figur 4). I tillegg er mutasjon av p53-proteinet i cancerceller som ofte finnes i den sentrale regionen av genet [32]. Imidlertid var det ingen overrepresentasjon av CD4
+ T-celle-epitoper i denne regionen, noe som tyder på at svarene ikke ble formidlet av kryssreaktivitet av muterte peptid-spesifikke CD4
+ T-celler. For å finne mutasjonsspesifikk CD4
+ -T-celler i tre pasienter med mutert p53-uttrykkende tumor, ble CD4
+ T-celler fra pasienter presensitized med peptider inneholdende pasientens beslektet mutasjon. Selv om en pasient med tumor hadde S127F mutasjon viste svake CD4
+ T-cellerespons mot både muterte og tilsvarende vill-type peptider, kunne ingen signifikant mutasjonsspesifikk CD4
+ T-cellerespons skal påvises (resultater ikke vist).
størrelsen på CD4
+ T-celle responser i eggstokkreft pasienter med eller uten p53-spesifikt serum antistoff og friske donorer mot p53 overlappende peptider er plottet. Hvert symbol representerer ett individ. Alle svar vist var betydelig i forhold til antall bakgrunns flekker. 6/12 seropositive (rosa symboler) og 5/10 seronegative (blå symboler) eggstokkreft kreftpasienter og 9/12 friske individer (svarte symboler) viste positiv CD4
+ T celle responser mot p53 peptid-pulset målceller sammenlignet med unpulsed målceller.
stammer repertoar av p53-spesifikke CD4
+ T-celler
i motsetning til påvisning av p53-spesifikke CD4 + T-celler i seropositive og seronegative kreftpasienter så vel som hos friske donorer, vår presensitization protokollen tillater bare registrering av NY-ESO-1-spesifikke IFN-γ-produserende CD4
+ T-celler i NY-ESO-1 seropositive kreftpasienter, men ikke i seronegative kreftpasienter og friske individer når PBMC-avledet hele CD4
+ T-celler er presensitized med NY-ESO-1 overlappende peptider. Men vi nylig rapportert at NY-ESO-1-spesifikk CD4
+ T-celler kan bli indusert fra CD45RA
+ naive CD4
+ T celler i friske givere etter
in vitro
presensitization ved å fjerne CD25
+ regulatoriske T-celler [36], [37]. Disse resultatene indikerer at NY-ESO-1-spesifikke CD4
+ T-celleforløpere som er tilstede i friske individer er mottagelige for undertrykkelse av regulatoriske T-celler, men i kreftpasienter,
in vivo
-primed NY-ESO -1-spesifikke CD4
+ T-celler blir resistente mot denne undertrykkelsen [36], [37]. Påvisning av IFN-γ-sekresjon p53-spesifikke CD4
+ T celler i friske individer etter en enkelt
in vitro
sensibilisering i nærvær av regulatoriske T-celler antyder at de allerede primet
in vivo
. For å bestemme aktiveringsstatusen til p53-spesifikke CD4
+ T-celler hos friske donorer, naive og antigen-opplevd CD4
+ T-celler ble separert basert på CD45RA uttrykk og ble stimulert med p53 overlappende peptider. Induksjon av p53-spesifikke CD4
+ T-celler ble evaluert ved ELISPOT-analyser. Som vist på figurene 5A og 5B, i motsetning til det som tidligere er observert med NY-ESO-1-spesifikke CD4
+ T-celler, p53-spesifikke IFN-γ-produserende CD4
+ T-celler kunne påvises fra en CD45RA
– antigen-erfarne befolkningen friske givere. I tillegg ble mindre responser også indusert fra CD45RA
+ naive T-cellepopulasjon (figur 5A). Fordi CD45RA er ikke et absolutt markør for naive T-celler, er det fremdeles en mulighet for at p53-spesifikke CD4
+ T-celler i CD45RA
+ -T-cellepopulasjonen var allerede aktivert
in vivo product: [ ,,,0],38]. Imidlertid, indikerte dette resultatet at i det minste en del av p53-spesifikke CD4
+ T-celler er blitt primet
in vivo
selv hos friske individer.
(A-B)
In vivo
grunning av p53-spesifikke CD4
+ T-celler hos friske individer. CD4
+ CD45RA
+ naive og CD4
+ CD45RA
– antigen-erfaren T-celler ble isolert ved flowcytometri og presensitized med p53 overlappende peptider. Etter 20 dager ble p53-spesifikke IFN-y-produserende T-celler bedømt ved ELISPOT-analyser. Autolog T-APC ble anvendt som APC. (C) Gjenkjennelse av naturlig behandlet p53-protein. p53-spesifikke CD4
+ T-cellelinjer mot p53 # 1 # 15 peptider basseng eller # 16- # 30 peptider bassenget var etablert fra 3 friske donorer som beskrevet i materialer og metoder. De ble stimulert av autolog mo-DC pre-pulset med p53 peptider, p53 protein, eller NY-ESO-1 protein. IFN-γ produksjon ble evaluert ved ELISPOT-analyser (venstre) og ELISA (til høyre). Feilfelt representerer SD av to brønner.
Karakterisering av p53-spesifikke CD4
+ T-celler
For ytterligere å karakterisere p53-spesifikke CD4
+ T-celler i friske givere, p53-spesifikke T-cellelinjer ble generert ved å isolere CD154 som uttrykker CD4:
+ T-celler etter restimulering med p53-peptider fulgt av polyklonal ekspansjon med PHA (data ikke vist). Dette CD154 ekspresjon basert metode ble anvendt for å påvise multiple CD4
+ T-celleundersett for analyse av cytokin produksjon av mønsteret [28]. Fire CD4
+ T-cellelinjer ble generert mot p53 peptid bassengene fra 3 friske donorer. Alle CD4
+ T-cellelinjer spesielt produsert GM-CSF, som er fremstilt av både Th1 og Th2-celler etter stimulering med peptid-pulset DC-mo (tabell 1). Nivåer av andre cytokiner produsert av CD4
+ T-cellelinjer er vist i tabell 1. I samsvar med effektiv deteksjon av p53-spesifikke CD4
+ T-celler etter IFN-y ELISPOT-analyser, som alle p53-spesifikke CD4
+ T-cellelinjer fra friske donorer produsert store mengder IFN-γ. I tillegg til IFN-γ, betydelige nivåer av IL-13 og små mengder av IL-4 ble også spesifikt produsert, noe som indikerer at T-cellelinjer var en blanding av Th1 og Th2-celler. To CD4
+ T-cellelinjer produserte små nivåer av immunregulerende cytokin, IL-10. En CD4
+ T-cellelinje produsert små, men signifikante nivåer av IL-9, som er produsert ved Th9 og er regulert ved IL-4 og TGF-β, potensielt indikerer tilstedeværelse av TGF-β signalering i løpet av differensieringen av p53 -spesifikke CD4
+ T-celler. Imidlertid produksjon av TGF-β ble ikke påvist i supernatanten (data ikke vist). I tillegg har IL-17, som produseres ved Th17, ble ikke påvist i noen CD4
+ T-cellelinjer (data ikke vist). Deretter ble anerkjennelsen av naturlig behandlet p53 protein undersøkt ved hjelp av autolog mo-DC som APC. Som vist i figur 5C, alt CD4
+ T-cellelinjer effektivt gjenkjent p53 protein-pulset målceller som påvises av IFN-γ sekresjon. Dette resultatet demonstrerer p53-spesifikke CD4
+ T-celler påvises hos friske donorer er i stand til å gjenkjenne naturlig behandlet p53-protein, og som gjør det usannsynlig at de er aktivert
in vivo
av andre proteiner med lignende sekvenser.
Diskusjoner
Opphopning av mutert p53 protein i svulsten er ofte observert på mange typer svulster og induserer humorale immunresponser, noe som viser sterk immunogenisitet av p53 [12]. Således har p53 vært betraktet som et lovende mål for vaksinering mot flere typer kreft. Likevel, rapporterer vi her unnlatelse av å detektere
in vivo
-primed p53-spesifikke CD8
+ T-celleresponser hos kreftpasienter med spontane antistoffer mot p53, så vel som i p53-seronegative pasienter og friske donorer ved hjelp av vår singel
in vitro
sensibilisering protokollen. I motsetning til dette den samme protokoll ofte detektert NY-ESO-1-spesifikke CD8
+ T-celler i NY-ESO-1-seropositive kreftpasienter i samme studiekohorten, hvilket indikerer at naturlig immunogenisitet å fremkalle spontan CD8
+ T-celleresponser kan være forskjellige i p53 og NY-ESO-1 til og med i seropositive pasienter for disse antigener. Det ble rapportert at selv om cyklin B1-spesifikke CD8
+ T-celler ble påvisbar etter en enkelt
in vitro stimulering
, p53-spesifikke CD8
+ T celler mot seks HLA-A * 02 binding korte peptider kunne ikke påvises i 5 cyklin B1-reaktivt og 5 ikke-reaktive pasienter ved anvendelse av samme metode [39]. Våre resultater utvide sine observasjoner ved å overvåke CD8
+ T celle responser til hele regionen av proteinet ved hjelp av overlappende peptider og ved å inkludere med immunomonitoring av spontan antistoff og CD4
+ T-celle responser. Flere vaksineforsøk som p53-transduserte DC eller lange overlappende peptider har rapportert induksjon av T-celle responser med begrenset klinisk nytte [23], [24], [40], [41].
