Abstract
Bakgrunn
multiresistens (MDR) er et stort problem i vellykket behandling av kreft. Menneskelig ABCG2, et medlem av ATP-bindende kassett transporter super, spiller en nøkkelrolle i MDR og en viktig rolle i å beskytte kreftstamceller. Knockout av ABCG2 hadde ingen åpenbar negativ effekt på mus. Dermed er ABCG2 et ideelt mål for utvikling av chemo-sensibiliserende midler for bedre behandling av medikamentresistente kreftformer og hjelpe utrydde kreft stamceller.
Metoder /Foreløpige funn
Ved hjelp av rasjonell screening av representanter fra en kjemisk forbindelse bibliotek, fant vi en ny hemmer av ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), som har to moduser av handlinger ved å hemme ABCG2 aktivitet og ved å akselerere sin lysosome avhengig nedbrytning. PZ-39 har ingen virkning på ABCB1 og ABCC1 formidlet medisin utstrømning, motstand, og deres ekspresjon, noe som indikerer at det kan være spesifikke for ABCG2. Analyser av sine analoge forbindelser viste at pharmacophore av PZ-39 er benzothiazole knyttet til en triazinring ryggrad.
Konklusjon /Betydning
I motsetning til tidligere kjente ABCG2 transporter hemmere, har PZ-39 en roman to-modus handling ved å hemme ABCG2 aktivitet, en akutt effekt, og ved å akselerere lysosome avhengig nedbrytning, en kronisk effekt. PZ-39 er potensielt en verdifull probe for struktur-funksjon studier av ABCG2 og en lead compound for utvikling av legemiddelselskap rettet mot ABCG2-mediert MDR i kombinatoriske kreft kjemoterapi
Citation. Peng H, Dong Z, Qi J Yang Y, Y Liu, Li Z, et al. (2009) A Novel To Mode virkende hemmer av ABCG2-mediert multidrug Transport og Resistance in Cancer Kjemoterapi. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10,1371 /journal.pone.0005676
Redaktør: Paul Cobine, Auburn University, USA
mottatt: 30 mars 2009; Godkjent: 01.05.2009; Publisert: May 24, 2009
Copyright: © 2009 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir R01 CA120221 og R01 CA113384. ZD og YY ble støttet delvis av NRSA T32 DK07519 og T32 HL07910 fra National Institutes of Health, henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens (MDR) er et stort problem i vellykket behandling av kreft. Over-uttrykk for noen medlemmer av ABC (ATP-bindende kassett) transporter super har blitt foreslått å forårsake MDR. P-glykoprotein (MDR1 /ABCB1), multiresistens protein 1 (MRP1 /ABCC1), og brystkreft motstand protein (BCRP /ABCG2) er tre store ABC transportører som er store aktører i den kliniske utviklingen av MDR [1]. En av disse deler, ABCG2 som er antatt å eksistere og arbeide som homo-oligomerer med 8-12 subenheter [2], [3], [4], har også blitt implisert å spille roller i å beskytte kreft stamceller, noe som resulterer i medikament motstand og svikt av kreft kjemoterapi [5]. Anticancer stoff substrater av ABCG2 omfatter, men er ikke begrenset til de vanlig brukte anticancer medikamenter slik som adriamycin, mitoksantron, og topotecan. Faktisk har nyere kliniske studier vist at overuttrykk av ABCG2 både voksne og barneleukemi korrelerer svært godt med dårlig prognose (for en oversikt se [6]). Knockout av ABCG2 hadde ingen tydelig ugunstig effekt på utvikling, biokjemi, og levetiden for mus [7]. Alle disse tidligere observasjoner gjør ABCG2 et ideelt mål for utvikling av chemo-sensibiliserende midler for bedre behandling av medikamentresistente kreftformer og foreslår at hemme ABCG2 neppe vil føre til noen bivirkning hvis inhibitor er spesifikk for ABCG2.
Sammenlignet med de kjente resistens-forårsaker ABC transportører som ABCB1 og ABCC1 ble ABCG2 oppdaget relativt nylig, og dermed har noen spesifikke hemmere av ABCG2 blitt rapportert. En av de kjente spesifikke ABCG2 hemmere er potent mykotoksin Fumitremorgin C (FTC) skilles fra
Aspergillus fumigatus product: [8], [9]. Imidlertid nevrotoksisitet av FTC begrenser dets terapeutiske potensiale. Analoger av FTC som Ko132 og Ko143, har blitt utviklet med lav toksisitet [10], men ennå ikke kjent om effektive i kliniske forsøk. I tillegg har andre inhibitorer av ABCG2 blitt rapportert [11], [12]. Men disse midler, så som GF120918, ser ut til å mangle spesifisitet på grunn av deres effekt på ABCB1 og /eller ABCC1 [13], [14]. Åpenbart er mer spesifikke ABCG2 hemmere nødvendig for fremtidig utvikling av potensielle chemo-allergifremkallende for å bedre godbit resistente kreftformer.
I denne artikkelen rapporterer vi funn av en roman bestemt ABCG2 inhibitor, PZ-39 (N- ( 4-klorfenyl) -2 – [(6 – {[4,6-di (4-morfolinyl) -1,3,5-triazin-2-yl] amino} -1,3-benzotiazol-2-yl) sulfanyl ] acetamid), som er mye mer effektive til å reversere ABCG2 formidlet medisinresistens og mindre cytotoksisk til dyrkede celler sammenlignet med FTC. PZ-39 ser ut til å ha to moduser av aksjoner ved å forårsake degradering ABCG2 (kronisk) i tillegg til å inhibere dets aktivitet (akutt). Den tilsvarende effekt av tre PZ-39 relaterte forbindelser avdekket strukturelle grunnlaget for utforming av mer potente spesifikke ABCG2 hemmere i fremtiden.
Resultater
Effekt av sammensatte PZ-39 på mitoxantrone opphopning
Ved hjelp av en rasjonell screening av representanter for ulike klasser av et lite molekyl sammensatt bibliotek fra Specs (www.specs.net) for potensielle hemmere av ABCG2-mediert legemiddelutstrømningen identifiserte vi et sammensatt, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) med benzothiazole knyttet til triazinring ryggraden, (kalt PZ-39 etterpå, se fig. 1) som drastisk tilbake mitoxantrone opphopning i MCF7- /AdVp3000 celler som over-express ABCG2. Som vist på fig. 2A, PZ-39 forbedret mitoksantron akkumulering i MCF7 /AdVp3000 men ikke foreldre følsomme MCF7 celler som ikke produserer ABCG2, noe som tyder på at ABCG2 formidlet medisin effluks er blitt hemmet. Fordi MCF7- /AdVp3000 celler også over-uttrykke andre ABC transportører som ABCC3 i tillegg til ABCG2 [15], PZ-39 kan hemme andre enn ABCG2 ABC transportører, noe som fører til økt mitoxantrone opphopning. For å teste direkte hvis PZ-39 hemmer ABCG2, vi gjennomført tilsvarende studier ved hjelp ABCG2-transfektert stabil HEK293 (HEK293 /ABCG2) celler [3]. Som vist på fig. 2B, pre-inkubering av celler med PZ-39 forbedret intracellulær akkumulering mitoxantron i HEK293 /ABCG2 men ikke i vektoren transfekteres kontroll (HEK293 /Vec) celler. Dermed PZ-39 hemmer sannsynlig ABCG2-mediert mitoxantrone utstrømming. Fig. 2A og 2B viser også at PZ-39 ved 3,3 uM oppnådd tilsvarende grad av virkning av den kjente spesifikke ABCG2 inhibitor FTC ved 10 uM, noe som tyder på at PZ-39 kan være ~3 ganger mer potent enn FTC.
PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, og dets analoger C6, C8 og E2 alle inneholder en -benzotiazol koblet til en triazinring ryggrad. De tre intakte ringer er merket som A, B og C.
A og B, mitoxantrone akkumulering i MCF7- eller dets resistent underlinjen MCF7- /AdVp3000 (A) og HEK293 celler transfektert med vektor eller ABCG2 (B) etter en 30 minutters inkubering i fravær eller nærvær av PZ-39 (3,3 pM) eller FTC (10 uM). Dataene er midler ± SD fra tre uavhengige forsøk (* P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med DMSO kjøretøy). C og D, doserespons av PZ-39 og FTC for å gjeninnføre mitoksantron akkumulering i ABCG2-transfekterte HEK293 celler. Den tykke linjen viser nivået på mitoxantrone akkumulering i vektor-transfektert HEK293 celler, som fungerer som en kontroll.
For ytterligere å undersøke styrken av PZ-39 for ABCG2, doserespons effekten av PZ-39 på mitoxantrone akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler ble bestemt ved hjelp av flowcytometri. Som vist på fig. 2C, det intracellulære nivå mitoxantron ble øket med PZ-39 på en doseavhengig måte. På 3,3 mikrometer, PZ-39 fullstendig restaurert intracellulær mitoxantrone nivå i HEK293 /ABCG2 celler. FTC, på den annen side, oppnås tilsvarende nivå av effekt bare ved 10 uM (fig. 2D), som støtter argumentet at PZ-39 er mer potent enn FTC (se ovenfor).
Sensibilisering av legemiddelresistens av PZ-39
for å undersøke potensialet bruk av PZ-39 som en chemo-sensitive av ABCG2-mediert legemiddelresistens, effekten av PZ-39 på narkotika respons fra HEK293 /ABCG2 celler ble bestemt i fravær eller nærvær av 0,1 pM mitoksantron som alene produserte ~ 10% celledreping. Som vist på fig. 3A og 3B, er PZ-39 ikke cytotoksisk til HEK293 /ABCG2 celler og dens IC
50 er ikke målbar innenfor konsentrasjonsområdet brukes mens IC
50 av FTC er ~24 mikrometer. IC
50 av PZ-39 og FTC pålagt å bevisst mitoxantrone motstand er ~15 nM og ~387 nM. Styrken indeks av PZ-39 er beregnet til 1600 mens det av FTC er bare ~62 (tabell 1)
A og B, potens indeks på PZ-39 sammenlignet med FTC for å reversere mitoksantron motstand. . HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med eller uten 0,1 mM (IC
10) mitoksantron i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-39 (A) eller FTC (B), etterfulgt av SRB-analysen. Dataene er representative for fire uavhengige eksperimenter. C og D, sensibilisering indeks på PZ-39 (C) sammenlignet med FTC (D) i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av mitoxantron i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-39 etterfulgt av SRB-analysen. Dataene er representative for fire uavhengige eksperimenter. E, multidrug sensibilisering indeks over PZ-39 i narkotika valgt MCF7- /AdVp3000 celler. MCF7 /AdVp3000-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av adriamycin (ADR), camptothecin (CPT) eller mitoksantron (MX) i nærvær av DMSO (kjøretøy), 200 nM PZ-39, eller FTC etterfulgt av SRB-analysen. Sensibilisering indeksen ble beregnet ved hjelp av IC
50 av mitoxantron i fravær eller nærvær av PZ-39 eller FTC. Dataene som vises er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å undersøke den hemmende aktivitet av PZ-39 på ABCG2, effekter av PZ-39 på mitoxantrone cytotoksisitet i HEK293 /ABCG2 cellene ble undersøkt i nærvær av tre forskjellige konsentrasjoner av PZ-39 (50, 200, og 500 nM) eller bærerkontroll (0,1% DMSO). Som vist på fig. 3C, NM PZ-39 ved 50 en signifikant reduksjon i IC
50 av mitoxantron med en sensibilisering indeks på 0,4 (tabell 2). Ved 500 nm, sensibilisering indeks av PZ-39 er 0,04, mens den for FTC i samme konsentrasjon er 0,26 (Fig. 3D og tabell 2). Disse resultatene viser at PZ-39 er en meget potent roman ABCG2 inhibitor.
For å undersøke om PZ-39 kan reversere ABCG2-mediert multiresistens i en resistent kreft cellelinje, vi brukte narkotika valgt MCF7- /AdVp3000 celler og testet ytterligere to kreft narkotika substrater av ABCG2, Adriamycin og camptothecin. Som vist på fig. 3E, PZ-39 ved 200 nm drastisk redusert motstand av MCF7 /AdVp3000 til Adriamycin og Camptothecin lik mitoxantron, mens styre FTC viste mye mindre allergi virkning for alle tre medikamenter i forhold til PZ-39 ved samme konsentrasjon.
To moduser av handlingen
for å forstå mekanismen av PZ-39 aksjon i hemme ABCG2 formidlet medisin transport, må vi først undersøkt kinetikken av PZ-39 hemming ved hjelp av isolert innsiden ut membranvesikler [16] . Vi har fastslått at endringen i mitoksantron opptak i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-39. Som vist i Lineweaver-Burk plot (fig. 4A), den Km og Vmax av mitoxantron transport i fravær av PZ-39 ble beregnet til å være 2,3 uM og 455 pmol /mg protein hhv. Det ser ut til at både Km og Vmax av mitoxantron transport har blitt redusert i nærvær av PZ-39 med en estimert Ki på ~0.52 uM, noe som tyder på at PZ-39 oppfører seg som et blandet-type hemmer av mitoxantron transport [17]. Fordi det var også opprinnelig spekulert i at enkelte inhibitorer vil konkurrere med ATP-bindingssetet på ABCG2 transporter, utførte vi et annet eksperiment ved hjelp av ATP som en varierende underlag. Som vist på fig. 4B, både Km og Vmax av mitoxantrone transport ble også endret ved PZ-39. Således vår studie viste at prosessen med mitoksantron transport og ATP-binding kan hemmes ved PZ-39 med en blandet type av mekanisme. Sannsynlig, PZ-39 binder seg til et annet sted på ABCG2 fra både mitoxantrone og ATP, ikke kompetitiv hemmer av det ene av dem.
Inside-out plasma membran vesikler fra HEK293 /ABCG2 celler ble inkubert med 0,6, 1,2 og 1,8 uM [
3H] mitoxantron (A) eller med 0,1, 0,2, 0,5, 1, og 5 mM ATP sammen med 0,6 pM [
3H] mitoksantron (B) i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-39 ved 37 ° C i 5 minutter etterfulgt av bestemmelse av mitoxantron opptak. Viste data er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
Vi testet neste hvis PZ-39 muligens inhiberer ABCG2 oligomerisering siden ABCG2 har vært foreslått å virke som en homodimer eller høyere former for oligomerer og oligomerisering kan brukes som mål for terapeutisk legemiddel utvikling [2], [3]. For dette formål, co-immunutfelling av to differensielt kodet ABCG2 ble utført som tidligere beskrevet [2] etter en 6-timers behandling med PZ-39 ved 3,3 pM. Imidlertid ble ingen effekt av PZ-39 på ABCG2 co-immunoprecipitation funnet (supplerende fig. S1), noe som tyder på at PZ-39 ikke påvirker ABCG2 oligomeriseringsprosessen.
For ytterligere å undersøke mekanismen for PZ-39 effekt på ABCG2, utførte vi en western blot analyse av ABCG2 uttrykket etter PZ-39 behandling. Som vist på fig. 5A, steady state nivået av ABCG2 protein drastisk redusert på en dag etter PZ-39-behandling. Men, det hadde bare marginal reduksjon ved 2 timer etter PZ-39-behandling. Som beskrevet ovenfor, PZ-39 var i stand til å inhibere ABCG2-mediert mitoksantron utstrømning av medikament-resistente celler med 1 time med inkubering. Disse funnene tyder på at PZ-39 kan ha to moduser av handlingen ved å hemme aktiviteten (akutt effekt) og uttrykk (kronisk effekt) av ABCG2 og i tråd med vår observasjon at PZ-39 er ca 3 ganger bedre enn FTC i narkotika akkumulering analysen ( akutt effekt), men ~ 7 ganger mer potent i narkotika allergi assay (kronisk effekt).
A, effekten av PZ-39 på ABCG2 steady state nivå. HEK293 /ABCG2 cellene behandlet med DMSO kjøretøy eller 3,3 uM PZ-39 i forskjellige tidsrom og høstet for western blot-analyse av ABCG2 uttrykk. B, effekten av PZ-39 på ABCG2 stabilitet. HEK293 /ABCG2 celler ble først behandlet med cykloheksimid (5 ug /ml) fulgt av tilsetning av 3,3 pM PZ-39 eller DMSO i forskjellige tidsrom og høstet for western blot-analyse. C, halveringstid på ABCG2. ABCG2 nivåer på western blot som vist i B ble bestemt ved hjelp av Scion Bilde og plottet mot tiden for behandling. Viste data er gjennomsnitt ± S.D av fire eksperimenter. D, effekt av PZ-39 på 5D3 farging av ABCG2. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet uten (tynn linje), eller med (tykk linje) DMSO kjøretøy, 10 uM PZ-39 eller FTC etterfulgt av farging med monoklonalt antistoff 5D3 og strømningscytometri-analyse. E, effekten av FTC på ABCG2 uttrykk. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 10 uM FTC i forskjellige tidsrom og høstet for western blot-analyse av ABCG2 uttrykk. F, effekten av bafilomycin A
1 og MG-132 på PZ-39-indusert ABCG2 degradering. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 3 uM PZ-39 i fravær eller nærvær av 10 nM bafilomycin A
1 eller 2 uM MG-132 i forskjellige tidsrom og høstet for western blot-analyse av ABCG2 uttrykk. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll i alle western blot analyser.
For å finne ut om den kroniske effekten av PZ-39 på ABCG2 uttrykk er på mRNA nivå, utførte vi real-time RT-PCR-analyse av MCF7 /AdVp3000 og HEK293 /ABCG2 celler behandlet med PZ-39 for ulike tider opp til 3 dager. Ingen signifikant forandring ble funnet i ABCG2 mRNA nivå følgende PZ-39 behandling i enten cellelinje (se supplerende fig. S2). Dermed PZ-39 påvirker neppe ABCG2 uttrykk på sitt mRNA nivå. Vi neste hypotese at mekanismen for PZ-39-formidlet inhibering ville være en posttranskripsjonelt prosess og undersøkt muligheten for at PZ-39 kan akselerere degradering av ABCG2. For å teste denne muligheten, HEK293 /ABCG2 celler ble forbehandlet med sykloheksimid, som virker ved å hemme forlengelse under proteinsyntese, fulgt av behandling med PZ-39 i forskjellige tidsrom for å bestemme ABCG2 nedbrytningshastigheten. Som vist på fig. 5B, tap av ABCG2 i celler behandlet med en kombinasjon av PZ-39 og cykloheksimid var mye raskere enn den for kontrollbehandling uten PZ-39. Halveringstiden av ABCG2 i nærvær av PZ-39 er beregnet til å være ~ 5 timer, mens det er stabilt med en beregnet halveringstid på ~54 timer i kontrollen (fig. 5C). Således PZ-39 akselererer sannsynligvis nedbrytning av ABCG2 protein.
Effekt av PZ-39 på ABCG2 konformasjon og stabilitet
akselerert degradering av ABCG2 ved PZ-39 kan skyldes at PZ -39 induserer konformasjonsendring og målrette ABCG2 for degradering. For å bestemme om PZ-39 potensielt forårsaker konformasjonelle forandringer av ABCG2, brukte vi det monoklonale antistoff 5D3 som er blitt rapportert tidligere å binde seg til ABCG2 på celleoverflaten lettere i nærvær av ABCG2 inhibitorer antagelig på grunn av inhibitor-indusert konformasjonsendringer [12] , [18]. Som vist på fig. 5D, PZ-39 har medført en økning i 5D3 flekker, noe som tyder på en mulig konformasjonsendring av ABCG2 på PZ-39 bindende. FTC også økt 5D3 farging som forventet. Men det gjorde ikke påvirke nivået av ABCG2 (Fig. 5E), noe som tyder på at konformasjonsendring indusert av FTC og PZ-39 kan være forskjellig. Det har nylig blitt rapportert at to forskjellige reaksjonsveier finnes for nedbrytning av villtype og mutante proteiner ABCG2 [19]. Mens villtype og korrekt foldet protein blir nedbrutt i lysosomer, blir det mutante og misfolded protein som er involvert i ubiquitin-formidlet proteindegradering i proteasomer. For ytterligere å bestemme mekanismen for PZ-39-indusert degradering ABCG2, anvendes vi bafilomycin A
1, en inhibitor for proteindegradering i lysosomer, og MG-132, en inhibitor proteosom. Som vist på fig. 5F, co-behandling av celler med bafilomycin A
1 og PZ-39 hemmet PZ-39-indusert ABCG2 nedbrytning mens samtidig behandling med MG-132 og PZ-39 gjorde det ikke, noe som indikerer at PZ-39-indusert ABCG2 degradering er sannsynlig lysosomet avhengig. Tatt sammen, konkluderer vi at PZ-39 fører til konformasjonsendring av ABCG2 og mål den for normal nedbrytning i lysosomer.
Effekt av PZ-39 på ABCB1- eller ABCC1 formidlet medisintransport
Å bestemme spesifisiteten av PZ-39, testet vi effekten av PZ-39 på de to andre viktige ABC-transportører som er velkjente i MDR, ABCB1 og ABCC1. Effekten av PZ-39 på ABCB1 og ABCC1-formidlet reduksjon i intracellulært Adriamycin akkumulering ble testet ved anvendelse av MCF7-celler transfektert med ABCB1 (BC19) [20] og HEK293 celler transfektert med ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [16], [21 ]. Vi fant ingen effekt av PZ-39 på aktiviteten av ABCB1 og ABCC1 i synkende Adriamycin akkumulering (se supplerende Fig. S3A). Vi har også funnet noen effekt av PZ-39 på den stabile tilstand proteinnivå ABCB1 og ABCC1 etter 3 dagers behandling (Fig. S3b). Dermed er spesifikke for ABCG2 blant disse tre godt kjente MDR-forårsaker ABC transportører som antas å spille en viktig rolle i klinisk resistens sannsynlig PZ-39.
Effekt av PZ-39 analoger på ABCG2
for bedre å forstå pharmacophore av PZ-39, pågrepet vi 3 analoger av PZ-39 for narkotika akkumulering og resistensanalyser med HEK293 /ABCG2 celler i sammenligning med PZ-39. Disse analoger (C6, C8, og E2) alle har de samme intakte ringene A, B og C som PZ-39, men med ulike sidegrupper (Fig. 1). Alle tre analoger hadde lignende aktivitet som PZ-39 i styrke mitoxantrone akkumulering (Fig. 6A) og allergi mitoxantrone motstand i HEK293 /ABCG2 (Fig. 6B). For å bestemme den kroniske effekten av disse analogene for ABCG2 uttrykk, utførte vi et western blot-analyse etter behandling med C6, C8, og E2 i forskjellige tidsrom opp til 3 dager. Som vist på fig. 6C, alle tre analoger forårsaket av redusert ekspresjon av ABCG2. Videre er alle disse analoger også forårsaket konformasjonsendringer i ABCG2 tilsvar til PZ-39 (fig. 6D). Således sannsynlig benzotiazol bundet til en triazinring ryggrad kan være kjernestrukturen for binding til og inhibering av ABCG2 funksjon og stabilitet.
A, effekter av PZ-39 og dets analoge forbindelser (3 uM) på mitoksantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler. Viste data er gjennomsnitt ± S.D. av triplikate eksperimenter. B, allergi indeks over PZ-39 og relaterte forbindelser i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av mitoxantron i fravær eller nærvær av 50 nM PZ-39, C6, C8, og E2 fulgt av SRB-analysen. Sensibilisering indeksen ble beregnet ved hjelp av IC
50 av mitoxantron i fravær eller nærvær av sammensatte inhibitorer. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. av fire uavhengige eksperimenter. C, effekten av utvalgte PZ-39 og beslektede forbindelser på ABCG2 steady state nivå. HEK293 /ABCG2 cellene behandlet med DMSO kjøretøy eller 3 uM PZ-39, C6, C8, eller E2 i forskjellige tidsrom og høstet for western blot-analyse av ABCG2 uttrykk. D, effekt av PZ-39 og beslektede forbindelser på 5D3 farging av ABCG2. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet uten (tynn linje), eller med (tykk linje) DMSO kjøretøyer, 10 uM PZ-39 eller dets beslektede forbindelser C6, C8, og E2 etterfulgt av farging med monoklonalt antistoff 5D3 og strømningscytometri-analyse.
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi en roman potent spesifikk hemmer av humant ABCG2, PZ-39, som en potensiell terapeutisk middel for å bevisstgjøre resistens i kreft kjemoterapi. PZ-39 inneholder benzotiazol bundet til en triazinring ryggrad. Virkningsmekanismen synes å være i to modi; blandet type hemming i narkotika transportfunksjon og akselerert lysosome avhengig nedbrytning av ABCG2. PZ-39 er ikke cytotoksisk seg med en IC
50 av . 24 mikrometer mens den er svært potent i sensibiliserende MDR av kreftceller over-uttrykker ABCG2
Mange tidligere rapportert ABCG2 hemmere har en bredspektret ABC transporter mål. ABCG2 inhibitor GF120918, for eksempel, faktisk hemmer ABCB1 funksjon mer potent enn ABCG2. Inntil nå har svært få forbindelser er identifisert som spesifikke hemmere av ABCG2. Et slikt eksempel er den ikke-toksiske FTC-derivat, Ko143. Det er mer potent enn andre FTC-analoger, og har ingen toksisitet hos mus på 10-50 mg /kg oral dose [10]. Nylig har to av de flavone forbindelser, 6-prenylchrysin og tectochrysin, har vist seg å være spesifikk for ABCG2 og ingen interaksjon ble påvist med enten ABCB1 eller ABCC1 [22]. Ved hjelp av høy gjennomstrømming screening, Henrich et al. funnet flere forbindelser som har lignende eller mindre inhibitorisk aktivitet sammenlignet med FTC [11], [12]. Likevel, ingen av disse rapporterte spesifikke ABCG2 hemmere har blitt testet klinisk.
Sammenlignet med noen av de tidligere kjente spesifikke ABCG2 hemmere, som FTC, den nye forbindelsen PZ-39 har tre særegne fordeler. Først PZ-39 er mye mer potent enn FTC til å inhibere ABCG2 funksjon. I stoffet akkumulering analysen, PZ-39 tydelig oppnådd samme grad av inhibering ved 3,3 uM sammenlignet med FTC ved 10 uM. I celle overlevelse analyse, PZ-39 ved 500 nm var i stand til å sensibilisere ABCG2-mediert mitoksantron motstand med en indeks på 0,04, mens FTC ved samme konsentrasjon er en sensibilisering indeks på 0,26, ~ 7-gangers forskjell. For det andre har PZ-39 meget lav indre cytotoksisitet in vitro (mer enn 24 uM), men dens styrke indeks er mye bedre enn FTC (1600 versus 62). Således kan vinduet i terapeutiske indeks av PZ-39 være stor. En ideell chemo-sensitive er at det ikke skal være giftig i seg selv. Åpenbart PZ-39 tilfredsstiller dette krav i in-vitro-studier. Imidlertid er fremtidige studier for å vurdere toksisiteten til PZ-39 i dyremodeller. Tredje, vises PZ-39 å ha to moduser av handlingen. I tillegg til sin evne til å inhibere aktiviteten ABCG2, PZ-39 akselererer også dens lysosom-avhengig nedbrytning. Denne andre Virkningsmekanismen er en særegen natur og tydelig øker styrken av PZ-39 på ABCG2 muligens av resirkulert bruk av PZ-39. Denne arten har ikke blitt rapportert om noen tidligere kjente ABC transporter hemmere.
De to moduser av handlingen gjør PZ-39 en meget interessant, romanen, og lovende ABCG2 inhibitor for videre utnyttelse. I den første modus av akutt effekt på ABCG2 funksjon, vises PZ-39 for å utøve en blandet type av inhibering i medikamentopptaksanalyse. PZ-39 kan samhandle med ABCG2 direkte, men ser ikke ut til å konkurrere direkte med mitoksantron eller ATP-binding. Fremtidige studier er nødvendig for å identifisere de PZ-39 bindingsseter i ABCG2. I den andre modus, vises PZ-39 for å akselerere nedbrytningen ABCG2 i lysosomer, en kronisk virkning. Det er mulig at binding av PZ-39 bevirker konformasjonsendring i ABCG2 som retter seg mot den for nedbrytning i lysosomer. Det er imidlertid verdt å merke seg at binding av FTC fører også ABCG2 konformasjonsendring men det gjør ingen akselerere ABCG2 degradering. Dette funnet tyder på at konformasjonsendring indusert av PZ-39 og FTC kan være forskjellig. Tidligere har det blitt funnet at cystein mutant ABCG2 nedbrytning er via proteosom, mens den normale nedbrytning av villtype ABCG2 er via lysosomet [19] med en halveringstid på ~37 timer [23]. Det er også blitt funnet at den agonist-induserte nedbrytning av β
2-adrenerg reseptor er via lysosomet eventuelt ved forbedret endocytose [24]. Det er fristende å foreslå at bindingen av PZ-39 til ABCG2 er i stand til å akselerere endocytose og handel med celleoverflaten ABCG2 i lysosomer for degradering. Omfattende arbeid for å ytterligere evaluere denne hypotesen er for tiden pågår i vårt laboratorium.
analoger av PZ-39, C6, C8 og E2 med samme kjerne struktur alt ser ut til å fungere ved hjelp av samme mekanisme som PZ-39. Åpenbart vil videre studier være nødvendig å teste flere analoger av PZ-39 med flere forandringer på kjernen benzotiazol bundet til en triazinring ryggrad og for å belyse struktur-aktivitetsforhold av PZ-39 i ABCG2 inhibering. Likevel observasjonene fra denne studien viser tydelig at PZ-39 kan tjene som en lead compound for videre design og optimalisering av mer spesifikke ABCG2 hemmere for bedre behandling av medikamentresistente kreft hos mennesker i kombinasjonsterapi.
Materialer og Metoder
Material
monoklonalt antistoff BXP-21 mot ABCG2, anti-myc og anti-HA-antistoffer var fra ID Labs, Cell Signaling og Roche, henholdsvis. Monoklonalt antigody mot Pgp, C219, var en slags gave fra Dr. Victor Ling (The British Columbia Cancer Center, Vancouver, Canada). Monoklonalt antistoff mot MRP, MRPr1, ble kjøpt fra Kamiya Biomedical Company. Biotin-konjugert 5D3 antistoff og Phycoerythrin-Streptavidin konjugater var fra eBiosciences. Alle elektroforese reagenser, proteinkonsentrasjonen assay kit, prefabrikerte polyakrylamid gradient geler og polyvinylidendifluorid membraner ble kjøpt fra Bio-Rad. FTC, adriamycin, mitoksantron, kamptotecin, DTT, sulforodamin B (SRB), og Triton X-100 var fra Sigma. Protein-G PLUS-Agarose og SYBR Grønn PCR Master Mix var fra Santa Cruz Biotechnology og Applied Biosystems, henholdsvis. LipofectAMINE Plus og G418 var fra Invitrogen. Cellekulturmedium IMEM, DMEM, og [
3H] mitoxantrone var fra Biosource International, Media Tech., Og Moravek Biochemical hhv. PZ-39 og tre beslektede forbindelser ble kjøpt fra spesifikasjoner. Alle andre kjemikalier var av molekylær biologi klasse fra Sigma eller Fisher Scientific.
Cell kultur, lysat, og membran preparater
Menneskelig brystkreft cellelinje MCF7 (ATCC) og dens avledede linjer BC19 (en gave fra Julie Horton ved National Institute of Environmental Health Sciences) og MCF7- /AdVp3000 (en gave fra Susan Bates ved National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1, HEK293 /vektor, HEK293 /ABCG2 ble dyrket som tidligere beskrevet [2], [16 ], [20], [25]. Lysat fremstillingen ble utført som beskrevet tidligere [25]. Cellemembraner ble fremstilt på nøyaktig den samme måte som tidligere beskrevet [16] og endelig Membranene ble resuspendert i STBs (250 mM sukrose, 150 mM NaCl, 10 mM Tris /HCl, pH 7,5).
Western blot , immunopresipitering, og flowcytometri
Western blot, immunopresipitering, og strømnings-cytometri analyse av medikament akkumulering ble utført nøyaktig som vi tidligere beskrevet [2], [3]. For å bestemme mekanisme ABCG2 degradering, ble HEK293 /ABCG2 celler først behandlet med 10 nM bafilomycin A
1 eller 2 mikrometer MG132 i 24 timer, etterfulgt av tilleggsbehandling med tre mikrometer PZ-39 for ulike tider. Cellelysatene ble deretter oppsamlet for western blot-analyse av ABCG2. For å bestemme halveringstiden for ABCG2, ble HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 5 pg /ml sykloheksimid, 3 uM PZ-39, eller begge deler i forskjellige tidsrom, etterfulgt av samling av cellelysatene for Western blot-analyse av ABCG2 uttrykk. For å bestemme endringen i antistoff 5D3 farging etter behandling med inhibitorer, ble HEK293 /ABCG2 celler inkubert med 10 pM PZ-39, C6, C8, E2, eller FTC ved 37 ° C i 30 minutter før biotin-konjugert antistoff 5D3 (1: 100 fortynning) ble tilsatt og inkubert i 2 timer. Deretter ble cellene vasket 3 ganger og inkubert med Phycoerythrin-streptavidin i 30 minutter etterfulgt av vasking i 3 ganger og analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Sanntid RT-PCR og Cytotoksisitet assay
RNA ekstraksjon og sanntids RT-PCR ble utført som vi tidligere beskrevet [25]. Sekvensene til primerne er ABCG2 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 «(fremover) og 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (revers). Sekvensene til primerne er GAPDH 5»-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 «(fremover) og 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3» (revers). Den relative ABCG2 RNA-nivå (2
ΔCT) ble behandlet med inhibitorer ble uttrykt som prosent av kontrollen (i nærvær av 0,1% DMSO) hvor ΔCT (terskelsyklus) = (CT
ABCG2-CT
GAPDH ).
Cytotoksisitet ble bestemt ved anvendelse av SRB kolorimetrisk analyse som tidligere er beskrevet [25]. Effekten av sammensatte inhibitorer på legemiddelresistens ble bestemt ved å eksponere cellene til en rekke konsentrasjoner av anticancer-legemidler slik som mitoksantron i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av inhibitoren. Styrken og sensibilisering indeks av inhibitorene ble beregnet som følger:
Drug oppsamling og transport av kinetisk analyse
Drug opphopning assay ble utført som beskrevet tidligere [16], [26] med noen modifikasjoner. I korthet, 10
6 celler i kultur ble pre-inkubert med forskjellige konsentrasjoner av PZ-39, FTC, eller bærerkontroll (0,1% DMSO) i 1 time ved 37 ° C, etterfulgt av tilsetning av 20 uM mitoksantron og inkubering i 30 min.
