Abstract
Utvikling av resistens mot gemcitabin er et stort problem i blærekreft terapi, og mekanismen er fortsatt uklart. EG5 har nylig blitt identifisert som et attraktivt mål i kreft kjemoterapi, så romanen målrettet kjemoterapi med EG5 hemmer forventes å forbedre kreft effekt i gemcitabin-resistente blærekreft. I denne forskning, RT112-Gr-celler var 350-ganger mindre sensitiv for gemcitabin enn foreldrecellelinjene, mens KU7-Gr-celler var 15 ganger mindre følsom for gemcitabin enn foreldrecellelinjer. ble utført menneskelig OneArray Microarray analyse for å få bredspektret informasjon om genene forskjellig uttrykt i RT112 og RT112-Gr celler. Den anti-proliferative aktivitet av S (MeO) TLC, en EG5 inhibitor, ble analysert i RT112-Gr-cellelinjer under anvendelse av en cellelevedyktighet assay. Videre ble den hemmende virkning evaluert in vivo ved hjelp av subkutan xenograft tumormodell. Ifølge et resultat av menneskelig OneArray® Genechip, RRM1 og RRM2 ble oppregulert, mens det var ingen signifikant endring i EG5. Trypan blå farging bekreftet at i S (MeO) TLC og Gemcitabin kombinere S (MeO) TLC gruppe cellenes levedyktighet ble signifikant redusert i RT112-Gr-celler sammenlignet med andre grupper. S (MeO) TLC og S (MeO) TLC + gemcitabin grupper fremtredende undertrykket tumorvekst i sammenligning med andre grupper «in vivo. Det var ingen signifikante forskjeller i S (MeO) TLC og gemcitabin + S (MeO) TLC gruppe i effekten av inhibering av blærekreft in vivo og in vitro. Våre data kollektivt vist at S (MeO) TLC representerer en ny strategi for behandling av gemcitabin motstandsdyktig blærekreft
Citation. Sun L, Lu J, Niu Z, Ding K, Bi D, Liu S, et al. (2015) en potent kjemoterapeutisk strategi med EG5 Inhibitor mot gemcitabin Resistant blærekreft. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10,1371 /journal.pone.0144484
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 16 oktober 2014; Godkjent: 19 november 2015; Publisert: 10.12.2015
Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Vi har lastet opp dataene til ArrayExpress. URL data omtale. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av midler fra stiftelsen av Kina National Natural Science (nr 81202017) (https://www.nsfc.gov.cn), Foundation Natural Science of Shandong-provinsen (No. ZR2011HQ027 og nr ZR2014HQ041) (https://www.sdnsf.gov.cn), og Foundation Science and Technology Research i Shandong-provinsen (nr 2012YD18049) (https://www.sdnsf.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BCA) representerer den fjerde vanligste kreftformen i USA [1,2]. Omtrent 25% av blærekreftpasienter er diagnostisert med muskel-invasiv blærekreft (MIBC), selv om 75% av nydiagnostiserte svulster er ikke-muskel invasiv (Ta, Tis, og T1); de fleste av dem går igjen og 15-20% fremgang å invadere tunica muskularis. Og de aller fleste kreftspesifikke dødsfall skyldes MIBC, som fører til lokal invasjon og fjernmetastaser [3, 4]. Dødeligheten av sykdommen oppfordrer urologer å utforske nye metoder for å behandle blærekreft [5]. Kjemoterapi med gemcitabin og cisplatin er det mest populære alternativet for blærekreft. Gemcitabin er en analog av deoxycytidine med høy aktivitet mot mange typer solide tumorer inkludert bukspyttkjertelen, cervical, eggstokk, bryst, blære, og ikke-småcellet lungekreft [6,7]. Imidlertid er utviklingen av resistens mot gemcitabin nå et stort problem å urologenes. Til tross for en rimelig svarprosent etter innledende kjemoterapi hos pasienter med metastatisk blærekreft, 60-70% av pasienter som responderer tilbakefall innen det første året, med en median overlevelse på 12-14 måneder. Denne begrensede effekt kan skyldes de novo medikamentresistens og utvikling av cellulær resistent fenotype under behandlingen, [8].
imidlertid de underliggende mekanismene for å indusere kjemoterapi motstand ved Gemcitabin er imidlertid ukjent. Nylig, gjennom studiet av kreft i bukspyttkjertelen, Nakahira S et al rapporterte en viktig faktor i gemcitabin motstanden var overekspresjon av ribonukleotid-reduktase (RR) [9]. RR består av dimeriserte store og små underenheter, henholdsvis M1 og M2. M1 subenheten besitter et bindingssete for enzymet regulering (regulatorisk subenhet), og M2 subenhet er involvert med RR aktivitet (katalytisk subenhet) [10]. RRM1 er ment for å spille en rolle i gemcitabin motstand av mangfoldet av kreft som metabolske enzymer av medikamentet [9, 11]. RRM1 er ikke bare et cellulært mål for gemcitabin, men også en tumor suppressor. Prekliniske studier har vist sitt engasjement i undertrykkelsen av kreftcelle spredning, migrasjon, og metastase [12, 13]. I noen kreftformer, et høyt nivå av mRNA RRM2 korrelerer med kjemoterapeutisk resistens, cellulær invasivitet og misfornøyd prognose, noe som tyder på at RRM2 bidrar til ondartet progresjon og er et potensielt terapeutisk mål. Det er imidlertid begrenset informasjon om RRM1 og RRM2 protein ekspresjon i blærekreft, og så vidt vi vet er ingen rapporter foreligger som beskriver rollen til RRM i ferd med legemiddelresistens i blærekreft. Dessuten har noen nylige studier indikerer at RRM spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av humane karsinomer, men den kliniske betydning av RRM-ekspresjon i BCA er fortsatt uklar.
På den annen side er det av stor betydning å utforske nye blærekreft kjemoterapeutiske strategi. Målrettede medikamenter ved behandling av urinveis tumorer i de senere år viste lovende resultater. Våre tidlige studier har funnet at EG5 hemmere som målrettede legemidler in vivo og in vitro behandling av prostatakreft og blærekreft skal ha tilfredsstillende helsebringende effekter [14, 15]. EG5, en nøkkel molekyl som er involvert i dannelsen av bipolare spindler, er en av de mest attraktive målenzymer i antimitotisk drug discovery [16]. EG5 står for mange av de bevegelser av spindelen og kromosomer i delende celler og lokaliserer til spindelen i mitotiske delende celler [17]. Et interessant trekk ved EG5 er at den lokaliserer til mikrotubuli i mitosen, men ikke å interfase mikrotubuli, noe som tyder på at en EG5 inhibitor kan være nyttig spesifikt mot voksende svulstvev [18]. Flere kjemiske typer små molekyl EG5 hemmere har blitt rapportert [16]. S- (4-metoksytrityl) -L-cystein (S (MeO) TLC), et derivat av S-trityl- L-cystein (STLC), kan spesifikt inhibere EG5, og indusere monopolar mitotisk spindel formasjon [14, 15]. Svikt i EG5 funksjon fører til cellesyklus arrest i mitose med monoastral mikrotubulidynamikk arrays. Den viktige rollen EG5 i mitotisk progresjon gjør det til en attraktiv kandidat for å utvikle målrettet behandling av kreft [19]. Det er imidlertid ingen studie av EG5 inhibitor behandling av gemcitabin resistent blærekreft.
I denne studien ble en gemcitabin-resistente humane blærecancercellelinje ble etablert, og rollen til RRM1 og RRM2 i utviklingen av gemcitabin motstand ble først undersøkt. Vi vurderte også effekten av anticancer effekten av EG5 målrettet terapi in vitro og in vivo, med formål å tilby en bedre klinisk behandlingsstrategi for pasienter med gemcitabin motstandsdyktig blærekreft.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Provincial Hospital Affiliated til Shandong University (Permit Number: 2013-026). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Blærekreft vev ble samlet inn fra Shandong Provincial Hospital Affiliated til Shandong University. Før studien ble protokollen godkjent av etikkomiteen av Provincial Hospital Affiliated til Shandong University (Permit Number: 2012-033). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Cells, reagenser og klinisk prøver
Blærekreft cellelinje RT112 og KU7 ble brukt i denne studien, og dyrket som beskrevet tidligere [14,20]. RT112 og KU7 cellelinjer ble kjøpt fra cellen bank av Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). RT112 og KU7 celler ble hovedsakelig brukt i følgende studien, som stammer fra ikke-invasiv blærekreft. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, og inkubert ved 37 ° C med en fuktig 5% CO
2 atmosfære.
EG5 inhibitorer S (MeO) TLC ble anskaffet fra Bachem (Bubendorf, Sveits) og ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Antistoff anti-RRM1 og anti-RRM2 (Rabbit) ble kjøpt fra Abcam (USA); IRDye 800CW konjugert geit anti-kanin IgG var fra Li-Cor biovitenskap (USA). Prime Script RT-PCR kit ble kjøpt fra Takara (Kina). TRIzol ble kjøpt fra Invitrogen (USA).
140 tilfeller av blærekreft vev ble samlet inn fra Shandong Provincial Hospital Affiliated til Shandong University fra desember 2005 til mars 2007. Strålebehandling, kjemoterapi og immunterapi ble ikke utført før operasjonen og alle prøvene ble bekreftet av to patologi etter operasjonen.
Etablering av gemcitabin-resistente cellelinjer
gemcitabin-resistente celler ble utviklet av kronisk, gjentatt eksponering for gemcitabin om gradient kultur. Den etablerte resistente cellelinjen ble opprettholdt i medium inneholdende 45 nmol /L av gemcitabin. For alle studier, resistente celler ble dyrket i medikamentfritt medium i 1 uke for å eliminere gemcitabin. Gemcitabin-resistente celler blir omtalt som RT112-Gr celler og KU7-Gr. IC50 av gemcitabin-resistente RT112 celler til gemcitabin er 4.2umol /L. IC50 av gemcitabin-resistente KU7 celler til gemcitabin er 0.285umol /L. Så vi velger RT112-Gr celler som fag i følgende eksperimenter.
Menneske OneArray Microarray
Total RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens (Invitrogen, Shanghai, CN) og sendt til Phalanx Biotech Group (Shanghai, CN) for uttrykk microarray analyse. Triplikate hybridiseringer for hver prøve ble utført ved anvendelse av humant full-genom OneArray 6,1.
RRM1 og RRM2 ekspresjon analyse av IHC
Immunhistokjemisk analyse ble utført for å bestemme RRM1 og RRM2 ekspresjon i blærekreft, så tidligere beskrevet [21]. Anti-RRM1 og anti-RRM2 antistoffer ble begge anvendt i en fortynning på 1: 100. Negative kontrollprøver besto av lysbilder hvor det primære antistoff hadde vært utelatt. Tilfeller ble bedømt til å ha positiv farging hvis 10% av cytoplasmaet av tumorcellene var farget. Tumor klasse og scenen ble evaluert ved hjelp av standard hematoxylin og eosin (H E). Farging
Hemming av RRM1 /2 uttrykk av RNA interferens
RT112-Gr Cells (2×10
5) ble sådd i 6-brønners plater i tre paralleller, og etter 12 timer inkubasjon ble cellene transfektert med ulike konsentrasjoner av siRNA bruker HiPerfect Reagens (Qiagen) i samsvar med produsentens anvisninger. Den lille forstyrrelser RNA brukes til å målrette RRM1 /2 mRNA sekvens ble syntetisert av Qiagen.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet etter behandling med EG5 hemmere ble vurdert ved hjelp av 3- (4, 5- dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, som beskrevet tidligere [20]. Celler (2 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert i 24 timer. Etter det, gemcitabin, S (MeO) TLC, gemcitabin + S (MeO) TLC og bærer (DMSO) ble tilsatt ved den angitte konsentrasjon i triplikate brønner og cellelevedyktighet ble målt etter 24 timer, 48 timer og 72 timer etter behandling, henhold . Konsentrasjonene av 50% hemming av cellevekst (IC50) ble beregnet i henhold til SPSS17.0 Software.
Hoechst farging
Etter administrasjon med 45nm gemcitabin, 0,5 pm S (MeO) TLC, 45nm gemcitabin + 0,5 pm S (MeO) TLC eller vehikkel i 24 timer, 48 timer og 72 timer ble RT112-Gr-celler farget med 1 mM Hoechst 33342-oppløsning (Santa Cruz, Dallas, USA) for nukleær farging og analysert med et fluorescens mikroskop. Cellene med typisk kondensering og fragmentering av kjernene ble visualisert og identifisert som apoptotiske celler.
revers transkripsjon-PCR-analyse
RRM1 og RRM2 uttrykk i blærecancercellelinjer ble bestemt ved RT-PCR analyse ved hjelp av standardmetoder, som tidligere beskrevet [22]. Total RNA ble ekstrahert fra RT112 og RT112-Gr cellepelletene ved hjelp av TRIzol reagens og forsterkes ved revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) i henhold til produsentens instruksjoner, respektivt. Et husholdningsgenet, glyceraldehydes fosfat dehydrogenase (GAPDH), ble anvendt som en endogen kontroll. GAPDH og RRM1 og RRM2 primere ble konstruert ved hjelp Primer 5 Programvare og verifisert ved DNA-sekvensering analyse. GAPDH (1382 bp) primere var: Spiss: 5′-GATGCTGCGCCTGCGGTAGA-3′, Omvendt: 5′-TTGGTTGAGCACAGGGTAC-3′; RRM1 (391bp) primere var: Spiss: 5′-GTTGTATTCGGGCTACTGG-3′, Omvendt: 5′-ACTTTGCGGACACGACCT-3′; RRM2 (882bp) primere var: Spiss: 5′-GCCGCTTTGTCATCTTCC-3′, Omvendt: 5′-TCCTCTGATACTCGCCTACT-3′. PCR-produktene ble deretter underkastet elektroforese på 1,0% agarosegel og visualisert ved en transilluminator. Pikselintensitet for hvert band ble bestemt ved bruk av AlphaImager
TM2200.
Animal eksperiment
Seks til åtte uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Vital River Company (Beijing, Kina). Studien ble innhentet godkjenning fra komiteen i forsøksdyr av Shandong Provincial Hospital of Shandong University og vår omsorg var i samsvar med institusjonens retningslinjer.
For subkutane xenograft modeller, ca 4 × 10
6 RT112-Gr celler (suspendert i 100 ul PBS) ble inokulert subkutant i begge flanker pr mus, som tidligere beskrevet [23]. Tumorvolumet ble beregnet som følger: volum = Bredde
2 x lengde /2. Når svulster var håndgripelig og målbar (ca 50mm
3), ble 20 mus tilfeldig delt inn i fire grupper og behandlet en gang daglig (fem dager i uken) ved intraperitoneal injeksjon med DMSO (kjøretøykontroll), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemcitabin i 5 dager. Mus legeme veier og tumorstørrelsene ble målt hver annen dag. De andre musene ble avlivet på den 21. dagen etter første behandling, og svulster ble også skåret ut og parafin-embedded for H . E farging
Statistisk analyse
Betydningen av forholdet mellom RRM1 og RRM2 uttrykk og clinicopathological parametre ble evaluert med chi-squared tester og to-veis ANOVA. Middel ble sammenlignet ved å bruke en to-halet studentens
t
test og den inhiberende aktivitet av S (MeO) TLC og gemcitabin på xenograft-modeller ble utført med en to-veis ANOVA, fulgt av S-N-K-test. SPSS 17,0 programvare ble anvendt som statistisk analyse.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Globalt genekspresjonsanalyser i RT112 og RT112-Gr cellelinjer
RT112-Gr celler var 350 ganger mindre følsom for gemcitabin enn foreldrecellelinjer, som IC50 var 4,2 umol /l i tidligere. KU7-Gr-celler var 15 ganger mindre følsom for gemcitabin enn foreldrecellelinjer, som IC50 var 0.285umol /l i førstnevnte. ble utført microarray analyse for å få bredspektret informasjon om genene forskjellig uttrykt i RT112 og RT112-Gr celler. Resultatene fra RT112 og RT112-Gr celler RNA ble forsterket, fragmentert, merket og hybridisert til Genechip mikromatriser. Av de 55752 gener er representert i Human OneArray® Genechip, 442 viste signifikant oppregulert og 235 nedregulert. Blant dem, P-verdi (uttrykt forskjellig) av RRM1 er 0,046, og RRM2 er 0,021, mens EG5 (KIF11) er 0,323. Våre microarray resultater har blitt lastet inn i et offentlig register som heter «ArrayExpress», Datagjennomgang URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/
Clustering ble utført for å visualisere sammenhenger mellom replikatene og varierende prøveforhold. En undergruppe av differensial genene ble valgt for clustering analyse. En intensitet filter ble brukt for å velge gener hvor forskjellen mellom den maksimale og minimale intensitetsverdier overskrider 1000 blant alle mikromatriser. For denne microarray prosjektet, antall gener gruppert var 227 (fig 1).
Clustering ble utført for å visualisere sammenhenger mellom replikatene og varierende prøveforhold. Opp- og ned-regulerte gener er representert i røde og grønne farger, henholdsvis. En undergruppe av differensial gener ble valgt for clustering analyse. En intensitet filter ble brukt for å velge gener hvor forskjellen mellom den maksimale og minimale intensitetsverdier overskrider 1000 blant alle mikromatriser. For denne microarray prosjektet, antall gener gruppert var 227.
RRM1 og RRM2 uttrykk analyse i blærekreft vev og cellelinjer
Immunhistokjemisk analyse ble utført for å analysere RRM1 og RRM2 uttrykk i kirurgisk resected eksemplarer av blærekreft. RRM1 og RRM2 farging ble lokalisert i cytoplasma. Det var 98 mannlige og 42 kvinnelige, med 65 lav grad av saker og 75 høyverdig tilfeller i histologisk grad. Fargingen reaktiviteten av anti-RRM1 og anti-RRM2 ble vist i tabell 1 og figur 2, henholdsvis. RT-PCR-analyse ble plottet for å identifisere RRM1 mRNA og RRM2 mRNA uttrykk i RT112 og RT112-Gr cellelinjer. RT-PCR videre demonstrert at RT112-Gr-celler hadde betydelige økninger i nivået av RRM1 og RRM2 mRNA sammenlignet med foreldreceller (
p
0,001)., Henholdsvis (figur 3)
A: Immunhistokjemisk farging av RRM1 og RRM2 i kliniske vev. RRM1 og RRM2 immunfarging ble betraktet som positive hvis 10% av cytoplasmaet til kreftceller viste svak eller større intensitet. (I) høy ekspresjon av RRM1 i klinisk blærekreft. (Ii) lav ekspresjon av RRM1 i klinisk blærekreft (III) høy ekspresjon av RRM2 i klinisk blærekreft. (Ⅳ) Lav uttrykk for RRM2 i klinisk blærekreft (alle tall ble tatt til fange på 400 × forstørrelse). B: (I) Bar grafen illustrerer kombinert farging score for RRM1 uttrykket i henhold til tumor klasse. (II) Bar grafen illustrerer kombinert farging score for RRM2 uttrykk i henhold til tumorstadium (Fargen svart og grå representerer svakt og sterkt positive, henholdsvis).
RT-PCR for RRM1 og RRM2 mRNA uttrykk i blære kreft cellelinjer. GAPDH tjente som lasting kontroll. Søylediagram illustrerer RRM1 og RRM2 mRNA uttrykk i RT112, RT112-Gr og siRNA-RT112-Gr blærekreftcellelinjer. (
p
0,001).
siRNA-mediert knockdown av RRM1 /2 i RT112-Gr blærekreftceller
For å vurdere virkningene av RRM1 /2 på RT112-Gr blærekreft cellelinjer, RRM1 /2-genet var knockdown, henholdsvis (figur 3). RT112-Gr celler ble ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin (GEM), RNAi-mediert knockdown av RRM1 og RRM2 i RT112-Gr blære kreft celler ble ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin (GEM). Syttito timer senere levedyktighet ble analysert ved hjelp av Trypan blå farging. RNAi-mediert knockdown av RRM1 og RRM2 + GEM, hemme tumoreffekt er den beste blant de fire gruppene. Kvantifisering av hver verdi er fra tredoble uavhengige forsøk (figur 4).
RT112-Gr celler ble ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin (GEM), RNAi-mediert knockdown av RRM1 (A) og RRM2 (B ) i RT112-Gr blære kreft celler ble ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin (GEM). Syttito timer senere levedyktighet ble analysert ved hjelp av Trypan blå farging. RNAi-mediert knockdown av RRM1 (A) og RRM2 (B) + GEM, hemme tumoreffekt er den beste blant de fire gruppene. Kvantifisering av hver verdi er fra tredoble uavhengige forsøk. (
p
0,01).
Antlproliferative effektene av S (MeO) TLC og gemcitabin på gemcitabin-Resistant blærekreftcellelinjer
For å vurdere anti -proliferative effekt av gemcitabin og S (MeO) TLC på blærekreft cellelinjer RT112-Gr, ble de stående ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin, 0,5 pm S (MeO) TLC eller begge sammen (gemcitabin + S (MeO) TLC) i 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis. Gemcitabin og S (MeO) TLC trykkes cellevekst på en tidsavhengig måte og viste den mest fremtredende undertrykkelse karakter i 72 timer. De IC50s av RT112 og RT112-Gr mot gemcitabin i 72 timer var 0.012μM og 4.2μM, mens IC50s av RT112 og RT112-Gr mot S (MeO) TLC var henholdsvis 210μM og 290μM, (fig 5).
A: IC50s av gemcitabin i KU7, KU7-Gr RT112 og RT112-Gr i 72 timer. B: De IC50s av S (MeO) TLC av KU7, KU7-Gr RT112 og RT112-Gr i 72 timer. C: KU7-Gr og RT112-Gr celler ble ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin (GEM), 0,5 pm S (MeO) TLC eller begge sammen (GEM + S (MeO) TLC). Syttito timer senere levedyktighet ble analysert ved hjelp av Trypan blå farging. S (MeO) TLC og GEM + S (MeO) TLC, hemme tumoreffekt er den beste blant de fire gruppen. Kvantifisering av hver verdi er fra tredoble uavhengige forsøk. (
p
0,01).
Induksjon av apoptose ved S (MeO) TLC og gemcitabin i gemcitabin-Resistant blærekreftcellelinjer
Hoechst 33342 atom farging viste at ble observert typiske monopolare spindel mitotiske celler med en karakteristisk rosett-lignende fenotype i den mitotiske fase ved 24 timer etter eksponering for gemcitabin 45nm, 0,5 pm S (MeO) TLC, 45nm gemcitabin + 0,5 pm S (MeO) TLC eller kjøretøy og karakteristiske apoptotiske celler med kjernekondensering og fragmentering ble også identifisert i 48 timer etter eksponering (fig 6)
A:. RT112-Gr celler ble ubehandlet; B: RT112-Gr celler ble behandlet med 45nm gemcitabin; C: RT112-Gr-celler ble behandlet med 0,5 pm S (MeO) TLC; D:. RT112-Gr-celler ble behandlet med begge sammen (45nm gemcitabin + 0,5 pm S (MeO) TLC) i de angitte tidsrom og deretter kjernemorfologi ble undersøkt med Hoechst farging og visualisert ved fluorescens mikroskopi
Trypan blå farging bekreftet at i gemcitabin + S (MeO) TLC gruppe og S (MeO) TLC gruppe cellenes levedyktighet ble signifikant redusert i RT112-Gr og KU7-Gr-celler sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5).
Effekter av S (MeO) TLC og gemcitabin ved blærekreft xenograft modell
i den første analyse av anticancer aktivitet av S (MeO) TLC i subkutane xenograft-modeller, tumorvolum ble undersøkt etter behandling med DMSO (bærerkontroll), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemcitabin. Etter 3 ukers observasjon ble det funnet at S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabin (50 mg /kg) og S (MeO) TLC (20 mg /kg) grupper fremtredende undertrykket tumorvekst i sammenligning med gemcitabin (50 mg /kg ) og DMSO (kjøretøykontroll). Kroppsvekttap ble ikke observert i noen av behandlingsgruppene. Nekrose ble observert på tumoroverflaten S (MeO) TLC (20 mg /kg) og S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabin (50 mg /kg) behandlingsgruppe, selv om ingen åpenbar nekrose ble observert i kontrollgruppen . Tumor volumforandringer av musene ble sammenlignet mellom behandlings- og kontrollgrupper, forskjellen i midlere endelige tumorvolum mellom de fire gruppene var statistisk signifikant (figur 7).
A. Etter vellykket etablering av subkutane xenograft tumorer, DMSO (bærerkontroll), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller begge deler (S (MeO) TLC + GEM) ble administrert intraperitonealt daglig i 5 dager (piler) . Tumorvolumene ble målt hver annen dag. B. Den midlere kroppsvekt av mus ble vurdert annenhver dag. Det er ingen signifikant forskjell mellom tre grupper (
P
0,05).
Diskusjoner
Chemoresistance er en viktig årsak til svikt i behandling for blærekreft med gemcitabin. Derfor er det ekstremt viktig å klargjøre mekanismen for chemoresistance og identifisere prediktive markører for iboende og ervervet chemoresistance til gemcitabin [24]. Ribonukleotidreduktase (RR) er et heterotetramer og aktivitet krever to 90kDa store underenheter og to 45kDa små subenheter. Enzymet er avgjørende for tilførsel av deoxynucleosid for de novo syntese av DNA, og så for celleproliferasjon. Den består av dimeriserte store og små underenheter, M1 og M2. RRM1 er en stor peptidkjede (α), mens RRM2 er et lite protein subenheter av RR (β). Selv om den enzymatiske aktiviteten til RR moduleres av nivåer av RRM2, kan RRM1 spille en viktig rolle blant de 2 subenheter i løpet av gemcitabin behandling [9, 13]. Rollen RRM1 i RR-formasjonen har også gjort det til et attraktivt molekylære mål for utvikling av kjemoterapeutika, for eksempel gemcitabin [13].
Gene uttrykk ved mikromatriser analysen gir et kraftig middel til å skaffe oversikt over genekspresjon og fysiologiske prosesser involvert i tiltak mot bestemte stimuli. I denne studien har vi etablert gemcitabin-resistente human blærekreft cellelinjer RT112-Gr og KU7-Gr, RT112-Gr celler var 350 ganger mindre følsom for gemcitabin enn foreldrecellelinjer, mens KU7-Gr celler var 15 ganger mindre følsom for gemcitabin enn foreldrecellelinjer. Så vi velger RT112-Gr celler som fag i følgende eksperimenter. microarray analyse ble brukt for å undersøke genuttrykk endringer mellom RT112 og RT112-Gr celler. Våre resultater tyder på at 442 gener, inkludert RRM1 og RRM2, ble oppregulert, mens 235 gener nedregulert i RT112-Gr celler. EG5 endringen var ikke opplagt. Vår nåværende studie viser at RRM1 og RRM2 er involvert i gemcitabin motstand i human blærekreft. I cellen, er gemcitabin fosforylert til monofosfat, difosfat, trifosfat eller før dets inkorporering i DNA, som er nødvendig for dens vekst inhiberende aktivitet. Den diphosphorylated formen av gemcitabin virker som en RR-inhibitor, som er årsaken til gemcitabin cytotoksisk aktivitet. RR øker deoxynucleosid trifosfat (dNTP) basseng i cellene, noe som kan føre til nedsatt inkorporering av dNTP analoger slik som triphosphorylated gemcitabin i DNA og kan redusere den antitumoreffekt av gemcitabin [9]. Et antall prekliniske og kliniske studier har vist at RRM1 kan være målrettet molekylet for å regulere gemcitabin motstand. Videre kan dens ekspresjonsnivåer være en nyttig indikator på gemcitabin motstand. Shin Nakahira et al rapporterte at økt RRM1 uttrykk var signifikant assosiert med antitumor effekter og med dårlig overlevelse etter behandling med gemcitabin i bukspyttkjertelen kreftpasienter [9]. Hao Xie et al rapporterte at etter kirurgisk reseksjon i pankreatisk adenokarsinom, for å oppnå best overlevelse, kan nivået av RRM1 uttrykk brukes for å stratifisere pasienter for å motta enten adjuvans gemcitabin eller ikke-gemcitabin adjuvant terapi. Dette er i overensstemmelse med resultatene fra tidlige stadium NSCLC studier [13], og dette implikasjonen er støttet av rollen til RRM1 som en tumor suppressor [12]. Videre er RRM2 kjent for å være involvert i chemoresistance. Undertrykkelse av RRM2 kunne bevisst tykktarm og bukspyttkjertel kreft celler til å kjemoterapeutika [25]. Forholdet mellom RRM2 ekspresjon og kjemoterapeutisk virkning i kliniske prøver er også blitt undersøkt. Itoi et al undersøkte RRM2 mRNA nivåer i snitt fra 35 pasienter med inoperabel kreft i bukspyttkjertelen i en prospektiv studie, og fant at svarprosenten til gemcitabin kjemoterapi var signifikant høyere hos pasienter med lav RRM2 uttrykk [26]. Men ingen av de tidligere studier har undersøkt uttrykk for RRM i blærekreft.
Vår studie fant at RRM1 og RRM2 ble uttrykt i kliniske blærekreft vev og blærekreftcellelinjer. Det er antydet at uttrykket av RRM1 og RRM2 var betydelig høyere i lavgradige svulster enn høyverdig svulster. Våre data antydet at RRM1 og RRM2 overekspresjon kan være assosiert med progresjonen av blærekreft. I blærecancercellelinjer, RT-PCR-resultater viste at RT112-Gr cellene var signifikant økt i nivåene av RRM1 og RRM2 mRNA sammenlignet med foreldreceller (
p
0,001), respektivt. For å vurdere virkningene av RRM1 /2 på RT112-Gr blærekreft cellelinjer, ble RRM1 /2 genet knockdown. Vår studie viste at etter knockdown av RRM1 /2, RT112-Gr blærekreftcellelinjer følsomme for gemcitabin igjen, noe som indikerer overekspresjon av RRM var assosiert med gemcitabin motstand, og kan være en roman kandidat biomarkør for gemcitabin motstand. Data fra en rekke kliniske studier viste at RRM1 /2-ekspresjon i tumorceller er inverst korrelert til følsomheten av tumorcellene til gemcitabin terapi [9, 11, 12]. For eksempel rapporterte Woon-Gye Chung et al at den økte RRM1 ekspresjon var sannsynligvis ansvarlig for motstanden til gemcitabin i TC-1-GR (gemcitabin motstand TC-1) celler, som ble ytterligere understøttet av observasjonen om at transfeksjon av RRM1 siRNA til TC-1-celler GR laget cellene mer følsomme for gemcitabin-HCl [27]. Zhang M et al rapporterte at små interfererende RNA-mediert RRM2 knockdown vesentlig tilbake SKOV3 /DDP celle motstand mot cisplatin [28].
Bevis viste at pasienter med gemcitabin motstand ville møte et verre utfall. Derfor er behandling av gemcitabin motstand blærekreft meget viktig. Økende studiene viste et bedre resultat ved å bruke targeting terapi i behandling av blærekreft. Vår tidlig studie fant EG5 hemmere som målrettede legemidler in vivo og in vitro behandling av blærekreft kan ha god helbredende effekt, dessuten vi først demonstrerte anticancer effekten av EG5 inhibitor på gemcitabin motstand blærekreft i dagens papir.
EG5 er et homotetramer motor dannet av antiparallell anordning av to dimerer. Den EG5 tetramer har evnen til å kryssbinde antiparallelle mikrotubuler som kommer fra de to centrosomes i G2 /M [29]. Den primære funksjon av EG5 er å danne bipolar spindel under tidlig prometafase;
