Abstract
Effekten av kjemoterapi av magekreft (GC) er fortsatt svært dårlig på grunn av multiresistens (MDR). Imidlertid er mekanismene bak MDR av GC fortsatt langt fra fullt ut forstått. Målet med denne studien er å belyse mulige mekanismer av MDR av GC i hovedsak den lange ikke-kodende RNA (lncRNA) nivå. I denne studien ble GC cellelinje, SGC7901, og to MDR underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR utsatt for en lncRNA microarray analyse. Bioinformatikk og verifikasjons eksperimenter ble utført for å undersøke mulige lncRNAs involvert i utviklingen av MDR. Pathway analyse indikerte at 15 veier samsvarer nedregulert transkripsjoner og at 20 veier samsvarer oppregulert transkripsjoner (p-verdi cut-off er 0,05). GÅ analyse viste at de høyeste beriket GOs målrettet av oppregulert transkripsjoner var «systemutvikling» og de høyeste esenriched GOs målrettet av de nedregulert transkripsjoner var «sterol biosyntetiske prosess». Vår studie er den første til å avhøre forskjellig uttrykt lncRNAs i human GC cellelinje og MDR underlinjer og indikerer at lncRNAs er verdt for videre studier for å være de nye kandidat biomarkører for klinisk diagnose av MDR og potensielle mål for videre behandling.
Citation: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Vifte D, Xu P, et al. (2015) multi Resistance Relaterte Long ikke-kodende RNA Expression Profil Analyse av magekreft. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 24 desember 2014; Godkjent: 22 juli 2015; Publisert: 20 august 2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All rå data og normaliserte data ble vist i https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National program på Key Basic Research Project ( «973» program, nr 2010CB529302, nr 2010CB529305, nr 2010CB529306); Foundation National Natural Science of China (nr 81301763); Henan provinsielle viktige vitenskapelige og teknologiske prosjekter (nr 142 102 310 473); Key Program, Foundation National Natural Science of China (nr 81030044)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens ( MDR) forblir en stor hindring for kjemoterapi svikt ved behandling av magekreft, som er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Flere multiresistens-assosierte proteiner (maskinlesbart pass) [1] eller mirnas [2] som megle MDR gjennom ulike mekanismer har tidligere blitt identifisert. Imidlertid er mekanismene bak MDR av GC fortsatt langt fra fullt ut klart.
genom-sekvensering viste at eukaryote genomer kode for et overraskende stort antall av ikke-kodende transkripter sammenlignet med prokaryote genomer. Blant disse ikke-kodende transkripsjoner, mange er lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) som spiller viktige roller i regulering av mRNA transkripsjon eller oversettelse ved transkripsjons eller post-transkripsjon nivåer. lncRNAs er RNA som mangler koding potensial, som er 200 bp og står for minst 80% av transkripsjoner av hele genomet [3]. Samler data indikerer at lncRNA spiller viktige roller i regulering av mRNA [4], organ biogenesis [5], den subcellulære smugling av molekyler [6], og celleutvikling [7] [8].
LncRNA feilregulering var involvert i flere typer sykdommer, inkludert kreft
[
4
,
9
,
10
]. Nemlig, kan lncRNAs spiller viktige roller i kreftutvikling, metastasering og invasivitet av flere ondartede svulster gjennom å påvirke onkogen uttrykk. For eksempel kan COX-2-lncRNA, PACER, fungere som en ny potensielt mål for COX-2-modulasjon i betennelse og kreft [11]; RNAi-mediert knock-down av LINC01081 i normal foster lunge fibroblaster viste at dette lncRNA positivt regulerer FOXF1 avskrift nivå, videre indikerer at nedgangen i LINC01081 uttrykk kan bidra til utvikling av alveolar kapillært dysplasi med forskyvning av lungevenene [12]; lncRNA hotair kan også være en verdifull prediktor for tykktarmskreft administrasjon [13] og MALAT1 kan betraktes som en potensiell prognostisk indikator, og kan være et mål for diagnose og genterapi for pankreasgang adenokarsinom [14]; overekspresjon av lncRNA H19 øker kreftutvikling og metastasering av magekreft og effekten av H19 i GC er formidlet ved direkte oppregulering av ISM1 og indirekte undertrykkelse av CALN1 uttrykk via MIR-675 [15]. Derfor, for å få foreløpige innsikt i de molekylære mekanismene for MDR av GC, vi studerte lncRNA uttrykk profilen til GC MDR underlinjer.
Her har vi studert differensielt uttrykk profiler av lncRNAs og mRNA mellom GC cellline SGC7901 og MDR underlinjer SGC7901 /ADR og SGC7901 /video ved hjelp lncRNA microarray analyse. Sammenligning av forskjellig uttrykt transkripsjoner mellom underlinjer og foreldre cellline avslørte 15 veier som tilsvarte nedregulert utskrifter og 20 veier som tilsvarte oppregulert transkripsjoner (p-verdi cut-off var 0,05). Gene ontologi (GO) analyse viste at de mest høyanriket GO vilkår for oppregulert transkripsjoner var «systemutvikling», «nucleosome», og «bindende» og de høyanriket GO vilkår for nedregulert transkripsjoner var «sterol biosyntetiske prosess «,» celle periferi »og« steroid dehydrogenase aktivitet «. Våre resultater viste at lncRNA og mRNA uttrykk profiler signifikant forskjellig mellom MDR underlinjer og foreldre celline. Dette funn tyder på at de avvikende ekspresjonsnivåene av lncRNAs kan bidra til utviklingen av MDR av GC. Videre studier av forskjellene i lncRNA uttrykk profiler kan gi nye potensielle metoder for å reversere MDR fenotype av GC.
Resultater
uttrykt forskjellig lncRNAs
highthroghput lncRNA microarray data viste en totalt 27,883 lncRNAs uttrykt i magekreft cellline, SGC7901 og to multi motstand underlinjer, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR (S1 tabell). Å antyde forholdet mellom prøvene, ble hierarkisk clustering analyse brukes til å arrangere celllines inn i grupper etter deres uttrykk nivåer, presentere relasjonene til de lncRNA uttrykksmåter mellom celllines (Fig 1A og 1B). Videre studier av disse dataene viste et gjennomsnitt på 1637 forskjellig uttrykt lncRNA. Blant dem, 638 var konsekvent oppregulert og 999 ble konsekvent nedregulert (fold change≥2.0) (S2 tabell). ASHG19A3A028863 (endring: 146,0139) var den mest oppregulert lncRNA, og ASHG19A3A007184 (endring: 58,7105) var den mest nedregulert lncRNA. Videre nedregulert lncRNAs var mer vanlig enn oppregulert lncRNAs i våre microarray data (S2 tabell).
A. Den scatterplot av lncRNA uttrykk profil. B. Heat kart og hierarkisk clustering dendrogram av lncRNA chips.
forskjellig uttrykt mRNA
Det var 19,644 mRNA identifisert i GC MDR underlinjer analysert av mRNA uttrykk for profilering av data ved hjelp av microarray analyse og den hierarkiske clustering analysen presenteres forholdet mellom de mRNA uttrykk moduser som var til stede i GC MDR underlinjer og foreldre celline (fig 2A og 2B) (S3 tabell). Blant de forskjellig uttrykt mRNA mellom SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR og SGC7901, 730 var konsekvent oppregulert og 650 var konsekvent nedregulert i SGC7901 /ADR og SGC7901 /video celllines sammenlignet med SGC7901 (Fig 2B). (S4 tabell). NM_000735 (genet symbol: CGA, fold endring: 106,19) var den mest oppregulert mRNA, og NM_001136574 (genet symbol: LANCL1, brett endring: 25,43) var den mest nedregulert mRNA (fig 2B)
A. Heat kart og hierarkisk clustering dendrogram av mRNA chips. B. Skjema som viser de 10 beste forskjellig uttrykt mRNA.
GO analyse
For å bestemme gen og genprodukt attributter i biologiske prosesser, cellulære komponenter og molekylære funksjoner, Gene ontologi (GO) analysen ble utført med dette. Fishers eksakte test er gjort for å teste om det er mer overlapping mellom DE listen og GO annotering listen enn det som ville være forventet ved en tilfeldighet. P-verdien angir betydningen av GO vilkår berikelse i DE gener. Jo lavere p-verdi, jo mer betydnings GO Term (p-verdi = 0,05 anbefales). Den viste at de høyeste beriket GOs målrettet av oppregulert transkripsjoner var vev homeostase (GO: 0048731, ontologi: biologisk prosess; p = 6.84E-08) (figur 3A), nucleosome (GO: 0000786, ontologi: cellulær komponent; p = 2.10E-07) (figur 3B) og binding (GO: 0005488, ontologi: molekylær funksjon; p = 0,001) (fig 3C), og at de høyeste beriket GOs målrettet av de nedregulert transkripsjoner var sterol biosyntetiske prosess (GO: 0016126, ontologi: biologisk prosess; p = 0,000) (fig 3D), celle periferien (GO: 0071944, ontologi: cellulær komponent; p = 3.80E-06) (figur 3E) steroid dehydrogenase aktivitet (GO: 0016229, ontologi: molekylær funksjon;. p = 0,001) (fig 3F) (S5 Table)
Kakediagrammet diagrammet~~POS=HEADCOMP viser de ti beste tellinger av de betydelige berikelse vilkår. Ontologi dekker tre domener: biologisk prosess, Cellular Component og molekylær funksjon. Fishers eksakte test brukes for å finne om det er mer overlapping mellom DE listen og GO annotering listen enn det som ville være forventet ved en tilfeldighet. P-verdien angir betydningen av GO vilkår berikelse i DE gener. Jo lavere p-verdi, jo mer betydnings GO Term (p-verdi = 0,05 anbefales) (AC) De høyeste beriket GOs målrettet av oppregulert transkripsjoner: A, biologisk prosess (BP), B, Cellular komponent ( CC), C, Molecular funksjon (MF). (DF) De høyeste beriket GOs målrettet av nedregulert transkripsjoner: A, biologisk prosess (BP), B, Cellular komponent (CC), C, Molecular funksjon (MF)
Pathway analyse
i denne studien, sti-analyse viste at 20 reaksjonsveier gående tilsvarte oppregulert transkripter, og at de mest anrikede nettverk var «alkoholisme-Homo sapiens (human)» (Fisher-P-verdi = 3.66E-08) komponert av 24 målrettede gener (figur 4A); Videre langs gangveien analysen viste også at 15 veier konsekvent samsvarer nedregulert transkripsjoner og at den mest beriket nettverket var «Steroid biosyntese-Homo sapiens (human)» (Fisher-p-verdi = 0,00044) består av 5 målrettede gener (fig 4B ) (S6 tabell, er det anbefalt p-verdi cut-off 0,05). Blant disse banene har genet kategorien «døgnrytme» avbrudd blitt rapportert å være assosiert med ulike kreftformer, blant annet magekreft [16], kronisk myelogen leukemi [17], hode og nakke plateepitelkarsinom [18], leverkreft [19 ], livmorkreft [20], og brystkreft [21]. Genet kategorien «NOD-lignende reseptor signalveien», som består av NOD1, har blitt vist at NOD1 /CARD4 og NOD2 /CARD15 gen polymorfismer kan være assosiert med endret risiko for gastrisk [22], kolorektal [23], lunge [24 ], laryngeal [25], galleblæren [26], bukspyttkjertel [27], tynntarm, nyre [28], kreft i urinblæren [29], hudkreft, lymfom [30] og leukemi [31]. Her har vi ytterligere undersøkt uttrykk og funksjon av ARNT (aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator) mediert MDR1 (multiresistens 1) oppregulering veien. Det ble funnet at ARNT og MDR1 var signifikant oppregulert i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR-cellelinjer sammenlignet med SGC7901 ble effekten av sterk oppregulering av MDR1 mediert av ARNT ekspresjonsvektoren transfeksjon kompromittert via Sp1 sirnas transfeksjon. Plate kolonidannelse analysen viste at SGC7901 /ADR celle kolonidannelse priser var remarably høyere i pARNT + /siSp1- gruppen sammenlignet med pARNT + /siSp1 + gruppe med adriamycin (ADR) supplement i kulturen Meida (p 0,0001) (fig 5).
(A) Pathway: Alkoholisme-Homo sapiens (human). (B) Pathway: Steroid biosyntese-Homo sapiens (human) .Baren Plottet viser de ti beste Enrichment score (-log10 (P-verdi)) verdien av betydelig berikelse veien. Gul merket noder er forbundet med nedregulert gener, oransje merket noder er forbundet med oppregulert eller bare hele datasett gener, grønne noder har ingen betydning.
(A) uttrykk for ARNT, MDR1 og SP1, en, western blotting, b, QRT-PCR. (B) Effekten av siARNT transfeksjon på uttrykk for ARNT, MDR1 og Sp1, en, western blotting, b, QRT-PCR av SGC7901 /ADR, c, QRT-PCR av SGC7901 /VCR. (C) Effekten av pARNT (ARNT ekspresjonsvektor) og siSp1 transfeksjon på ekspresjon av ARNT, MDR1 og Sp1, en, western blotting, b, QRT-PCR av SGC7901 /ADR. (D) Plate kolonidannelse analysen av SGC7901 /ADR-celler med adriamycin supplement til kulturmediet (1 ug /ml) på det angitte tidspunkt. (Data var hjelp av tre separate forsøk (gjennomsnitt ± SEM), enveis ANOVA analyse, *** p 0,0001)
Real time kvantitativ PCR validering
Å. undersøke microarray data, seks oppregulert lncRNAs og ti under-regulerte lncRNAs ble tilfeldig valgt fra de konsekvent forskjellig uttrykt lncRNAs bruker SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR og SGC7901 cellines og QRT-PCR resultater og microarray data er konsistente (fig 6A ); for å studere uttrykket nivåer av disse lncRNAs i multiresistent mage vev, tjue multiresistent mageprøver og paret ikke multiresistente vev ble undersøkt for uttrykket nivået av disse lncRNAs bruker kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) (fig 6B) .De resultatene viste at magekreft prøvene som er behandlet med ADR i 5 dager oppviste signifikant forskjell av ekspresjonsnivåene av disse seksten lncRNAs afformentioned sammenlignet med kontrollgrupper (figur 6C). Videre korrelasjonsanalyse viste at lncRNA NR_015379 ekspresjonsnivåer var negativt korrelert med inhiberingsgraden av disse tyve medikamentresistente gastriske prøver (figur 6D og 6E, s 0,01).
(A) Seksten lncRNAs ekspresjonsnivåer i SGC7901 /ADR og SGC7901 /video celllines sammenlignet med SGC7901 celline. (B) Skjematisk fremstilling av magekreft prøver behandlet med HDRA fulgt av QRT-PCR og hemming hastighet analyse. (C) Sixteen lncRNAs uttrykk nivåer i tjue magekreft prøver behandlet med ADR sammenlignet med kontrollgrupper. (DE) lncRNA NR_015379 uttrykk nivåer var negativt korrelert med hemming forekomst av magekreft prøver behandlet med ADR.
Diskusjoner
Vår tidligere forskning har allerede funnet ut at Mir-21 kan fremme legemiddelresistens av ulike kreftformer [32 ]; LncRNA-MRUL fremmer ABCB1 uttrykk i multiresistente magekreft celleunderlinjer [33]; CUTL1 aktivitet er omvendt assosiert med medikamentresistens og således er et attraktivt terapeutisk mål for å modulere multimedikamentresistens i magekreft [34]; gastrisk cscs ble identifisert fra VCR-forbehandlet SGC7901 cellelinje, karakterisert ved høy tumorgenisitet og evne til selvfornyelse og differensiering [35]; MAD2 kan spille en viktig rolle i utviklingen av menneskets magekreft og at stanse den MAD2 genet kan bidra til å håndtere multiresistens av magekreftceller [36] og hypoksi-fremkalte MGr1-Ag /37LRP uttrykk aktiveres av HIF-1 avhenger på ERK-aktivering. Disse hendelsene er avhengige av reaktive oksygenmellom [37] .Men, etter
I denne studien, GC cellelinje for multiresistens mekanismer for GC er langt mer belyses og lncRNAs feilregulering av GC MDR underlinjer er ikke undersøkt ennå. , SGC7901, og to MDR underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR ble utsatt for en lncRNA microarray analyse. Bioinformatikk og verifikasjons eksperimenter ble utført for å undersøke mulige lncRNAs involvert i utviklingen av MDR. Pathway analyse indikerte at 15 veier samsvarer nedregulert transkripsjoner og at 20 veier samsvarer oppregulert transkripsjoner (p-verdi cut-off er 0,05). GÅ analyse viste at de høyeste beriket GOs målrettet av oppregulert transkripsjoner var «systemutvikling» og de høyeste esenriched GOs målrettet av de nedregulert transkripsjoner var «sterol biosyntetiske prosess».
Økende bevis viste at lncRNA ( lang ikke-kodende RNA) kan spille viktige roller i karsinogenese og tumorinvasjon og metastase [38]. For eksempel, John [39] etc vist at lncRNA
PCGEM1
er assosiert med prostatakreft; transformerende vekstfaktor-β-indusert lncRNA-Smad7 ble funnet å hemme apoptose av mus brystkreft JygMC (A) celler og således foreslår ed en kompleks mekanisme for regulering av anti-apoptotiske og tumor-progressive aspekter av TGF-β signalering [40] ; lncRNA, prostatakreft-forbundet transkripsjon 29 (PCAT29), ble preget sammen med sitt forhold til androgen reseptor, fungerte som en androgen-regulert tumor suppressor i prostata kreft [41]; Yuan etc oppdaget en ny TGF-β-indusert lncRNA, lncRNA-ATB, som stimulerte EMT gjennom avsette Mir-200s og tilrettelagt kolonisering ved å stabilisere
IL-11
mRNA, og dermed fremme både tidlig og sent trinn av kreft metastase [42].
det er blitt funnet at lncRNAs spille sentral rolle i å endre ekspresjonen av protein-kodende gener via cis- eller trans-mekanismer. Her fant vi at lncRNAs oppregulert i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR sammenlignet med SGC7901lncRNA som AF119893, som var intronic anti å NRP2 (Neuropilin-2). Det har blitt foreslått at NRP2 /VEGF-C-aksen spiller en rolle i blærecancerterapi motstand og VEGF-paxillin-NRP2 veien kunne representere en ny terapeutisk mål for kreft og andre angiogenese-relaterte sykdommer. lncRNA AF461897 var intron sans-overlapping av ABCB9. Dong etc har vist at MIR-31 utøves en anti-apoptotiske virkning mest sannsynlig gjennom hemming av ABCB9 og således tilveiebringe en ny strategi som involverer bruk av MIR-31 som et potensielt mål i NSCLC kjemoterapi. lncRNA BC065904 var intron følelse-overlapping av CTBP2, en av de transkripsjonelle corepressors av C-terminal bindingsprotein (CtBP) familien, som fungerte som en corepressor av E2F7 og som en regulator av DNA-skade respons. lncRNA NR_026900 ble exon følelse-overlapping av QSOX1, som ble vist å redusere proliferasjon, migrering og invasjon av brystcancerceller in vitro og reduserer tumorvekst in vivo.
På den annen side, lncRNAs nedregulert i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR sammenlignet med SGC7901lncRNA som AF113689 var naturlig antisense til RRM1. Khatri etc har rapportert at pre-eksponering av RRM1 siRNA redusert IC50-verdien av gemcitabin-hydroklorid 5 folder i A-549-celler sammenlignet med Gemcitabin-hydroklorid alene, noe som indikerer at RRM1 var en potensiell onkogen av lungekreft. lncRNA uc010iyh var intronic antisense av NAIP (nerveapoptose hemmende protein), som er en av IAP-familien. Det har vist seg at IAP kan være involvert i prostatalidelse (BPH, PIN og PC) utvikling siden kan provosere hemming av apoptose og deretter celleproliferasjon. LncRNA uc003jsd var exon sans-overlapping av PDE4D, dvs. cAMP-spesifikke 3 «, 5»-syklisk fosfodiesterase 4D. Lin osv viste at PDE4D fungerer som en tumor-fremmende faktor, og representerer en unik enzym kan målrettes av kreftceller. LncRNA NR_002332 ble exon følelse-overlapping av ST7, suppressor av tumorgenisitet 7, som har blitt foreslått å være en tumor suppressor-gen i kromosomet region 7q31.1-q31.2.
hovedbane analyse viste mulige veier som er involvert i utviklingen av multimedikamentresistens (MDR) av magekreft. ARNT var en av de 20 banene konsekvent tilsvarte oppregulert transkripsjoner og ble rapportert å være involvert i multiresistens utvikling av flere ondartede svulster [43], inkludert multippelt myelom [44], og AML (akutt myelogen leukemi) [45] . MDR1 koder for P-glykoprotein, som er en energiavhengig pumpe utstrømning som kan eksportere plane hydrofobe molekyler inkludert noen kjemoterapeutiske medikamenter så som adriamycin, cisplatin, taxol og så videre fra cellen [46, 47]. Her fant vi at ARNT og MDR1 var signifikant oppregulert i SGC7901 /ADR og SGC7901 /VHS-cellelinjer compacared til SGC7901, effekten av betydelig oppregulering av MDR1 mediert av ARNT ekspresjonsvektor transfeksjon ble kompromittert via SP1 sirnas transfeksjon, som indikert rollen ARNT-MDR1pathway i MDR fenotypen av magekreft.
Videre undersøkelser viste at noen proteinkodende gener som er involvert i legemiddelresistens fenotype og utvikling av ondartede svulster kanskje var cis-regulert av korrelerte lncRNAs . For eksempel ABCB1 (ATP-bindende kassett, sub-familie B (MDR /TAP), medlem 1, P-glykoprotein (P-gp) koding genet), som ligger 400KB oppstrøms lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-relaterte og opp- regulert lncRNA), var signifikant oppregulert gjennom en potensiell forbedring lignende rolle MRUL og fremmet resistens fenotype av SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR celler [33]; ADAM22, en kandidat genet for malign transformasjon av ovarial endometriose [48], ble korrelert med lncRNA AL133090 i et ekson forstand-overlappende måte; PLCG1 var korrelert med lncRNA AK021471 i et intron forstand-overlappende måte og tilbakevendende mutasjoner i PLCG1 ble identifisert i angiosarcomas [49]; FYN var korrelert med lncRNA AK AK090692 i et intron forstand-overlappende måte og antagomir-1290 undertrykker CD133 (+) celler i ikke-småcellet lungekreft ved å målrette Fyn relaterte Src familien tyrosinkinase [50] osv
Denne studien viste at deregulering av lncRNAs var involvert med utviklingen av multiresistens phynotype av magekreft. Videre analyse av disse lncRNAs og tilhørende veier kan gi innsikt i mekanismene for kjemoterapi narkotika motstand av magekreft og gi nye retninger for omvendt multiresistens phynotype.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle de eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle pasientprøver.
Cellelinjer og cellekultur
Den menneskelige GC cellelinje SGC7901 ble hentet fra Academy of Military Medical Science (Beijing, Kina). To multiresistente underlinjer, SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR, ble utviklet i vårt laboratorium [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR og SGC7901 ble dyrket i RPMI1640 medium (Thermo Scientific Co., USA) som var supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) i en fuktig inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. VCR (1,0 ug /ml) eller ADR (0,5 ug /ml) ble tilsatt til kulturmediet av de passende celler for å opprettholde medikament-resistente fenotype.
RNA isolering, merking og hybridisering matrise
Total RNA ble høstet fra SGC7901, SGC7901 /ADR og SGC7901 /videospiller med TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA) og RNeasy Kit (Qiagen Co, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner, inkludert en DNase fordøyelse trinn. Total RNA fra hver cellline ble kvantifisert ved anvendelse av et Nanodrop ND-1000 (OD 260 nm, Nanodrop, Wilmington, DE), RNA integritet ble bedømt ved hjelp av standard denaturerende agarosegel-elektroforese, og renheten ble bedømt ved forholdet mellom absorbans ved 260 nm for å 280 nm (A260 /A280). Dobbel tråd cDNA (ds-cDNA) ble syntetisert ved anvendelse av 5 mikrogram total RNA ved en Invitrogen Superscript ds-cDNA syntese kit, i nærvær av 100 pmol av oligo dT primere. Deretter ble de ds-cDNA merket, og utført hybridisering som tidligere beskrevet [52]. RNA merking og microarray hybridisering ble utført av KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina.
Highthroughput lncRNA uttrykk profilanalyse
Kvalifisert RNA ble brukt til å syntetisere dobbelt cDNA ved hjelp Hevet Dobbelt cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Dobbeltkjedet cDNA ble merket og hybridisert til den humane LncRNA microarray V2.0 (Arraystar Co. USA). microarray V2.0 inneholder ca 33.000 lncRNAs samlet inn fra autoritative datakilder, inkludert NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs fra litteratur og UCRs. Sekvensene ble valgt med proprietære strategier. Gjenta sekvenser og ncRNAs kortere enn 200 bp ble slettet. For å forbedre statistisk sikkerhet, ble hvert menneske lncRNA utvalg bestående av 60,302 forskjellige sonder (60 mers) og hver transkripsjon var representert ved 1-5 sonder. Hver transkriptet var representert ved en bestemt ekson eller spleise probe for å identifisere individuelle transkripter nøyaktig. Den microarray hibridization og bioinformatiske analyser ble utført ved KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina. Den rå intensitet data og normaliserte data ble vist i Gene Expression Omnibus (GSE69342: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).
Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Den totale RNA av SGC7901, SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA) og ble deretter revers transkribert ved hjelp PrimeScript RT reagens Kit med gDNA Eraser (Perfect real Time) (Takara, Dalian Kina) i henhold til produsentens konstruksjoner. Ekspresjonen av åtte oppregulert lncRNAs og seks nedregulert lncRNAs ble målt ved QRT-PCR ved anvendelse av SYBRGreen assays (Takara, Dalian, Kina) og GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Primerne er angitt i tabell 1. Ekspresjonsnivået av hver lncRNA ble representert som gangers endring ved bruk av 2- △△ Ct metoder. Uttrykket nivået av lncRNAs uttrykt forskjellig mellom SGC7901 og MDR underlinjer SGC7901 /ADR og SGC7901 /VCR ble analysert ved hjelp av t-test med SPSS (versjon 17.0 SPSS Lnc). En verdi på p 0,05 ble betraktet som signifikant.
Histoculture Drug Response analyse (HDRA) Fersk GC svulstvev ble høstet fra hver kirurgisk reseksjon prøven og plassert i en 24-brønns plate. Kuber av kollagen svamp gel (1 cm
3) ble nedsenket i 1 ml RPMI 1640 supplere med 20% føtalt bovint serum. Tumorvev ble plassert på kollagensvamp følgende ADR ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 6 mikrogram /ml, og de ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO2. Tumorvev behandlet med normal saltløsning (N.S) uten ADR ble anvendt som kontroll. Evaluering og beregningsmetoder er som tidligere beskrevet [53]. Inhiberings-graden (IR) av tumorvekst = (1-midlere absorbans av behandlede brønner pr gram tumor /betyr absorbansen til kontrollbrønner pr gram tumor) x 100. I denne studien ble den IR cut-off-verdi som er lik eller større enn 30% (IR30) definert som kjemosensitivitet ifølge innledende studie resultat [54]. Akkurat som beskrevet, bør klinikken patologisk informasjon om svulstvev kilde brukes til HDRA gis henholdsvis ble presentert i tabell 2.
Cellelinjer og kulturforhold
Den menneskelige GC celle linjen SGC7901 ble hentet fra Military Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Multiresistente underlinjer SGC7901 /VCR og SGC7901 /ADR ble utviklet i vårt laboratorium. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, og SGC7901 ble dyrket i RPMI 1640 medium (Thermo Scientific, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (ThermoScientific) i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° C. Vincristin (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO, 1,0 ug /ml) og ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO, 0,5 ug /ml) ble tilsatt til kulturmediet av hensiktsmessige celleunderlinjer til opprettholde multiresistent fenotype
Bygging av pcDNA3.1 (+) -. ARNT plasmid
for å over-express ARNT, pcDNA3.1 (+) – ARNT plasmid ble konstruert. Den menneskelige ARNT cDNA ekspresjonsvektoren (pcDNA3.1 (+) – ARNT) ble konstruert av CW Biotech Co Ltd, Beijing, Kina. I korthet plasmidet pcDNA3.1 (+) – ble ARNT generert i henhold til cDNA-sekvensen fra GenBank. Den ARNT-genet ble dannet ved PCR-amplifikasjon. Plasmidet pcDNA3.1 (+) ble hentet gjennom en Maxi Forberedelse kit (Omega, Georgia, USA). PCR-produktet ble subklonet inn i BamHI (Takara, Mountain View, USA) og Hindlll (Takara) områder av pcDNA3.1 plasmid med T4 ligase (Takara, Mountain View, USA). Den pcDNA3.1 (+) -. ARNT konstruksjon ble bekreftet ved DNA-sekvensering (Invitrogen, Grand Island, USA) (data ikke vist)
Generering av Arnt stabile cellelinjer
SGC7901 /ADR celle ble dyrket i 12-brønners plater med 1,0 x 10
5 celler i hver brønn i en inkubator med konstant tilførsel av 5% CO2 ved 37 ° C. Mediet ble forandret 24 timer senere med forskjellige konsentrasjoner av antibiotikum G418 G418 (600 ug /ml) og erstattet hver 3. dag til 14 dager etter cellekultur. Foreldre celler ble transfektert med pcDNA3.1 (+) – Arnt plasmider ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens instruksjoner. Tettheten av cellene var 2 x 10
5 celler per brønn av seks-brønners plater. Monoklonal celle koloni med G418-resistens ble dannet ved anvendelse av den begrensende fortynningsmetode ved dyrking enkelt celle i 100 ul medium i 96-brønners plater i 24 timer. Monoklonale cellekolonier ble spaltet 15 dager senere for ytterligere forsterkning for å dyrke celler med stabil ARNT-ekspresjon i 24-brønners plater. Celler ble overført til cellekulturflaske inntil det var ca 90% sammenflytende. De Arnt over-uttrykt cellelinjer transfektert med pcDNA3.1 (+) – ARNT ble navngitt som SGC7901 /ADR ARNT
Små forstyrrelser RNA (siRNA) transfeksjon
For å knockdown den ARNT mRNA uttrykk. , siRNA transfeksjon ble utført. For transfections, ble Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 50 nM siRNA (Gene Pharma Co., Shanghai, Kina) brukes i henhold til produsentens anbefalinger som beskrevet tidligere [55]. SiRNA-sekvensene som anvendes er: 5′-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 «, 5′-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3»
Western blotting
av totalt celleprotein ble lysert ved bruk av lyseringsbuffer tilsatt fenylmetylsulfonylfluorid (1 mM. ) på is. Deretter protein ble underkastet elektroforese gjennom 12% SDS-polyakrylamidgeler og overført til en PVDF-membran (Millipore, Massachusetts, USA). 5% ikke-fett melkepulver ble brukt til å blokkere membraner ved romtemperatur i 1 time, og de primære antistoffer ble inkubert over natten. Deretter ble membranene inkubert med sekundære antistoffer merket med HRP i 1 time ved romtemperatur etter tre 10 minutters vaskinger i trietanolamin-bufret saltløsning med Tween (TBS-T). Til slutt ble de signaler påvises ved hjelp av ECL kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) ble og membranene skannet og analysert ved hjelp av en ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, USA) imaging system med bildebehandlingsprogrammer (versjon 1.0) .
