Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA. Prognosen er fortsatt dystre med lite fremskritt i behandlingen. Metformin er et stoff som er mye brukt for behandling av type II diabetes. Nyere epidemiologiske data vist at oral administrering av metformin er forbundet med en redusert risiko for kreft i bukspyttkjertelen, noe som tyder på dens potensial som en ny medikament for denne sykdommen. Mange studier har vist
in vitro
anticancer effekten av metformin, men vanligvis brukes konsentrasjonene var mye høyere enn den
in vivo
plasma- og vevskonsentrasjoner oppnås med anbefalte terapeutiske doser av metformin, og lav konsentrasjoner av metformin hadde liten effekt på spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi undersøkte effekten av lave konsentrasjoner av metformin på ulike subpopulasjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler og fant at disse selektivt hemmet spredning av CD133
+ men ikke CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler. Vi undersøkte også effekten av lave konsentrasjoner av metformin på celle invasjon og
in vivo
tumordannelse, noe som viser
in vitro Hotell og
in vivo
kreft handling. Metformin ble assosiert med en reduksjon av fosfor-Erk og fosfor-mTOR uavhengig av Akt og AMPK fosforylering. CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler er ansett for å være kreft stamceller som bidrar til tilbakefall, metastase og motstand mot adjuvant behandling i kreft i bukspyttkjertelen. Våre resultater gir grunnlag for kombinasjon av metformin med gjeldende terapi for å bedre prognosen for denne sykdommen
Citation. Gou S, Cui P, Li X, Shi P, Liu T, Wang C (2013) lave konsentrasjoner av Metformin selektivt Hemme CD133
+ Cell Proliferation i bukspyttkjertelkreft og ha kreft handling. PLoS ONE 8 (5): e63969. doi: 10,1371 /journal.pone.0063969
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 10 februar 2013; Godkjent: 10 april 2013; Publisert: 8. mai 2013
Copyright: © 2013 Gou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (nr 81001064) (Hjemmeside: https://www.nsfc.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP er blant de mest aggressive av solide maligniteter. Hvert år blir 43,920 pasienter nylig diagnostisert med sykdommen, noe som resulterer i 37,390 dødsfall per år i USA og gjøre kreft i bukspyttkjertelen den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i både menn og kvinner [1]. Det har vært lite fremskritt i behandling og prognosen forblir sturen [2], [3], [4], [5], med et 5 års overlevelse på bare omtrent 3% og en gjennomsnittlig overlevelsestid på mindre enn 6 måneder. Blant pasienter som gjennomgår potensielt kurativ reseksjon, er fem års overlevelse mindre enn 24% på grunn av lokalt residiv og metastaser [1], [6], [7]. Nye terapeutiske strategier er derfor stort behov for denne svært ondartet sykdom.
Metformin er et stoff mye brukt til behandling av type II diabetes. Nylig, epidemiologiske data viste at metformin, men ikke andre antidiabetika, reduserer forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen hos pasienter med diabetes mellitus [8], [9]. Interessant nok var det ingen korrelasjon mellom den beskyttende virkning og pasientens blodsukkernivåer [9]. En beskyttende effekt ble også observert i en fett hamster tumorigenesis modell av kreft i bukspyttkjertelen ved bruk av N-nitrosobis- (2-oksopropyl) amin [10]. Flere
in vitro
studier har etablert en direkte virkning av metformin på mange typer kreftceller, inkludert de av bukspyttkjertelkreft [11], [12]. Metformin kan derfor være et potensielt terapeutisk middel ved behandling av kreft i bukspyttkjertelen, selv om dens mekanisme av anticancer handling er tvetydig.
In vitro
forsøk har vist en doseavhengig effekt av metformin på kreftcelle spredning. De vanligvis brukte konsentrasjonene i slike studier er 5-30 mm, noe som er mye høyere enn de plasma- og vevskonsentrasjoner målt i individer som har fått anbefalte terapeutiske doser, og mindre enn 1 mM av metformin har liten virkning på kreftcelleformering [13] , [14].
Her viser vi at lave konsentrasjoner av metformin ha effekter på forskjellige subpopulasjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold til deres differensial ekspresjon av overflatemarkører. CD133
+ og CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler regnes bukspyttkjertelkreft stamceller, og spredning av CD133
+ men ikke CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler ble selektivt hemmet av lave konsentrasjoner av metformin. Metformin var assosiert med reduksjon av fosfor-Erk og fosfor-mTOR uavhengig av Akt og AMPK fosforylering. Selv om lav konsentrasjon metformin hadde ingen effekt på den proliferative kapasiteten til kreft i bukspyttkjertelen celler generelt, deres
in vitro
invasive kapasiteter og
in vivo
bukspyttkjertelkreft xenograft vekst var signifikant hemmet.
Materialer og metoder
Cell kultur
Vi har innhentet ASPC-en og SW1990 celler fra American Type Culture Collection. ASPC-1 bukspyttkjertelen adenokarsinom celler ble avledet fra ascites av en 62 år gammel kaukasisk kvinnelig pasient med bukspyttkjertelen adenokarsinom; SW1990 bukspyttkjertelen adenokarcinomceller ble hentet fra metastaser i milten av en 56-år gammel kaukasisk mannlig pasient med bukspyttkjertelen adenokarsinom. Begge celletyper ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Billings, MT) og penicillin /streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C med 5% CO
2.
Strømningscytometri
For markør overflate deteksjon, ble cellene resuspendert i 100 mL Hanks balanserte saltoppløsning med 1% FBS (Gibco). For isolering av CD133
+ -celler for western blot-analyse ble cellene resuspendert i 100 mL Hanks balanserte saltoppløsning med 1% FBS. Fc-reseptorbinding Inhibitor (eBioscience, Inc., San Diego, CA) ble tilsatt, og prøven ble inkubert i 5 minutter ved 4 ° C. Etter to vasker, Anti-CD133 fluorescein (FITC) (Biorbyt, Cambridge, UK), Anti-CD24 FITC (eBioscience), Anti-CD44 PE-Cy5 (eBioscience) eller Anti-ESA PE (eBioscience) tilsatt og prøven ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Etter to vasker, proporsjonene av subpopulasjon celler som uttrykte de forskjellige overflatemarkører ble bestemt ved hjelp av et FACSCalibur system (BD Biosciences, San Jose, California) og celle sortering av CD133
+ celler ble gjort ved hjelp av en FACSAria system (BD Biosciences) . Side scatter og termin scatter profiler ble brukt til å fjerne celle dubletter.
For apoptose analyse, celler ble behandlet i 48 timer med metformin (0,2 mm for ASPC-1 og 0,1 mm for SW1990) eller uten metformin. For det første prøver ble inkubert med Fc-reseptor-binding-inhibitor i 5 min ved 4 ° C, deretter Anti-CD133 FITC ble tilsatt, og prøven ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Etter to vaskinger ble Annexin V APC og propidiumjodid merking utført for flowcytometri, som ble utført ved bruk av en Annexin V-assay kit ifølge produsentens instruksjoner.
For cellesyklusanalyse, ble cellene behandlet i 48 timer med metformin (0,2 mm for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) eller uten metformin. Etter festing av cellene i 70% metanol, ble Fc-reseptor-binding-inhibitor tilsatt, og prøven ble inkubert i 5 minutter ved 4 ° C. Anti-CD133 FITC ble deretter tilsatt, og prøven ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Etter to vaskinger ble prøven behandlet med RNase og utsatt for propidiumjodid for strømningscytometri.
celleproliferasjonsanalyse
celleproliferasjon analyser ble utført ved bruk av CCK-8 i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble sådd ut i en 96-brønns plate og dyrket i 100 ul DMEM supplert med 10% FBS. Etter 24 timer ble de kimsatte cellene behandlet med 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 eller 0,50 mM metformin tilsettes til kulturmediet, eller ikke har fått metformin. Ved de angitte tidspunkt ble mediet byttet ut med 110 ul DMEM med CCK-8-reagens og cellene ble inkubert i 2 timer. Absorbans ble målt i hver brønn ved en bølgelengde på 450 nm ved hjelp av en automatisk mikroplateleser.
Vekstkurve
Først ble cellene dyrket i serumfritt DMEM i 12 timer. Cellene ble deretter løsnet ved trypsinisering og sådd ut i seks-brønns plater i DMEM supplementert med 10% FBS med metformin (0,2 mM for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) eller uten metformin ved en konsentrasjon på 1 x 10
3 celler /brønn. Celletallet ble vurdert ved trypsinering; celleprøver ble tellet på et hemocytometer ved 24 timers intervaller. Resultatene ble plottet som en vekstkurve.
celle invasjon assay
En celle invasjon Assayet ble utført i en 24-brønns Transwell kammer (Corning, Inc., Corning, NY). Først ble 8 um pore polykarbonatmembran innsatsen belagt med 100 ul av Matrigel (BD Biosciences). Før analysen ble utført, ble cellene behandlet med metformin (0,2 mM for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) i 48 timer eller ikke gitt metformin. Kamrene ble deretter plassert i 24-brønners plater; 1 x 10
4 celler i DMEM supplert med 0,2% FBS ble sådd ut i hver øvre kammer, og DMEM supplert med 10% FBS med metformin (0,2 mM for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) eller uten metformin ble satt til kamrene. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer, celler som hadde invadert til den motsatte side av membranoverflaten ble farget med krystallfiolett.
Xenotransplantat eksperiment
Dame
nu
/
nu
mus ble hentet fra Experimental Animal Center of Union Hospital, Wuhan, Kina. For hvert eksperiment ble musene tilfeldig fordelt i to like grupper (fire mus pr gruppe) som var ubehandlet eller behandlet med metformin. For behandlede gruppene, 800 mg /L av metformin ble fortynnet i drikkevannet hver dag for varigheten av eksperimentet; 72 timer senere ble hele befolkningen av kreft i bukspyttkjertelen celler injisert i høyre flanke av hver mus. Tumorene ble målt hver 3. dag etter den første injeksjon og tumorvolum (V) ble beregnet i henhold til V = (lengde x bredde
2) /2. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Union Hospital, Huazhong University of Science and Technology (Permit Number: 2009-096).
Western blotting
Flow cytometri sortert cellene ble vasket i PBS og resuspendert i RIPA-buffer, 1 mM PMSF, 1 mM Na
3VO
4, og 1 x protease inhibitor cocktail i 3 minutter på is. Lysatet ble sentrifugert ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble benyttet for Western blotting. Protein lysates ble kokt i lasting buffer (Beyotime, Jiangsu, Kina), løses ved elektroforese på 8% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF membraner (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Membraner ble undersøkt over natten ved 4 ° C med AMPKα, fosfor-AMPKα (Thr172), Akt, fosfor-Akt (Thr308), ERK1 /2, fosfor-Erk (Thr202 /Tyr204), mTOR, og fosfor-mTOR (Ser2448) primær -antistoff (Cell Signaling, Danvers, MA) med β-aktin (Cell Signaling) som kontroll. Pepperrot-peroksidase-konjugert IgG (Beyotime) ble brukt til å påvise spesifikke proteiner. Endelig immundeteksjon ble utført ved bruk av kjemiluminescerende substrater (Amersham Pharmacia Biotech).
Statistisk analyse
For flowcytometri og celle invasjon analyser, ble eksperimenter utført i tre eksemplarer. Xenograft Forsøket ble utført i fire paralleller. For celleproliferasjonsprosesser analyser og vekstkurver, ble eksperimenter utført i seksere. Resultatene ble angitt som gjennomsnitt ± standardavvik, analysert ved en-veis analyse av varians og deretter sammenlignet mellom grupper ved hjelp av uparede Students
t
-test. En betydning terskelen til
P
0,05 ble brukt. Data ble analysert ved hjelp av SPSS v.11 statistisk programvare (SPSS, Inc.).
Resultater
Lave konsentrasjoner av metformin ikke hemme spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler
For å undersøke effekten av lave konsentrasjoner av metformin på spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler, gjennomførte vi en CCK-8-analyse ved hjelp ASPC-1 og SW1990 celler. Metformin har vist seg å ha liten effekt på proliferasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler ved lave konsentrasjoner. Som vist på fig. 1, i de foreliggende studien ble cellene behandlet med 0,01 til 0,2 mM metformin i 72 timer, men deres overlevelse ble ikke hemmet.
ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av metformin i 72 timer, og tallene levedyktige celler ble bestemt ved CCK-8-analyse. Resultatene er presentert som andelen av levedyktige celler sammenlignet med kontrollgruppen. ble ikke observert noen forskjell i levedyktige celler mellom celler behandlet med lave konsentrasjoner av metformin (≤0.5 mM) og kontroller. Feilfelt representerer standardavvik.
Lave konsentrasjoner av metformin redusert andel av CD133
+ celler
For å undersøke effekten av lave konsentrasjoner av metformin på spredning av ulike subpopulasjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler, gjennomførte vi en flowcytometri analyse ved hjelp ASPC-1 og SW1990 celler. Cellene ble behandlet med 0,01 til 0,2 mM metformin i 72 timer, og deres ekspresjon av overflatemarkører analysert. Som vist på fig. 2, lave konsentrasjoner av metformin redusert CD133
+ celler på en doseavhengig måte, men ikke påvirke CD24
+, CD44
+, ESA
+ eller CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler (CD24
+ CD44
+ ESA
+ -celler ikke er detekterbare blant ASPC-1 celler).
ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av metformin i 72 timer og andelene av celler som uttrykker forskjellige overflatemarkører ble bestemt ved flow-cytometri. Resultatene er presentert som andelene av de forskjellige subpopulasjoner av celler. Andelene av CD24
+, CD44
+, ESA
+ og CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler (påvise bare i SW1990 celler) ble ikke endret ved behandling med lave konsentrasjoner av metformin (≤0.2 mM). Andelen av CD133
+ celler ble redusert på en doseavhengig måte; 0,2 mM metformin for ASPC-1-celler og 0,1 mM metformin for SW1990 celler reduserte andelen av CD133
+ celler til det halve. Feilfelt representerer standardavvik.
*
P
0,05 (sammenlignet med kontroll)
lave konsentrasjoner av metformin hemmet spredning av CD133
+ cellene ved G1 /S arrest
for å undersøke effekten av lave konsentrasjoner av metformin på spredning av CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler, ASPC-en og SW1990 celler ble behandlet med 0,2 mm eller 0,1 mm metformin, henholdsvis. Celle tall ble talt hver 24 timer og flowcytometri ble utført for å bestemme antall og andelen av CD133
+ og CD133
– celler på angitte tidspunkter. Som vist på fig. 3, spredning av CD133
+ celler var selektivt hemmet. Apoptose og cellesyklusanalyse ble utført 48 timer etter celler ble behandlet med metformin (0,2 mm for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) eller uten metformin; disse lave konsentrasjoner indusert apoptose i noen CD133
+ eller CD133
+ celler, men cellesyklusen av CD133
+ celler ble endret ved behandlingen. Lav konsentrasjon metformin økte andelen av CD133
+ -celler i G0 /G1 fase og redusert som celler i S-fasen i betydelig grad. Den CD133
– cellesyklusen ble ikke påvirket (figur 4).
A, Vekstkurvene for kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med lave konsentrasjoner av metformin.. ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med 0,2 mM eller 0,1 mM metformin, henholdsvis, og deres tall telles ved hvert tidspunkt. Resultatene er presentert som det gangers økning i forhold til 0 timer. B, Effekt av lave konsentrasjoner av metformin om andelen av CD133
+ -celler. ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med 0,2 mM eller 0,1 mM metformin, henholdsvis, og andelen av CD133
+ celler ble bestemt på hvert tidspunkt. Andelen CD133
+ celler reduseres gradvis. C, Vekstkurvene for CD133
+ og CD133
– kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med lave konsentrasjoner av metformin. Det totale antall kreft i bukspyttkjertelen celler og proporsjonene CD133
+ og CD133
– celler ble bestemt på hvert tidspunkt. Resultatene er presentert som det gangers økning i forhold til 0 timer. Spredning av CD133
+ celler var selektivt hemmet. Feilfelt representerer standardavvik.
A, Effekt av lave konsentrasjoner av metformin på apoptose i kreft i bukspyttkjertelen. ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med 0,2 mM eller 0,1 mM metformin, henholdsvis i 72 timer, og andelene av apoptotiske celler ble bestemt ved flow-cytometri. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom de behandlede celler og kontroller. B, Effekt av lave konsentrasjoner av metformin for cellesyklus i bukspyttkjertelkreft. ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med 0,2 mM eller 0,1 mM metformin, henholdsvis i 72 timer, og andelene av cellene i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved flow-cytometri. En reduksjon av totale S fase celler og en økning på G0 /G1 fase foreslår G1 /S arrest i CD133
+ celler. Feilfelt representerer standardavvik.
*
P
. 0,05
Lave konsentrasjoner av metformin hemmet invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler
En Transwell-analysen ble utført for å undersøke effekten av lave konsentrasjoner av metformin for kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon. Behandling med metformin (0,2 mM for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) redusert antall celler som invaderte til den motsatte side av membranen i det Transwell kammeret sammenlignet med celler som ikke har mottatt metformin (fig. 5B), noe som antyder at lav konsentrasjon metformin hemmer invasiv kapasitet på kreft i bukspyttkjertelen celler.
Effekt av lave konsentrasjoner av metformin på invasjonen i bukspyttkjertelkreft. ASPC-1 og SW1990 celler ble inkubert med 0,2 mM eller 0,1 mM metformin, henholdsvis i 72 timer og celle invasjon ble bestemt ved Transwell assay. Lave konsentrasjoner av metformin redusert invasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler. Feilfelt representerer standardavvik.
*
P
. 0,05
Oral administrasjon av metformin hemmet kreft i bukspyttkjertelen xenograft vekst in vivo
For å undersøke effekten av lavdose metformin på bukspyttkjertelkreft
in vivo
, xenograft eksperimenter ved hjelp av
nu Twitter /
nu
mus ble gjennomført. For mus behandlet med metformin, mengden av legemiddel fortynnet i drikkevannet var ekvivalent med en human dose på 20 mg /kg ved normalisering til overflaten området; plasmakonsentrasjonen av metformin i musene var 0,02 mM. Mus ble ofret 18 (ASPC-1 celler) eller 24 (SW1990 celler) dager etter at de ble injisert med kreft i bukspyttkjertelen celler (5 × 10
6 for ASPC-1 celler, 1 × 10
7 for SW1990 celler) . Veksten av kreft i bukspyttkjertelen xenografter ble betydelig hemmet av metformin behandling (Fig. 6).
A, Xenotransplantat på offer. Åtte hundre milligram per liter av metformin ble fortynnet i drikkevannet på
nu Twitter /
nu
mus 72 timer før injeksjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Mus ble avlivet 18 eller 24 dager etter implantasjon. Xenotransplantater fra mus behandlet med oral metformin var mye mindre enn de fra ubehandlede mus. B, Effekt av peroral administrasjon av metformin på vekst av xenografter. Åtte hundre milligram per liter av metformin ble fortynnet i drikkevannet på
nu Twitter /
nu
mus 72 timer før injeksjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Tumorene ble målt hver 3. dag etter injeksjonen og tumorvolum (V) ble beregnet i henhold til V = (lengde x bredde
2) /2. Xenograft vekst ble betydelig hemmet av oral administrering av metformin. Feilfelt representerer standardavvik.
*
P
. 0,05
Lave konsentrasjoner av metformin hemmet fosforylering av mTOR uavhengig av Akt og AMPK fosforylering i CD133
+ celler
for å identifisere mulige molekylære faktorer som bestemmer effekten av metformin på CD133
+ celler, vurderte vi aktivering av AMPK, Erk, og Akt – tre kinaser som er muligens involvert i disse effektene. mTOR, som blir fosforylert av AMPK, Erk, og Akt, ble også evaluert. Etter behandling med metformin for 4 t (0,2 mm for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990), reduksjon av fosfor-Erk og fosfor-mTOR ble observert i CD133
+ celler, noe som tyder på et behov for hemming av Erk og mTOR av den antiproliferation virkningen av metformin. Ingen vesentlig endring av fosfor-AMPKα ble observert, mens fosfor-Akt økt etter behandling med metformin, noe som tyder på at den hemmende effekten av metformin på mTOR var uavhengig av AMPK og Akt fosforylering (Fig. 7).
Bukspyttkjertel kreftceller ble behandlet med metformin i 4 timer (0,2 mM for ASPC-1, 0,1 mM for SW1990) og CD133
+ celler ble sortert ved strømningscytometri. Uttrykk av AMPKα, Akt, ERK1 /2, og mTOR og fosforylering av CD133
+ celler ble evaluert av western blotting og resultatene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ V.1.46r (National Institutes of Health). Betydelige reduksjoner av fosfor-ERK1 /2 og fosfor-mTOR uttrykk og en betydelig økning av fosfor-Akt uttrykk ble observert i metformin behandlede celler. Feilfelt representerer standardavvik.
*
P
. 0,05
Diskusjoner
Metformin reduserer hepatisk glukoseproduksjon og øker insulinfølsomheten og glukose utnyttelse av muskler og adipocytter, noe som resulterer i redusert insulinemia og forbedring av insulinfølsomhet hos diabetespasienter. Det er den hyppigst foreskrevne antidiabetisk medikament for type II diabetes [15] og er også brukt for andre sykdommer som har insulinresistens, inkludert polycystisk ovariesyndrom [16], alkoholfrie fettleversykdom [17] og for tidlig pubertet [18] . Nylig har det fått oppmerksomhet for sitt potensial effekt som en kreft narkotika. I pionerarbeid, Evans et al. første gang påvist i 2005 som tar metformin kan være forbundet med en redusert risiko for kreft hos pasienter med type II diabetes [19]. I 2009, en kasus-kontrollstudie med fokus på effekten av antidiabetiske behandling på risikoen for kreft i bukspyttkjertelen ble publisert av Li et al. og viste at metformin betydelig redusert risiko for kreft i bukspyttkjertelen, med en odds-forhold på 0,38 [9]. Effektiviteten av metformin i å redusere forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen har blitt støttet av andre epidemiologiske og dyrestudier [8], [10].
Selv om metformin sin antidiabetiske virkningsmekanismen er fortsatt usikker, aktivering av AMP-aktivert protein kinase (AMPK) har blitt allment akseptert som en mulig mekanisme. AMPK er et viktig enzym som er involvert i insulin-signalering, metabolismen av glukose og fett, og glukoseproduksjon av leverceller. Mange mobil studier har fokusert på AMPK og relaterte molekyler og har avdekket en anticancer effekten av metformin
in vitro product: [12], [20], [21]. En fersk studie viste også antitumor virkningen av metformin på kreft i bukspyttkjertelen stamceller [13]. Av notatet, de fleste av disse eksperimentene brukte konsentrasjoner av metformin (typisk 5-30 mm) som er mye høyere enn de anbefalte terapeutiske doser for klinisk bruk. Når konsentrasjonen ble redusert til samme størrelsesorden som den som finnes i plasma og vev hos individer som fikk terapeutiske doser, ble inhibering av celleproliferasjon ikke observert. Våre data viser at spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler hemmes ikke av mindre enn 0,5 mM metformin
fleste tumorer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, er heterogene.; det vil si, omfatter de celler av varierende fenotypiske og biologiske egenskaper. Kreft stamcelle hypotese antyder at bare en liten subpopulasjon av celler, definert som kreft stamceller, har evnen til å gi opphav til alle celletyper som finnes i en spesiell kreftprøve. Cancer stamceller spiller sentrale roller i den tumorigenesis, vekst, invasjon, metastaser, gjentakelse og motstand mot adjuvant behandling av kreft [22], [23]. Derfor mistenker vi at lave konsentrasjoner av metformin kan påvirke bukspyttkjertelen kreft stamceller og ikke-stilk kreftceller annerledes, noe som kan forklare stoffets
in vivo
kreft handling og inkonsekvens av
in vitro
og
in vivo
resultater. Fordi CD133
+ og CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler er dokumentert å være kreft i bukspyttkjertelen stamceller [24], [25], [26], bestemt vi effekten av lav konsentrasjoner av metformin på disse undergruppene, som viser en redusert andel av CD133
+ celler. Tatt i betraktning den lille effekt av lave konsentrasjoner av metformin på proliferasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler generelt, kan det utledes at spredning av CD133
+ -celler, men ikke CD24
+, CD44
+, ESA
+, eller CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler ble selektivt hemmet. Hermann et al. viste at CD133
+ og CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler overlappet, men var ikke identiske i L3.6pl celler avledet fra COLO 357 kreft i bukspyttkjertelen celler [25]. Våre resultater viste at CD133
+ celler, men ikke CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler kan påvises blant ASPC-1 celler. Som for SW1990 celler, CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler, som utgjorde 5,46% av alle celler, var ufølsom for metformin, noe som tyder på at de biologiske egenskapene til CD133
+ og CD24
+ CD44
+ ESA
+ celler forskjellig. Vi bestemte ytterligere andelen av CD133
+ celler hver 24 timer i 5 dager etter behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med lave konsentrasjoner av metformin og produsert vekstkurver for både CD133
+ og CD133
– celler. Den selektive hemmingen av CD133
+ celler var klart. Samlende
in vitro
bevis tyder på at høye konsentrasjoner av metformin kan utøve en antitumor effekt ved å indusere apoptose og /eller cellesyklus arrest, men det er få publiserte data for lave konsentrasjoner. Således vi undersøkte også effekten av lav konsentrasjon metformin på apoptose og cellesyklusen. Apoptose, som er dokumentert å være viktig i den antitumor virkningen av metformin, ble indusert i verken CD133
+ eller CD133
– celler. G1 /S arrest ble indusert i CD133
+ men ikke i CD133
– celler. G1 /S arrest kan dermed spille en nøkkelrolle i den selektive hemming av CD133
+ celler.
Vi så gjennomført
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter til verifisere anticancer effekten av lave konsentrasjoner av metformin i bukspyttkjertelkreft. Kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med metformin i 72 timer ble brukt for celle invasjon analyser fordi reduserte behandling andelen av CD133
+ celler til det halve. Metformin ble fortynnet i drikkevannet på
nu Twitter /
nu
mus 72 timer før xenograft eksperiment for å oppnå en steady-state plasmakonsentrasjon i henhold til farmakokinetikken til metformin [27]. Både in vitro invasjon analyse og in vivo-xenograft-analyse støttet anticancer virkning av lav konsentrasjon metformin. Forskjellene av SW1990 xenograft tumor volum var ikke statistisk signifikant på dag 21 (
P
= 0,062) eller dag 24 (
P
= 0,055). Dette kan være på grunn av den lille størrelsen på utvalget. Tatt i betraktning den lille effekten av metformin på spredning av CD133
– celler og en sentral rolle i kreftstamceller i tumorprogresjon, invasjon og metastasering [28], [29], vi forsøksvis antyder at selektiv hemming av CD133
+ celler bidrar betydelig til in vitro og in vivo anticancer effekt av metformin.
Vi neste evaluert uttrykket av molekyler som kan bestemme anticancer effekten av metformin på CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler. Aktivering av mTOR er regulert av vekstfaktorer og næringsstoffer, og den regulerer cellevekst ved å kontrollere mRNA-translasjon, ribosom biogenese, autophagy, og metabolismen [30]. Mange mål av mTOR kinase er overexpressed eller mutert i kreft, som korrelerer med kreft progresjon, negativ prognose, og motstand mot kjemoterapi [31]. I de senere år ble mTOR funnet å spille en viktig rolle i å opprettholde kreft stamceller [32], [33]. Derfor mTOR har vært ansett for å være et terapeutisk mål i kreft som kan bli angrepet av metformin [34], [35]. En hemmende effekt av metformin på fosforyleringen av mTOR, som har blitt rapportert i kreftceller inkludert de av kreft i bukspyttkjertelen [36], [37], ble det observert i CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler i denne studien. Selv om metformin er dokumentert å indusere aktivering av AMPK i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi har ikke observert dette fenomenet, som kan være på grunn av lav konsentrasjon av metformin brukt i denne studien [36]. Erk og Akt er to andre formidlere av mTOR i kreftceller. Mutasjon av K-Ras, den dominerende mutasjon i kreft i bukspyttkjertelen, fører til avvikende aktivering av Erk i kreft i bukspyttkjertelen celler, som i sin tur fører til mTOR-aktivering [38]. Vi demonstrerte konkordans av hemmende aktivitet av metformin på Erk og mTOR i CD133
+ celler, noe som fører oss til å foreslå at Erk avhengig oppheving av mTOR aktivering spiller en viktig rolle i anticancer effekten av metformin. Nylig ble en lignende selektiv inhiberende effekt av metformin på CD133
+ kreftceller på grunn av metformin indusert inhibering av Akt dokumentert i glioblastom [39]. I motsetning til våre resultater viser at metformin indusert aktivering av Akt i CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi forsøksvis antyder at to mekanismer kan bidra til aktivering av Akt i CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler. Først induserer metformin re-uttrykk for MIR-200 i bukspyttkjertelkreft [13]. FOG2 undertrykker PI3K ved å binde den p85α subenhet og MIR-200 aktiverer PI3K /Akt signalveien ved abrogere FOG2 [40]. For det andre kan Erk avhengig hemming av mTOR megle en ond sirkel som forsterker Akt fosforylering [41].
I konklusjonen, våre resultater viser at lave konsentrasjoner av metformin, i samme rekkefølge som de som er målt i plasma og vev av individer som har fått anbefalt terapeutisk dose av metformin, hemmer selektivt spredning av CD133
+ kreft i bukspyttkjertelen celler og har en anticancer handling både
in vitro Hotell og
in vivo
.
