Abstract
Bakgrunn
T-celler er kjent for å delta i respons på kreftceller og reagerer med cytotoksisitet og frigjøring av cytokiner. Samtidig svulster etablert allsidige mekanismer for å kneble immunresponsen. Samspillet er langt fra å være helt forstått. I denne studien viser vi kontakter mellom tumorceller og lymfocytter avslørende nye egenskaper i interaksjonen mellom T-celler og kreftceller på en måte som ikke tidligere er beskrevet.
Metoder /Funn
Eksperimenter er basert på bruken av en hydrofil fluoriserende fargestoff som forekommer fritt i cytosol og således overføring av fluorescerende cytosolen fra en celle til den andre kan observeres ved hjelp av flow cytometri. Tumorceller fra cellelinjer av forskjellig opprinnelse eller primær hepatocellulær karsinom (HCC) celler ble inkubert med lymfocytter fra humant og mus. Denne eksponeringen provoserte en kontaktavhengig opptak av tumor avledet cytosol av lymfocytter – selv i CD4
+ T-celler og murine B-celler – som ikke kunne påvises etter inkubasjon av lymfocytter med friske celler. Interaksjonen var en direkte en, som ikke krever nærvær av hjelpeceller, men uavhengig av cytotoksisitet og TCR inngrep.
elektronmikroskopi beskrevet 100-200nm store hull i cellemembraner for tilkoblede celler som skilte seg levedyktige og avslørte overrask utfall. Mens lymfocytter ble overtalt til å spre seg i en langsiktig måte, tumorceller gikk en midlertidig pause i celledeling.
in vitro
resultatene ble bekreftet
in vivo
bruker en mus akutt lymfatisk leukemi (ALL) modell. Arrestasjonen av tumor spredning resulterte i en betydelig forlenget overlevelse utfordret mus.
Konklusjoner
De rapporterte celle-celle kontakter avsløre nye egenskaper dvs. aktivering av cytosol flyt mellom cellene, inkludert biologisk aktive proteiner som påvirker cellesyklus og biologisk oppførsel av mottakercellene. Dette legger et helt nytt aspekt i tumorindusert immunologi
Citation. Hardtke-Wolenski M, Kraus L, Schmetz C, Trautewig B, Noyan F, Vondran FWR, et al. (2013) Utveksling av cytosoliske innhold mellom T-celler og tumorceller Aktiverer CD4 T-celler og hindrer kreft vekst. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10,1371 /journal.pone.0078558
Redaktør: R. Lee Mosley, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 30 april 2013; Godkjent: 19 september 2013; Publisert: 24 oktober 2013
Copyright: © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Novartis Pharma GmbH og Hilf tildelingen av Hannover Medical School. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet er finansiert av Hilf tildelingen av Hannover Medical School og Novartis Pharma. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft er som skjul-og-søker mellom tumorceller og immunforsvaret . Immunsystemet når utfordret av kreft, er imidlertid overfor det problem at MHC selv-uttrykkende celler trenger å bli kontrollert i sin malignitet. Likevel er den bryter av normale celler til kreftceller ledsaget av ekspresjon av tumor-spesifikke peptider i stand til å aktivere T-celler (gjennomgått av [1]). De fleste av disse peptidene stammer fra proteiner ikke utelukkende produsert av kreftceller, men modifisert i sin struktur. T-cellerespons holder tumoren i en stabil eller sovende tilstand [2,3]. Det har vært en akseptert hypotese at det meste av antitumorresponser er formidlet av CD8
+ T-celler og CD4
+ T-celler er begrenset til enten å hjelpe CD8
+ T-celler for effektiv cytotoksisitet [4, 5] eller prim dendrittiske celler (DC) for å forbedre responsen til CD8
+ T-celler [6,7].
I motsetning til dette dogmet siste rapportene avslørt deltakelse av CD4
+ T-celler som kraftige effektorceller med kapasitet for direkte aksjon mot kreftceller fører til regresjon av tumor [8-10]. Det har vist seg at overføring av tumor-antigen-spesifikke CD4
+ T-celler i utfordret men immun-manglende mus kan føre til fullstendig tumorregresjon uten behov for CD8
+ T-celler, NK-celle eller B-celle-hjelp [10 ]. Imidlertid antagelse for alle beskrevet kraftige T-celleresponser er enten en transgen spesifisiteten til T-cellereseptoren (TCR) mot kjente tumorantigener eller isolering og utvidelsen av tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL).
således aktivering av immunresponsen kan observeres, men i løpet av tumorveksten en redigering av immunresponsen inntreffer. Dette omfatter ekvilibrering og til slutt immun rømning av tumorceller ved å indusere resistens [11]. Denne effektive immun unndragelse av svulster skyldes etableringen av en mikromiljøet som tiltrekker undertrykkende myeloide-deriverte celler og regulatoriske T-celler. I tillegg er det cytokin og chemokin-sammensetning, så vel som ekspresjon av visse ligander på tumorceller kan konvertere effektorceller til regulatoriske celler eller drive dem inn i anergi og apoptose (gjennomgått av [11,12]). Kunnskap om denne frem og tilbake av immunsystemet og kreft
er in vivo
fortsatt full av huller således hver ekstra interaksjon av T-celler med tumorceller bidrar til å forstå responsen og unnslippe mekanismer.
i denne studien vi melde om en hittil ikke beskrevet samspillet mellom kreftceller og T-celler, både CD4
+ og CD8
+ T-celler. Dette inkluderer dannelsen kontakt med andre egenskaper enn den immunologiske synapse. Dannelsen av synapsen har blitt grundig undersøkt og involverer flere stadier inkludert pseudopodia, microtubule dannelse og samlokalisering av mitokondrier og endoplasmatiske retikulum [13]. Alle disse egenskapene mangler i kontaktene vi observerte. I stedet kontaktene fører til cytosol utveksling mellom lymfocytter og tumorceller
in vitro Hotell og
in vivo
indusere en pause i spredning av kreftceller. I motsetning til tidligere rapporter forekomme disse kontaktene uavhengig av tilstedeværelse av antigen-presenterende celler. Som en konsekvens av disse interaksjonene er pågående T-celle-delingen som induseres i lymfocytter som innbefatter tumor avledet cytosol. Denne spesifikke fenomen er et nytt aspekt av samspillet mellom immunsystemet med tumorceller.
Resultater
Kontakt dannelse mellom kreftceller og T-celler induserer strømmen av cytosol unassociated med cytotoxocicity
Et kort notat: Forsøkene som er presentert i figur 1 viser samspillet mellom menneskelige PBMC med svin B-celle leukemi linjen L23. Utgangspunktet vi spurte om cellene i denne svine-cellelinje er mål for menneske NK og cytotoksiske T-celler og ment å analysere dette i flowcytometri som vi har utført tidligere ved hjelp av parasitter som mål for NK-celler [14,15]. Som en tilfeldighet fant vi tilpasning av fluorescens av T-celler etter eksponering for L23 celler. Det viste seg videre at denne effekten er ikke et xenogent bestemt fenomen, men kan observeres med humane og murine lymfocytter og flere tumorer av forskjellig opprinnelse. Men denne modellen viste de mest betydningsfulle resultater og således er best egnet for å reflektere denne nye interaksjonen mellom T-celler og tumorceller. Vi er klar over den kunstige systemet siden menneske PBMC og svin kreftceller er lite sannsynlig å bli funnet sammen under naturlige forhold. Således vi begrenset dataene ved hjelp av porcin-celler til figur 1 og deretter byttet til en musemodell.
(A), 2×10
6 humane PBMC eller renset CD4
+ T-celler ble inkubert med 2×10
6 CMFDA-merkede L23-celler i 4 timer, deretter farget for CD3, CD4 og CD8 og analysert i flowcytometri henholdsvis. Eksponering av lymfocytter til L23-celler førte til en inkludering av fluorescens i en rekke T-celler.
(B) Oppsummering av fire uavhengige eksperimenter utført som beskrevet ovenfor. Hyppigheten av grønne fluorescerende T-celler som er knyttet til hovedpopulasjon av PBMC.
(C) PBMC ble pre-inkubert med 5 mM strontiumklorid å indusere degranulering før eksponering til L23 celler. Adpation av fluorescens ble vurdert i CD4
+ og CD8
+ T-celler.
(D) 2×10
6 renset T-celler og 2×10
6 L23 ble inkubert i 4 timer sammen eller adskilt med transwells (TW), de merkede L23 celler på bunnen av en 96well rundbunnet plate og T-celler som er lagt inn i de transwells.
(E) Renset CD4
+ T-celler ble inkubert med L23 cellene i 4 timer, faste og forberedt for elektronmikroskopi (EM). Skanning (i) og overføring EM (ii-iv) viste intens kontakter. Ved overføring EM strømmen av cytosol ble visualisert ved elektron tett cytosol av lymfocytter som er distribuert fra området av kontakter i tumorcellen (piler i (ii) og (iii)). I de høyeste forstørrelse hull i cellemembranene kunne påvises (piler i iv). Hullene dehisced lengde opp til 200nm tillater fri flyt av cytosol og løselige komponenter, men ikke fra cellulære strukturer, f.eks mitokondrier. Imidlertid kan aggregering av mitokondriene i området kontaktdannelse være en indikasjon på energikrevende prosesser.
(F) CD4
+ T-celler ble sortert etter inkubasjon med CMFDA-merket luciferase-transgeneic L23 celler i grønne-fluorescerende og ikke-fluorescerende T-celler. 5×10
4 fraskilt T-celler ble deretter inkubert i medium supplementert med 100 ug /ml luciferin i 96well rundbunnplater. Luminescence ble vurdert etter 30 min inkubasjon ved hjelp av IVIS analyse. 5×10
4 transgeneic L23 celler fungerte som kontroll av luminescens intensitet.
Resultatene er vist som representative bilder og scatter-gram eller oppsummerer 4 uavhengige eksperimenter som gjennomsnitt ± SEM.
for fluorescerende merking av celler vi brukte CellTracker Grønn (5-klor-methylfluorescin diacetate [CMFDA]). CMFDA utgangspunktet er en ikke-fluorescerende molekyl i stand til å passere cellemembranen. I levende celler CMFDA spaltes inn i fluorescerende, sterkt hydrofil skjema bygge en klumpete vannkappe. Dette avverger den ble sluppet gjennom intakt cellemembran av levedyktige celler. CMFDA kan brukes som en markør for levedyktighet siden i tilfelle av cytotoksisk lyse, merkede celler blir ikke-fluoriserende på grunn av tap av CMFDA-holdige cytosol [14]. En analyse i flowcytometri er gjennomførbart hvis effektor og målcellene skiller seg markert i størrelse og dermed kan skilles i fremtidsveis-scatter (figur S1). Men i stedet for tap av fluorescens observerte vi en opptak av fluorescens av lymfocytter etter ko-kultur av tumorceller med PBMC indikerer en overføring av CMFDA molekyler fra en celle til den andre (figur 1A). Tilpasningen av fluorescens ble nesten utelukkende begrenset til T-celler, siden bare en meget liten brøkdel av CD3
– celler ble fluorescerende. Av notatet, den observerte interaksjonen av T-celler med kreftceller kreves ingen tilskuer celler som eksemplifisert ved eksponering av høyt renset CD4
+ T-celler til L23 celler. Også denne innstillingen indusert en markert forholdet mellom grønn-fluorescerende celler (Figur 1a).
Som prikken blot viser, dette samspillet gjaldt et betydelig antall T-celler: I gjennomsnitt 20% av CD4
+ og 7% av CD8
+ T celler blant bulk PBMC ble grønn fluorescerende (figur 1B). Dette fenomen kan bare forklares ved opptak av cytosol som inneholder CMFDA molekyler fra en celle til den annen. Det er bemerkelsesverdig at NK-celler viste ingen tegn til å samle fluorescerende cytosolen tumor avledet, selv om de utviser sterk cytotoksisk aktivitet mot de L23 tumorceller (figur S2). Imidlertid synes cytotoksisitet til å være en fornuftig forklaring på den observerte effekten. Vi testet muligheten for cytotoksisitet å være ansvarlig for utveksling av cytosol ved behandling av PBMC med strontiumklorid (SrCl
2), et reagens som induserer exocytose av lytiske granuler [16]. Dermed behandling med SrCl
2 later cytotoksiske celler ineffektiv. Likevel lymfocytter likevel avdekket en opptak av CMFDA (figur 1C). Dette utgjør både CD4
+ og CD8
+ T-celler som er en indikasjon på at cytotoksisitet er ikke agent for utveksling av cytosol. Faktisk, selv om bare litt observerte vi en økning på fluorescerende tilpasning etter SrCl
2 behandling i begge populasjoner av T-celler. Men kontakt formasjonen var obligatorisk for effekten observert. T-celler og tumorceller ble inkubert enten i ko-kultur eller separert ved transwells. Grønne fluorescerende T-celler kan bare bli detektert etter direkte eksponering til tumorceller, men ikke i Transwell kulturer (figur 1D).
hull i cellemembraner av tumorceller og lymfocytter naive tillate overføring av cytosol inkludert høy molekylvekt molekyler og indusere proliferasjon av T-celler
Vi ytterligere fokusert på interaksjonen av CD4
+ T-celler med tumorceller ved visualisering av kontaktdannelsen. Scanning elektronmikroskopi (SEM) viste intens natur av celle kontakter som fører til polarisering av de samvirkende tumorcelle-lymfocytt-partnere (figur 1E i). Videre transmisjonselektronmikroskopi (TEM) viste, selv ved lav forstørrelse, en strøm av elektron tett cytosol fra T-celle inn i tumorcellen som fremkom ved den høyeste forstørrelse for å bli aktivert av hull i cellemembranen av begge partnere (figur 1E ii-iv). Disse gapene utvidede områder mellom 100-200nm og således bør gjøre det mulig å overføre mer enn bare lavmolekylære komponenter i cytosol, men også molekyler med enzymatisk funksjon av høy molekylvekt. Som følge passasjen av 30 kDa-proteinet luciferase ble målt ved ko-kultur av PBMC med retroviral transdusert luciferase-uttrykkende celler L23. Transduserte L23-celler ble merket med CMFDA og T-celler ble separert etter eksponering til tumorcellene skille den grønne fluorescerende fra det ikke-fluorescerende CD4
+ T-celler. Rensede T-celler ble deretter inkubert med luciferin for å vurdere enzymatisk aktivitet. Faktisk, T-celler med opptak av CMFDA avslørte luminescens, mens de ikke-fluorescerende T-celler som var negative for luciferase-aktivitet (figur 1F). Dette viste tydelig en overføring av cytosol i forbindelse med en utveksling av molekyler som opprettholdt biologisk aktivitet i mottakercellen. Dermed er det av interesse å følge konsekvensene av kontakter for partnerne hvis cytosolic komponenter opprettholde sin biologiske funksjon. I utgangspunktet vi gjorde det i musemodellen
in vitro Hotell og
in vivo
men fant støtte data også med humane lymfocytter og svin tumorceller.
Vi skilles fluorescerende og ikke- fluoriserende CD4
+ T-celler etter eksponering til CMFDA-merkede tumorceller og isolerte celler dyrket uten noen ytterligere stimulering i medium i 5 dager. Vi har funnet uttalt proliferasjon av disse T-celler med inkorporering av tumor avledet cytosol (figur S3). T-celle-ekspansjon kan induseres ved T-celle-reseptor-avhengige og uavhengige retninger. Det er blitt rapportert at T-celler internal TCR etter eksponering for anti CD3 monoklonalt antistoff (mAb) klon OKT3 under visse betingelser [17]. Således anvendes vi protokollen i våre eksperimenter og verifisert forsvinningen av TCR fra celleoverflaten av T-celler. Ikke desto mindre opptak av fluorescens ble ikke opphevet ved behandlingen. Videre blokkering av svin MHC II molekyler med mAb MSA-tre forlot utfallet av cytosol overføring mellom lymfocytter og kreftceller praktisk talt upåvirket. Sist men ikke minst, for opptak av cytosol lymfocyttene ikke trenger å være pre-aktivert. Naive T-celler avslørt kapasitet til å gjennomgå de kontakter med tumorceller minst i samme grad som IL-2 aktivert eller røntget L23 forhånds utsatt T-celler (alle data som er vist i figur S3).
Utveksling av cytosol er ikke begrenset til en viss art og type kreftceller
Bytte til musemodell, vi brukte en svært aggressiv svulst cellelinje BM185, isolert fra BALB /c mus lidelse ALL [18], for å validere det universelle i de observerte kontakter mellom T-celler og kreftceller. Ekspansjonen i musemodellen har i tillegg mulighet for
in vivo
verifisering.
Elektronmikroskopi og flowcytometri analyse bekreftet kontaktene og overføring av cytosol mellom murine T-celler og BM185 celler (Figur 2A og figur S4). Av note, i motsetning til humane PBMC, blant bulk murine splenocytter et godt påvisbar populasjon av CD3
–celler viste evne til å interagere med tumorcellene som resulterer i cytosol-opptak. Ytterligere farging av splenocytter med CD19 identifisert populasjonen som B-celler ved gating på CD3
– celler som var nesten fullstendig CD19
+ (figur 2B), mens det i samsvar med resultatene ved bruk av humane celler, NK-celler var ikke i involvert i cytosol overføring (data ikke vist).
(A), 2×10
6 splenocytter inkubert med 2×10
6 CMFDA-merkede BM185-celler i 4 timer og analysert for fluorescens opptak av T-celler. På samme måte til de menneskelige PBMC musemodell avslørt grønne fluorescerende CD4
+ og CD8
+ T-celler. I tillegg kan et godt påvisbar grønt-fluorescerende populasjon som strekker seg på T-cellepopulasjon observeres i løpet av splenocyttene.
(B) Farging av splenocytter med CD3 og CD19 etter eksponering for tumorceller som er identifisert den ikke-T-cellepopulasjonen i stand til cytosol opptak som B-celler.
(C) Sammendrag av fire uavhengige eksperimenter inkuberingsbetingelser av splenocytter med celler av forskjellige cellelinjer. BNL-celler er ikke tumor avledet mens de andre linjene er tumorceller.
(D) Analyse av MHC II uttrykk for de respektive cellelinjer BM185, KLN-205 og BNL CL.2. Nivået uttrykks korrelerte ikke med utfallet av cytosol overføring
(E) I motsetning til upåvirket CD4
+ T-celler (CMFDA
-)., CD4
+ T-celler avslørende et opptak av svulst avledet cytosol (CMFDA
+) viste tegn til aktivering i henhold til økt uttrykk av CD25 og tidlig aktivering markør CD69 mens CD62L litt redusert. Celler ble inkubert som beskrevet ovenfor (A) med etterfølgende farging av CD4 T-celler og aktiveringsmarkører. Mønsteret for aktivering var annerledes enn den stimulering med 2 ug /ml ConA.
(F) spredningsanalyse av 1×10
4 rensede T-celler avslørende CMFDA opptak etter 4 timers eksponering av splenocytes til merkede BM185 celler. For kontroll ble renset CD4
+ T-celler fra naive mus ble dyrket i medium som det ble utført med sorterte T-celler i 4 dager, og ytterligere 16 timer med
3H tymidin før szintilization.
Resultatene er vist som representative scatter-gram eller oppsummerer minst 3 uavhengige eksperimenter som gjennomsnitt ± SEM.
Generelt murine T-celler hadde en mindre uttalt tendens til å forstyrre tumor celler i forhold til humane T-celler. Selv med L23-celler bare et gjennomsnitt på 10% CD4
+ T-celler ble grønt fluorescerende og dette kombinert med en meget høy standard avvik. Likevel L23 celler indusert det høyeste opptaket av CMFDA (data ikke vist). I tillegg har andre murine cellelinjer inkludert KLN-205 lunge carcinoma celler, foster BNL CL.2 leverceller, mastcytoma celler P815, J558L B celle myelomceller C1498 myeloid kreftceller og levertumorcellelinjer HEPA-1C1C7 og HepA- 1-6 ble testet. Med unntak av BNL-celler, var variabel, men også påvisbart CMFDA overføring for de forskjellige tumorceller funnet (figur 2C). Interessant, selv om permanent dele, BNL CL.2 celler regnes ikke som klassiske kreftceller [19]. Motstanden av BNL CL.2-celler, også tilbys for musemodell anledning til å validere TCR uavhengighet og tumor spesifisitet av effekten. Vi vurderte nivåene av MHC II uttrykk på de ulike cellelinjer. Det viste seg at BM185 og BNL CL.2 uttrykt høyt nivå av MHC II mens KLN-205 celler var helt negative for MHC II (figur 2D). Dermed TCR /MHC interaksjonen synes ikke å være obligatorisk for utveksling av cytosol. Dette er også fremhevet av overføring av cytosol observert mellom B-celler og kreftceller. I tillegg har vi utført eksperimenter med hemagglutinin (HA) -transduced BM185-celler og sammenlignet utfallet av cytosol overføring etter utsettelse for villtype (wt) BALB /c og transgene mus 6.5. 6.5 mus har en karakteristisk befolkning på ca. 20% av CD4 T-celler som uttrykker en HA-spesifikt TCR. Begge stammer som viste en tendens til økt forekomst av celler som viser utveksling av cytosol etter eksponering for BM185-HA i forhold til BM185 celler. Imidlertid splenocytter avledet fra 6,5-mus viste ingen økning frekvens av celler som viser utveksling av cytosol med HA-transgene BM185 celler (figur S5).
Men etter eksponering for kreftceller T-celler viste tidlige tegn på aktivering. Inkubering av splenocytter med BM185 resulterte i opp-regulering av aktiveringsmarkører CD25 og CD69 og marginale endring av ekspresjon av CD62L i T-celler avsløre et opptak av tumor avledet cytosol, mens T-celler uten tilpasning av fluorescens viste ekspresjonsnivåer av aktiveringsmarkører sammenlign mellom ruges lymfocytter (figur 2E). De påviste nivåer av CD25 på middels inkuberes og CMFDA
– T-celler skyldes konstituerende CD25 uttrykk på regulatoriske T-celler og dermed nivåene økt over denne bakgrunn var det tegn til aktivering. Den anslåtte aktivering av T-celler er kombinert med formering av lymfocyttene på samme måte som kunne observeres med humane T-celler i samspill med L23-celler (figur 2f).
registreres overføring av cytosol in vivo
verifisering av cytosol overføring
in vivo
er av stor interesse for å utelukke at det cytosol utveksling er bare på grunn av en
in vitro
artefakt. Derfor ble CMFDA-merkede BM185 celler injisert intravenøst (i.v.) i BALB /c mus, og musene ble avlivet 6 timer etterpå. Deretter milt, lymfeknuter og benmarg ble kontrollert for BM185 celler, men bare i milten kunne rekke tumorceller bli påvist (data ikke vist), som ble kombinert med utseendet av grønt-fluorescerende CD4
+ T-celler (figur 3A) . I tråd med
in vitro
resultater, også
in vivo
lymfocytter med affinitet cytosol opptak kan bli funnet i populasjoner av CD8
+ T celler og B-celler (Figur 3B ).
(A) 1×10
7 CMFDA-merket BM185 ble injisert intravenøst. 6 timer senere ble musene avlivet og milten, lymfeknuter og benmarg ble homogenisert. 5×10
7-celler ble farget for CD4 og tellet i flowcytometri og andelen av grønne fluorescerende lymfocytter ble vurdert.
(B) Bestemmelse av fenotypen til grønn fluorescerende splenocyttene til 6 timer etter i.v. anvendelse av 1×10
7 CMFDA-merket BM185. I tillegg til CD4
+ og CD8
+ T-celler, også
i
vivo
B-celler (B220
+ celler) avslørte CMFDA opptak.
Resultatene er vist som representative scatter-gram 3 uavhengige eksperimenter.
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP slutter prolifererende etter opptak av T-celle avledet cytosol som fører til forlenget overlevelse av mus
Strømmen av cytosol er ikke en enveis veien, men kan observeres i begge retninger. Således ikke bare T-celler ble grønt-fluorescerende etter eksponering for CMFDA-merkede tumorceller, men også en andel av tumorceller ble grønn-fluorescens etter inkubering med CMFDA-merkede lymfocytter (Figur 4A). Å følge overføringen av Lymfocytavledet cytosol BM185 cellene ble merket med CellVue Maroon, et fargestoff som er innlemmet i lipid regioner av membraner med uthevede bemerkning til produsenten av minimal uspesifikke overføring mellom cellene. Ved å utsette CellVue-merkede tumorceller til lymfocytter var vi i stand til å påvise en positiv fraksjon med CellVue induserte fluorescens på CD4
+ T-celler som indikerer en overføring av deler av cellemembran av tumorcellene til overflaten av lymfocytter (Figur 4B ). Det er overbevisende validering av inntrykket av fusjon av cellemembraner som vist ved TEM (figur 2 og figur S4).
(A) BM185 celle ble merket med CellVue å skille befolkningen av kreftceller fra CMFDA-merkede lymfocytter. Tumorceller og splenocytter ble inkubert i like mange i 4 timer og opptak av CMFDA ble bestemt ved flow-cytometri. . Videre, BM185 ble separert ved cellesortering i ikke-fluorescerende og fluorescerende celler
(B) Vurdering av overføring av membrankomponenter fra CellVue merket BM185 til lymfocytter etter eksponering av celler i et forhold på 1: 1 til 4 h. CellVue inkorporerer i lipid regioner av cellemembraner.
(C)
3H tymidin inkorporering av BM185 celler eksponert for CMFDA-merkede splenocytter fra BALB /c og deretter separert ved FACS-cellesortering i tumorceller som utveksles cytosol med muse lymfocytter (CMFDA
+) eller de som forble upåvirket (CMFDA
-). Celler ble dyrket i 3 dager i 96 brønners plater og 16 timer etter tilsetning av radioaktivt tymidin.
(D) Overlevelse kurve av BALB /c mus etter i.v. injeksjon med 1×10
4 BM185-celler (5 mus pr gruppe /eksperiment, representerer overlevelseskurven to uavhengige eksperimenter, således n = 10) med eller uten opptak av CMFDA etter eksponering for CMFDA-merkede murine splenocytter. Forløpet av BM185 fremkalte leukemi er reproduserbar. Overlevelsen av BM185 celler uten opptak av lymfocytter avledet cytosol svarer helt til denne kjente nedgang av viablitiy. I motsetning til dette, mus injisert med BM185 innlemmet splenocytter avledet cytosol levde signifikant lengre (p ≤ 0,0042).
Resultatene er vist som representative scatter-gram eller oppsummerer 2-4 uavhengige eksperimenter som gjennomsnitt ± SEM.
Vi skilles BM185 celler i fluoriserende og ikke-fluorescerende etter eksponering for murine splenocytter . De isolerte tumorceller ble dyrket i 4 dager med påfølgende vurdering av
3H-tymidin inkorporering. Overraskende nok kan en drastisk reduksjon av proliferasjon av BM185 celler etter absorpsjon av lymfocytter avledet cytosol bli målt (figur 4C). Dette var bare et midlertidig opphør av cellesyklus. 7 dagers dyrking avslørte også påvisbar spredning til og med av tumorcellene som gjennomgikk overføring av cytosol (data ikke vist).
Bruddet av tumorcelledelingen kan ha mulige konsekvenser for overlevelse av BALB /c mus. Av notatet, BM185 celler er svært ondartet forårsaker en aggressiv løpet av ALLE. Selv en lav dose på 10
4 celler fører til død i løpet av 20 dager. BM185 celler som dukket opp ikke-fluorescerende etter eksponering for splenocytes avdekket en svært reproduserbar løpet av dødelighet. I motsetning til dette, mus injisert med BM185 som inkluderte cytosol fra splenocytter levde signifikant (p ≤ 0,0042) lenger og 20% av musene (to av ti) til og med overlevde utfordringen med tumorceller (Figur 4D).
T-celler utveksle cytosol spesielt med tumorceller, men ikke med sunne celler
Spørsmålet gjenstår: Er dette en eksklusiv samspill av T-celler med kreftceller? Og hvis så: Er effekten begrenset til tumorcellelinjer eller gjøre primærtumorceller også indusere dette fenomenet? Det siste spørsmålet er av interesse siden cytosol overføring med primærtumorceller ville bekrefte klinisk betydning spesielt når de vurderer at immunforsvaret blir aktivert av celle kontakter med tumorceller og svulsten avslører en midlertidig arrest i celledeling.
som utført med murine splenocytter, ble forsøkene gjentatt ved å eksponere forskjellige tumorcellelinjene til humane PBMC. Vi valgte BM185 celler som en ekstra xenogene tumor linje, humane B-celle-lymfom-celler og lever tumorcellelinje HepG2. I forhold til L23 celler effekten var mindre uttalt i alle de testede cellelinjer. Imidlertid kan en tydelig opptak av cytosol ved CD4
+ T-celler etter co-kultur med alle tumorcellelinjer bli observert (figur 5A). Interessant, BM185 celler også indusert innen menneske PBMC en tilpasning av fluorescens i 5% av CD4
+ T-celler fra bulk PBMC akkurat som med muse syngene splenocytter. Dermed blir tydelig utveksling av cytosol med L23-celler kan ikke bare forklares ved xenogeneiske innstillingen.
(A) Eksponering av PBMC for forskjellige CMFDA-merkede tumorcellelinjer, inkludert den xenogene porcin L23 celler og murine BM185-celler, så vel som den humane B-celle lymfom T5.1 og Laz, Jurkat T-cellelinje og den hepatokarsinom celler HepG2. Med alle de testede tumorcellelinjer en overføring av cytosol ble vurdert. I motsetning til menneske PBMC utsatt for sunne CMFDA-merket PBMC fra samme blodgiver (syngene) eller annen blodgiver (allogen) viste ingen tilpasning av fluorescens.
(B) Primære hepatocytter avledet fra friske vevet eller HCC og HepG2-celler ble dyrket i 3 dager i kammers objektglass for å oppnå en løs monolag av celler. Hepatocytter ble merket med CMFDA og inkubert med 5×10
5 PBMC for 4 timer. Celler ble fiksert og lufttørket med påfølgende farging for CD4 (rød, bare HCC og HepG2) og kjernen (blå). Mikroskopi avslørte et opptak av grønn fluorescens av lymfocytter bare hvis de utsettes for tumorceller. Ytterligere farging av CD4 bekreftet at noen av de deltagende cellene er CD4
+ T-celler.
Resultatene er vist som representative bilder og XY-gram eller sammenfatte 3 uavhengige eksperimenter som gjennomsnitt ± SEM (med unntak av (B ) som oppsummerer minst 6 forsøk).
Dermed kreftceller indusert utveksling av cytosol. For å kontrollere om denne effekten var spesifikk for tumorceller menneskelige PBMC ble inkubert med CMFDA merkede allogene PBMC eller autologe PBMC avledet fra friske blodgivere. Vi fant ikke opptak av CMFDA sammenlign når tumorceller ble brukt (figur 5A). Av notatet, gjorde splenocytter fra Lewis rotter avlet under spesifiserte-patogen gratis (SPF) betingelser ikke provosere tilpasning av fluorescens i menneskelige PBMC, også (data ikke vist).
For å utelukke at denne effekten var forårsaket av tumorcellelinjer som ofte indusert og stabilisert av virus (som for L23 celler, [20]) primærtumorceller avledet fra humant HCC ble dyrket med allogene PBMC. Siden vi utelukket muligheten av cytosol transport allogeneiske donor-celler, blir de observerte effekter tolket til å være relatert til tumorcellene. Ved hjelp av mikroskopiske teknikker en sprek opptak av CMFDA etter eksponering av PBMC til HCC celler var synlig. Som kontroll ble friske primære humane hepatocytter inkubert med PBMC som ikke induserer en overføring av fluorescens (figur 5B).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
