Abstract
phosphoinositide 3-kinase (PI3K) -mammalian target of rapamycin (mTOR) signalaksen har dukket opp som et nytt mål for kreftbehandling. Legemidler som hemmer PI3K, mTOR eller begge er under utvikling. Den mTOR allosterisk inhibitor, RAD001, og PI3K /mTOR dual kinase inhibitor, BEZ235, er eksempler på disse midlene. Vi var interessert i å utvikle strategier for å forbedre mTOR-målrettet Caner terapi. I denne studien, har vi funnet at BEZ235 alene effektivt hemmet veksten av rapamycin-resistente kreftceller. Interessant, kombinasjonen av sub-optimale konsentrasjoner av RAD001 og BEZ235 som utøves synergistisk inhibering av veksten av humane lungekreftceller sammen med induksjon av apoptose og G1 arrest. Videre, kombinasjonen var også mer effektiv enn noen av midlene alene til å inhibere veksten av lungekreft transplantater i mus. Kombinasjonen viste forbedrede effekt på inhibering av mTOR-signalisering og reduksjon av ekspresjon av c-myc og cyclin D1. Til sammen våre resultater tyder på at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 er en roman strategi for kreftterapi
Citation. Xu C-X, Li Y, Yue P, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) Kombinasjonen av RAD001 og NVP-BEZ235 Utøver Synergistic Anticancer aktivitet mot ikke-småcellet lungekreft
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE seks (6): e20899. doi: 10,1371 /journal.pone.0020899
Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA
mottatt: 31 mars 2011; Godkjent: 12 mai 2011; Publisert: 14 juni 2011
Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholar award, NIH R01 CA118450 og P01 CA116676 (Prosjekt 1), Department of Defense IMPACT (Imaging og molekylære markører for pasienter med lungekreft: Går med molekylære mål, komplementære /Innovative behandlinger og terapeutiske modaliteter) award W81XWH-05-0027 (Prosjekt 5), BATTLE (Biomarker baserte tilnærminger av målrettet terapi for lungekreft Elimination) award W81XWH-06-1-0303 (Prosjekt 4) og BESCT (biologi, utdanning, resirkulering, Kjemoprevensjon og Therapy) award DAMD17-01-1-0689 (Prosjekt 2). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
K-Ras, LKB1 og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er ofte mutert i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Disse mutasjoner resulterer i unormal aktivering av fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt /pattedyr-target av rapamycin (mTOR) signalveien [1], [2], [3]. Derfor har PI3K /Akt /mTOR signalveien dukket opp som et lovende terapeutisk mål for NSCLC.
RAD001 (Everolimus) er et derivat av rapamycin og er funksjonelt lik rapamycin som en allosterisk hemmer av mTOR. Hos pasienter med avansert nyrecellekreft som tidligere er behandlet med VEGF målrettet agenter, forbedrer RAD001 progresjonsfri overlevelse og har derfor blitt godkjent av US Food and Drug Administration for denne indikasjonen [4]. Det har også blitt funnet å forbedre progresjonsfrie overlevelse hos pasienter med neuroendcorine kreft i bukspyttkjertelen. I mange andre organ maligniteter, RAD001 og andre rapamycin-analoger (rapalogs) de rapalogs utøve beskjedne anti-kreft effekt, at selv om lovende, er ikke tilstrekkelig til å rettferdigmonoterapi med disse agentene [5].
Nye innsats til forbedre effektiviteten av de rapalogs har fokusert på å utvikle nye kombinasjonsstrategier. NVP-BEZ235 (BEZ235) er en roman og oralt administrert dual PI3K og mTOR kinase inhibitor. Denne forbindelse er et potent, reversibel inhibitor av både klasse I PI3K og mTOR-kinase katalytisk aktivitet ved å konkurrere på deres ATP-bindingssete [6]. BEZ235 er for tiden under evaluering i fase I /II kliniske studier. I prekliniske studier induserer BEZ235 slående anti-proliferative effekter både i transgene mus med onkogene K-Ras-indusert NSCLC og i NSCLC cellelinjer som uttrykker onkogene K-Ras. Videre effektivt sensitizes det NSCLC cellelinjer som uttrykker onkogene K-Ras til de pro-apoptotiske effekter av ioniserende stråling både
in vitro Hotell og
in vivo product: [7]. Når BEZ235 ble kombinert med en MEK-inhibitor, merket synergi ble oppnådd i krympende K-Ras mutant murine lungekreft [8].
Som rapamycin, bevirker RAD001 Akt aktivering i humane kreftceller, inkludert NSCLC-celler, mens inhibering av mTOR signale [9]. Vi har nylig rapportert om økt effekt av kombinasjonen av RAD001 med en PI3K inhibitor på veksten av NSCLC celler både
in vitro Hotell og
in vivo product: [9]. Interessant, BEZ235 kunne overvinne rapamycin motstand som den effektivt hemmet veksten av rapamycin- eller RAD001 bestandig NSCLC celler. Derfor evaluert vi effekten av kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 på veksten av NSCLC-celler og funnet at kombinasjonen var mer effektiv enn noen av midlene alene til å inhibere veksten av NSCLC-celler både
in vitro
og
in vivo
. Denne rapporten vil i hovedsak dokumentere våre forskningsresultater i denne forbindelse.
Materialer og metoder
Reagens
RAD001 og BEZ235 ble levert av Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), oppløst i DMSO og lagret ved -80 ° C. Kanin polyklonalt anti-actin-antistoff ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Antistoffer mot Akt, p-Akt (S473), p-S6 (S235 /S236), S6, p-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, eIF4E, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), henholdsvis, ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Geitepolyklonalt mTOR (FRAP, N-19) og mus monoklonale c-myc (9E10) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California), henholdsvis. Kanin polyklonale Rictor (BL2178) antistoff ble kjøpt fra Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, Texas). Monoklonalt cyclin D1 antistoff ble kjøpt fra Dako (Carpinteria, CA).
Cellelinjer og cellekultur
Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549, H460 og H157 ble beskrevet tidligere [10]. HCC827 ble kjøpt fra American Type Culture Collection ATCC (Manassas, Virginia). Rapamycin-resistent A549 cellelinje (A549-RR) ble etablert tidligere [9]. Disse cellelinjene ble dyrket i monolagskultur i RPMI 1640 medium supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære bestående av 5% CO
2 og 95% luft.
veksthemmende analyse
Cellene ble dyrket i 96-brønners cellekulturplater og behandlet den neste dag med agenter angitt. Levedyktig celleantall ble beregnet ved å bruke sulforhodamin B (SRB) assay, slik som tidligere beskrevet [10]. Kombinasjon index (CI) for legemiddelinteraksjon (f.eks synergi) ble beregnet ved hjelp av CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ).
Colony Forming analyse
Virkningene av den gitte legemidler på kolonidannelse på platene ble målt som tidligere beskrevet [11].
påvisning av apoptose
apoptose ble evaluert ved Annexin V-farging ved hjelp av Annexin V-PE apoptose deteksjon kit kjøpt fra BD Biosciences ( San Jose, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot analyse
Klargjøring av hele cellen proteinlysatene og Western blot analyse ble beskrevet tidligere [12], [13].
m
7GTP Trekk ned for analyse av eIF4F Complex Formation
eIF4F kompleks i celleekstrakter ble påvist ved hjelp av affinitetskromatografi m
7GTP-Sepharose som beskrevet tidligere [14].
Påvisning av mTOR komplekser (mTORCs)
mTORCs inkludert mTORC1 og mTORC2 ble immunopresipitert med geitepolyklonalt mTOR (FRAP, N-19) antistoff og fulgte med Western blotting å oppdage mTOR, raptor og rictor henholdsvis som beskrevet tidligere [9].
Lung Cancer xenografter og behandlinger
Dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Emory University. Protokollen nummeret er 222-2008. Fem til seks ukers gamle kvinnelige atymiske (nu /nu) mus ble bestilt fra Taconic (Hudson, New York) og holdt under patogen-frie forhold i mikroisolatorbur med laboratorium chow og vann
ad libitum
. A549 cellene ved 5 x 10
6 i serumfritt medium ble injisert s.c. inn i flanken område på nakne mus. Når tumorer nådde en størrelse på ca 100 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 6 /gruppe) i henhold til tumorvolumer og kroppsvekter for de følgende behandlinger: bærerkontroll, BEZ235 (20 mg /kg /dag, og), RAD001 (3 mg /kg /dag, og), og deres kombinasjoner. Tumor volum ble målt ved hjelp av kalibermålinger gang annenhver dag, og beregnes med formelen
V
= π (lengde × bredde
2) /6.
Statistisk Analyse
Den statistiske betydningen av forskjeller mellom to grupper eller mellom flere grupper ble analysert med to-sidig uparet Student
t
tester (for like avvik) eller med Welch er korrigert
t
test (ulike variasjoner) eller en-veis analyse av varians (ANOVA) ved anvendelse av Graphpad INSTAT 3 programvare. Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant på
P
. 0,05
Resultater
BEZ235 hemmer veksten av Rapamycin bestandig NSCLC Cells Effektivt
I en tidligere studie, vi etablert et rapamycin-resistent cellelinje (dvs. A549-RR). Denne cellelinje er også motstandsdyktig mot RAD001 [9]. Vi forventet at denne cellelinje ville være, i det minste delvis, motstandsdyktig mot BEZ235, siden det er et PI3K og mTOR-dual inhibitor. Uventet, BEZ235 viste sterk inhibering av veksten av A549-RR-celler (Fig. 1A). Videre BEZ235 også indusert apoptose i A549-RR-celler (Fig. 1B). Faktisk, induksjon av apoptose og vekstinhibering med BEZ235 var litt mer effektiv i A549-RR celle enn i den overordnede A549-celler (fig. 1). Dermed trenger rapamycin-resistente celler som ikke viser kryssresistens til BEZ235.
A
, De indikerte cellelinjene ble sådd ut i 96-brønners plater og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BEZ235 som indikert på den andre dagen. Etter 3 dager ble celle tall beregnes ved hjelp av SRB-analysen. Points, betyr fire replikere bestemmelser; barer, ± SD.
B
, De angitte cellelinjer ble sådd ut i 6-brønns plater og deretter behandlet neste dag med forskjellige konsentrasjoner av BEZ235 som angitt. Etter 24 og 72 timer, ble cellene høstet og underkastet påvisning av apoptose ved hjelp av Annexin V-farging. Kolonner, hjelp av duplikate bestemmelser; barer, ± SD.
Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 synergi hemmer veksten av NSCLC celler sammen med induksjon av apoptose og G1 arrest
Vi har tidligere vist at kombinasjonen av rapamycin eller RAD001 med PI3K inhibitor LY294002 resulterte i forbedrede veksthemmende effekt mot NSCLC celler både
in vitro Hotell og
in vivo product: [9], [15]. Vi har nå undersøkt om kombinasjonen av BEZ235 og RAD001 utøver utvidet anti-kreft aktivitet i NSCLC celler. Uventet, har vi funnet at kombinasjonen av lave konsentrasjoner av BEZ235 og RAD001 var mye mer potent enn hvert enkelt middel for å hemme veksten av flere NSCLC cellelinjer (f.eks A549, H460, H157 og HCC827). Cis- for de fleste kombinasjoner var mindre enn 1 (Fig. 2A, høyre panel), hvilket indikerer synergistiske effekter på inhibering av veksten av NSCLC-celler. Etter avtale, kan kombinasjonen av BEZ235 og RAD001 var betydelig mer potent enn hver enkelt agent i å indusere apoptose (figur 2B.) Og G1 arrest (Fig 2C.) (
P
0,001). Således forbedret induksjon av både apoptose og cellesyklus-stans bidrar til utvidet vekst-inhiberende effekter indusert av kombinasjonen.
A
, vil den indikerte cellelinjene ble sådd ut i 96-brønners plater og deretter behandlet neste dag med ulike konsentrasjoner av BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD) og deres respektive kombinasjoner som angitt. Etter 3 dager ble celle tall estimert ved hjelp av SRB analysen og CIS ble beregnet med CompuSyn programvare (høyre panel). Points, betyr fire replikere bestemmelser; barer, ± SD.
B
og
C
, De angitte cellelinjer ble sådd i 6-brønns plater og deretter behandlet med 10 nM BEZ235 alene, 2 nM RAD001 alene, og deres kombinasjoner. Etter 48 timer ble cellene høstet for påvisning av apoptose ved hjelp av Annexin V-farging (
A
) og for cellesyklusanalyse med en flowcytometri (
C
). Kolonner, hjelp av duplikate bestemmelser; Barer, ± SD. *,
P
0,05, **
P
0,01, og ***,
P
0,001 sammenlignet med DMSO kontroll; ###,
P
0,001 sammenlignet med RAD001 eller BEZ235 alene
Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 effektivt hemmer dannelsen og vekst av NSCLC cellekolonier
Vi er fast bestemt ytterligere de langsiktige effektene av en kombinasjon av RAD001 og BEZ235 på veksten av NSCLC celler i en koloni formasjon analysen. Denne analyse gjør det mulig for oss å gjenta behandlingene i lang tid (f.eks 12 dager). RAD001 ved en dose på 1 nM og BEZ235 ved 5 nM alene hadde minimal effekt på undertrykkelse av kolonidannelse av NSCLC-celler; imidlertid kombinasjonen enten eliminert kolonidannelse (f.eks A549) eller drastisk redusert koloni-tall (f.eks H460 og H157) (Fig. 3). Således er det klart at kombinasjonen er mye mer effektivt enn enten som monoterapi ved inhibering av kolonidannelse og vekst av NSCLC-celler (
P
0,001). Vi sammenlignet også virkningen av rekkefølgen av administreringen av de to midlene på kolonidannelse av NSCLC-celler. Under de samme forsøksbetingelser som er beskrevet ovenfor, sekvensielle behandlinger med RAD001 først, etterfulgt av BEZ235 behandling (RAD001 → BEZ235) eller BEZ235 først, etterfulgt av RAD001 behandling (BEZ235 → RAD001), viste virkninger sammenlignbare med hver alene med minimal hemming av veksten av NSCLC cellekolonier . Den samtidige kombinasjon av RAD001 og BEZ235 var mye mer potent enn både sekvensiell behandling for inhibering av dannelse og vekst av NSCLC-kolonier (
P
0,001) (Fig. 2.). Derfor er samtidig administrering av RAD001 og BEZ235 klart bedre enn sekvensielle behandlinger i å hemme vekst av NSCLC cellekolonier.
De angitte cellelinjer ved en tetthet på ca. 200 celler /brønn ble sådd ut i 24-brønners plater. På den andre dagen, ble cellene behandlet med 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) eller deres samtidige kombinasjoner (RAD + Bez). Cellene ble også behandlet med 1 nM RAD001 for 6 dager fulgt med 5 nM BEZ235 i ytterligere 6 dager (RAD → Bez) eller med 5 nM BEZ for 6 dager fulgt med 1 nM RAD001 i ytterligere 6 dager (BEZ → RAD). Etter 12 dager ble platene farget for dannelsen av cellekolonier med krystallfiolett fargestoff. Bildet av koloniene ble deretter tatt med et digitalt kamera (
A
) og koloni tallene ble telt (
B
). ***,
P
0,001 sammenlignet med DMSO kontroll; ###,
P
0,001 sammenlignet med alle andre behandlinger
Vi ytterligere sammenlignet effekten av kombinasjonen av RAD001 og LY294002 med sekvensielle behandlinger på koloni dannelsen av NSCLC celler. . Konsekvent, den samtidige kombinasjonsbehandling, men ikke den sekvensiell behandling enten med RAD001 først, etterfulgt av LY294002 eller med LY294002 etterfulgt av RAD001, genereres forsterket virkning på inhibering av kolonidannelse av NSCLC-celler (Fig. S1).
The kombinasjon av RAD001 og BEZ235 utøver Augmented aktivitet mot vekst av NSCLC xenografter i Nude Mice
på grunn av de lovende veksthemmende effekter av RAD001 og BEZ235 kombinasjon i NSCLC celler
in vitro
, vi deretter validert virkningen av kombinasjonen mot vekst av NSCLC-tumorer i mus. Både RAD001 og BEZ235 delvis, men betydelig, hemmet veksten av A549 xenografter (
P
0,01); imidlertid kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 var signifikant mer potent enn hvert enkelt middel for å hemme veksten av xenografter som målt ved både tumorstørrelser og vekter (
P
0,01) (fig. 4A og 4B). Disse
in vivo
data viser videre at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 skjermer utvidet anticancer aktivitet. Vi har observert en høyere grad av vekttap hos mus behandlet med kombinasjonen (opp til 19% av kontrollmusene) spesielt under den tidlige behandlingsperioden. Vektdifferansen ved slutten av forsøket forbedret til bare 13% av kontroll (Fig. 4C), noe som tyder på mulig tilpasning og bedre toleranse av kombinasjonsbehandlingen, etter
A549 xenotransplantater ble behandlet (en gang daglig) med kjøretøyet kontroll, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og) og deres kombinasjon (BEZ + RAD) som starter på den samme dag etter gruppering. Tumor størrelser (
A
) og kroppsvekt (
C
) ble målt en gang annenhver dag. Etter 14 dager ble musene avlivet og tumorene ble fjernet og veiet (
B
). Hver måling er en middelverdi ± SD (n = 6). Tallene i
C
representerer vekttap i kombinasjonsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. *
P
0,05 sammenlignet med kjøretøy kontroll; **
P
0,01 sammenlignet med kjøretøy kontroll; ***
P
0,001 sammenlignet med kjøretøy kontroll;
##
P
0,01 sammenlignet med RAD001 eller med BEZ235
Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 utøver Enhanced Effekter på bekjempelse av mTOR signalering og nedregulering av c. -Myc og cyclin D1
for å få innsikt i de mekanismer som kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 utøver forbedret anticancer aktivitet, analyserte vi effektene av kombinasjonen på mTOR signalering og på uttrykk for sine regulerte proteiner i sammenligning med begge substansene alene. Ved de testede doser, BEZ235 hadde en minimal effekt på reduserte p-S6 nivåer, men ingen effekt på nivåene av p-4EBP1 (både S65 og T37 /46), c-Myc og cyclin D1. Faktisk, observerte vi økte nivåer av 4EBP1 (T37 /46) (både A549 og H157) og c-myc (for eksempel i H157). RAD001 på 2 nm sterkt hemmet S6 og 4EBP1 (S65) fosforylering, men ikke redusere nivåene av p-4EBP1 (T37 /46), c-myc og Cyclin D1. I likhet med BEZ235, RAD001 også økte nivåer av p-4EBP1 (T37 /46) og c-myc både A549 og H157 celler. Men kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 enten avskaffet økning i p-4EBP1 (T37 /46) (for eksempel i A549 celler) indusert ved monoterapi eller som utøves bedret effekt på reduksjon av p-4EBP1 (T37 /46) nivåer (f.eks i H157-celler). Viktigere, kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 hadde øket effekt på å redusere nivåene av c-myc og cyclin D1 i begge A549 og H157-celler sammenlignet med hvert enkelt middel alene (Fig. 5).
A
, de angitte cellelinjer ble platet ut på 10 cm diameter cellekulturskåler og behandlet neste dag med de gitte konsentrasjoner av Bez-235 i fravær og nærvær av RAD001 i 24 timer. Cellene ble deretter høstet for fremstilling av hel-celle-lysatene protein og påfølgende Western blot-analyse for å påvise de angitte proteiner.
B
, De angitte cellelinjer ble behandlet med 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 eller deres kombinasjon. Etter 24 timer ble cellene høstet for tilberedning av hel-celle protein lysates og påfølgende m
7GTP rullegardin analysen fulgte med Western blot analyse for å oppdage de gitte proteiner.
RAD001 økt Akt fosforylering i både A549 og H157 cellelinjer som vi tidligere rapportert [9]. Interessant nok ved lave doser, BEZ235 også øket p-Akt nivåer. Tilstedeværelsen av BEZ235 ved testede dosen varierer heller svakt reduserte nivåene av p-Akt indusert av RAD001 (for eksempel i A549 celler) eller påvirket ikke RAD001-indusert økning i p-Akt (for eksempel i H157-celler) (fig. 5). Dermed ser det ut til at RAD001 og BEZ235 kombinasjonen kan vise økt effekt på å undertrykke mTOR signal og uttrykk for sine regulerte proteiner med begrenset eller ingen hemmende effekt på Akt fosforylering.
Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 Utøver Enhanced effekter på Undertrykke eIF4F Assembly
Siden mTOR signal er kjent for å positivt regulere cap-avhengige oversettelse initiering, vi videre analysert virkningene av RAD001 og BEZ235 kombinasjon på hetten binding av eIF4E og eIF4G (f.eks eIF4F montasje) med m
7GTP-Sepharose trekke ned analysen. Som presentert i fig. 5B, RAD0001 og BEZ235 alene reduserte mengder eIF4G som interaksjon med eIF4E. Imidlertid er kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 var mye mer effektiv som enten middel alene i avtagende mengder av eIF4G binding til eIF4E. Avhandlinger resultatene viser tydelig at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 utøver forbedret effekt på å undertrykke cap binding av eIF4E og eIF4G eller eIF4F montering.
Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 ikke viser forsterkede effekter på Hemme Montering av mTORCs
det er kjent at montering eller sammenslutning av mTOR med sine partnere (f.eks, raptor og rictor) er viktig for forskjellige enzymaktivitet og biologiske funksjoner. RAD001, som rapamycin undertrykker mTOR signal ved å hemme montering av mTORCs [16]. Dermed vi videre bestemt om kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 utøves forbedrede hemmende effekter på montering av mTORCs inkludert mTORC1 (mTOR /raptor) og mTORC2 (mTOR /rictor). For å oppnå dette, gjorde vi immunoprecipitation (IP) med anti-mTOR antistoff til å trekke ned både mTORC1 og mTORC2 og deretter fulgt med Western blotting å oppdage raptor og rictor i immunpresipitatene. Som presentert i fig. 6, BEZ235 hadde minimal effekt på å redusere nivåene av raptor og rictor i immunopresipitatene, mens RAD001 vesentlig reduserte nivåer av både raptor og rictor trukket ned av mTOR-antistoff. Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 hadde lignende potens til RAD001 alene i reduksjon av nivåene av raptor og rictor i immunpresipitatene, noe som indikerer at kombinasjonen ikke viser forbedrede effekter på å hemme montering av mTORC1 og mTORC2.
A549 celler ble behandlet med 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 eller deres kombinasjon. Etter 24 timer ble cellene høstet for tilberedning av hel-celle protein lysates og påfølgende IP-Western blotting.
Diskusjoner
Utvikling av rapamycin motstand er et kritisk problem i behandlingen av kreft med rapamycin og dets analoger [17]. BEZ235 er en PI3K og mTOR dual kinase inhibitor [6]. Vår studie viste at BEZ235 hemmet veksten av rapamycin-resistente celler og indusert apoptose så effektivt som det gjorde i de matchet ordnede celler. Faktisk, rapamycin-resistente celler var litt mer følsom enn foreldreceller til BEZ235 (fig. 1). Disse data tyder på at rapamycin-resistente celler ikke er kryss-motstandsdyktig mot BEZ235. Etter denne cellelinje som hadde blitt vist å være fullstendig motstandsdyktig mot RAD001, våre funn tyder på at BEZ235 hemmer veksten av kreftceller ved forskjellige mekanismer fra dem som medierer handlingene til rapalogs. Det vil være interessant å vite om BEZ235 har tilleggsmekanisme utover dual hemming av PI3K og BEZ235. Foruten, våre data også innebære at BEZ235 kan brukes til å overvinne motstanden rapamycin.
Selv om BEZ235 hemmer både PI3K og mTOR, i kombinasjon med RAD001, utøver den synergistiske effekter i inhibering av veksten av et panel av NSCLC-celler som vist i en 3-dagers monolagskultur (med SRB-analyse) og i en lang sikt 12 dager kolonidannelse assay (fig. 2 og 3). Dette synergi skyldes sannsynligvis forbedrede effekter på induksjon av cellesyklus G1 arrest og apoptose (fig. 2). I forståelse, kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 var betydelig mer effektiv enn noen av midlene i inhibering av vekst av NSCLC-xenotransplantater i nakne mus (Fig. 4). I dyrestudie, ble det registrert at kombinasjonen opprinnelig forårsaket betydelig tap av kroppsvekt (opp til 19% av kontroll); imidlertid, ved slutten av forsøket, mus som fikk kombinasjonsbehandling syntes å gjenvinne noe av vekttapet (13% av kontroll). Dette tyder på at musene kan tilpasse seg og til slutt tåler behandlingen med kombinasjonen av RAD001 og BEZ235. Likevel bør vi klar over potensialet forbedret bivirkninger som skyldes kombinasjonen mens kombinasjonen viser lovende synergistisk anticancer aktivitet.
Behandling tidsplaner kan påvirke det endelige utfallet av den gitte kombinatoriske terapi. I denne studien fant vi at sekvensielle behandlinger med RAD001 fulgt av BEZ235 eller med BEZ235 fulgt av RAD001 minimalt hemmet veksten av NSCLC kolonier; i motsetning til dette den samtidige behandling av RAD001 og BEZ235 vesentlig hemmet veksten av NSCLC-kolonier eller elimineres den kolonidannelse (Fig. 3). Dette gjelder også for en kombinasjon av rapamycin og LY294002 (fig. S1). Våre data tyder på at samtidig kombinasjon av RAD001 og BEZ235 kan være optimalt for videre utvikling av denne kombinasjonen.
IC
50-tallet (konsentrasjoner av å hemme 50% cellevekst) av BEZ235 i humane NSCLC-celler varierer fra 10 nM til 100 nM (våre upubliserte data). I våre kombinasjons eksperimenter, vi vanligvis brukes lave doseområder av BEZ235 (f.eks 1-10 nM). På disse dosene, BEZ235 hadde en svak hemmende effekt på p-S6 fosforylering men ikke modulere p-4EBP1 fosforylering eller nivåene av c-myc og cyclin D1. Ved en dose på 2 nM, RAD001 effektivt hemmet fosforylering av S6 og 4EBP1 (S65), men ikke undertrykke 4EBP1 fosforylering (T37 /46) og c-myc og cyclin D1 uttrykk. Imidlertid er kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 effektivt hemmet p-4EBP1 fosforylering (ved T37 /46) og reduserte nivåer av c-myc og cyclin D1 (Fig. 5A). Videre har vi vist at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 var mye mer potent enn både monoterapi ved inhibering av hetten bindingen av eIF4E og eIF4E eller eIF4F sammenstillingen (fig. 5B), noe som tyder på at kombinasjonen utøver forbedret inhiberende effekt på hetten avhengig initiering . Siden c-Myc og cyclin D1 er kjent for å bli regulert av mTOR-signalisering gjennom cap-avhengig protein oversettelse [18], våre data indikerer at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 utøver forbedret effekt på inhibering av mTOR signalering og ekspresjon av dens regulert onkogene proteiner (f.eks c-myc og cyclin D1). Denne effekten kan bidra til synergistisk aktivitet mot veksten av NSCLC celler
in vitro Hotell og
in vivo
av kombinasjonen av RAD001 og BEZ235.
I denne studien, RAD001 økt Akt fosforylering i både A549 og H157 celler; Dette er i tråd med våre tidligere rapporter [9]. I de konsentrasjonene som ble testet (f.eks 1-10 nM), økt BEZ235 p-Akt nivå også. Denne observasjonen er i overensstemmelse med en tidligere rapport, hvor BEZ235 ble vist å øke Akt fosforylering ved lave doser (f.eks, 10 nM) [19]. Det hadde tidligere blitt vist at høyere konsentrasjoner av BEZ235 er nødvendig (f.eks 100 nM) for å hemme Akt sammenlignet med (f.eks 10 nM) som kreves for å inhibere fosforylering S6 [19]. Dermed ser det ut til at BEZ235 besitter primært mTOR-hemmende aktivitet på lave konsentrasjoner områder. Følgelig, er det forståelig at BEZ235 ved lave konsentrasjonsområder øker Akt fosforylering som ville være forventet av en rapalog [9], [15]. Interessant nok har kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 ikke redusere p-Akt nivåer, som var så høye som de i celler behandlet med RAD001 eller BEZ235 alene (Fig. 5). Gitt at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 hemmer effektivt veksten av NSCLC-celler som beskrevet ovenfor, ser det ut til at kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 kan utøve økt anticancer aktivitet med forhøyede nivåer av p-Akt.
mTOR utøver sin viktige roller i å fremme cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon primært gjennom interaksjon med andre proteiner som raptor (forming mTORC1) og rictor (forming mTORC2) [18], [20]. mTORC2 er generelt antatt å være ufølsom for rapalogs [18]. Imidlertid langvarig behandling med disse mTOR inhibitorer forstyrrer monteringen av mTORC2 som demonstrert av oss [9] og andre [21]. I denne studien, etter en 24 timers behandling, RAD001, men ikke BEZ235, effektivt hemmer sammenstillingen eller aktiviteten til både mTORC1 og mTORC2. Kombinasjonen av RAD001 og BEZ235 ikke ytterligere redusere nivåene av raptor og rictor i immunopresipitatene (Fig. 6), noe som viser at kombinasjonen ikke viser forbedrede effekt på inhibering av sammenstillingen av mTORCs. Basert på disse observasjonene, spekulere vi at de forbedrede virkninger på undertrykkelse av mTOR signalering ved kombinasjonen er sannsynligvis på grunn av deres markante effekt på inhibering av mTORC sammenstillingen og mTOR-kinase-aktivitet. Det er generelt mener at en synergieffekt er oppnådd gjennom et selskap av to stoffer som fungerer via forskjellige mekanismer. Siden BEZ235 effektivt hemmer veksten av rapamycin-resistente celler, er det også mulig at synergien mellom RAD001 og BEZ235 mot vekst av lungekreftceller skjer gjennom en ukjent mekanisme av BEZ235, som trenger videre undersøkelser.
i sammendraget, har den nåværende studien viste at kombinasjonen av RAD001 og PI3K /mTOR-hemmer BEZ235 synergistisk hemming på veksten av NSCLC celler
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og representerer dermed en roman strategi for å forsterke effekten av mTOR-målrettet kreftbehandling. Våre funn gir begrunnelsen for å evaluere denne kombinasjonen i kliniske studier for pasienter med rapalog-sensitive og ildfaste maligniteter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Samtidig kombinasjon av rapamycin og LY294002 er mer effektiv enn sekvensielle behandlinger i å hemme dannelse og vekst av NSCLC kolonier. De angitte cellelinjer ved en tetthet på ca. 200 celler /brønn ble sådd ut i 24-brønners plater. På den andre dagen ble cellene behandlet med 1 nM rapamycin (Rap) alene, 5 nM LY294002 (LY) alene, samtidig kombinasjon av rapamycin og LY294002 (Rap + LY), rapamycin i 3 dager og deretter byttet til LY294002 behandling (Rap → LY), LY294002 for 3 dager og deretter byttet til rapamycin behandling (LY → Rap). De samme sykluser av behandlingene ble gjentatt etter 3 dager. Etter 12 dager ble platene farget for dannelsen av cellekolonier med krystallfiolett fargestoff. Bildet av koloniene ble deretter tatt med et digitalt kamera (A) og koloniene ble telt (
B
)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020899.s001 plakater (PDF)
Takk
TKO, SSR, FRK og S-Y.S.
