Abstract
Svulsten mikrosirkulasjonen er preget av en unormal vaskulær nettverk med utvidede, kronglete og saccular fartøy. Derfor bildebehandling svulsten blodkar og bestemme sine morfometriske egenskaper representerer en kritisk mål for optimalisering av kreftbehandling som er rettet mot blodårene (dvs. antiangiogenesis terapi). Målet med denne studien var å evaluere nye vaskulære morfometriske parametere i tykktarmskreft, vanskelig å oppnå gjennom konvensjonelle immunhistokjemi, ved hjelp av konfokal laser endomicroscopy metode. Ferske biopsier fra tumor og normalt vev ble samlet inn under koloskopi fra fem pasienter med T3 kolorektal kreft uten metastaser og ble merket med fluorescerende merkede anti-CD31 antistoff. En serie av optiske skiver som strekker seg over 250 mikrometer inne i vev ble umiddelbart samlet for hver prøve ved hjelp av et konfokalt lasers endomicroscope. Alle målinger ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil. Den midlere diameter av tumorkarene var betydelig større enn de normale fartøy (9,46 ± 0,4 um vs 7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166). Fartøyet tettheten var også signifikant høyere i kreft vs. normale vevsprøver (5541,05 ± 262.81 vs. 3755.79 ± 194.96 fartøy /mm
3, p = 0,0006). Disse resultatene ble bekreftet av immunhistokjemi. I tillegg er den tortuosity indeksen og skipslengder var ikke signifikant forskjellige (1,05 ± 0,016 og 28,30 ± 3,27 mikrometer i normalt vev, sammenlignet med 1,07 ± 0,008 og 26,49 ± 3,18 pm i tumorvev henholdsvis, p = 0,5357 og p = 0,7033). Datteren /mor-forhold (forholdet mellom summen av kvadratene av datteren fartøy radier over kvadratet av radius mor fartøy) var 1,15 ± 0,09 i normalt vev, og 1,21 ± 0,08 i svulstvev (p = 0,6531). Den confocal laser endomicroscopy er mulig for å måle flere vaskulære parametre fra ferske tumor biopsier enn konvensjonell immunhistokjemi alene. Forutsatt nye kontrastmidler vil være klinisk tilgjengelig, fremtid
in vivo
bruk av CLE kan føre til identifisering av nye biomarkører basert på morfometriske egenskapene til tumor blodkar
Citation. Ciocâlteu A, Săftoiu A , Cartañá T, Gruionu LG, Pirici D, Georgescu CC, et al. (2014) Evaluering av Nye Morfometriske Parametere av neoangiogenesis i Human tykktarmskreft Bruke Confocal Laser Endomicroscopy (CLE) og Målrettede Panendothelial Markers. PLoS ONE 9 (3): e91084. doi: 10,1371 /journal.pone.0091084
Redaktør: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, Italia
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 07.02.2014; Publisert: 10 mars 2014
Copyright: © 2014 Ciocâlteu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet fra to forskningsstipend finansiert av National Research Council (CNCs), Romania, med tittelen «klinisk og Biomathematical modellering av vaskulær endringer etter antiangiogen terapi i Advanced Colorectal karsinom,» kontrakt nummer PN-II-ID-PCE-2011- 3-0664, og «real-time Evaluering av behandlingseffekt i Advanced Colorectal karsinom,» kontrakt nummer PN-II-CT-ERC-2012-1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ubalanse av pro- og anti-angiogene signale innen svulster skaper en unormal vaskulær nettverk som er preget av utvidede, kroket, og hyper fartøyer [1], [2]. Derfor svulsten vaskularisering og spesielt veksten av nye skip (angiogenese) har økt oppmerksomhet i de siste to tiårene for mulige søknader til diagnose, prognose lagdeling og målrettet behandling [1].
Blant metoder for å vurdere svulst vaskularisering, er bestemmelsen av microvessel tetthet (MVD) fra immunhistokjemi (IHC) prøver som vanligvis brukes i prekliniske og kliniske studier. MVD representerer gjennomsnittlig antall fartøy per mm
2 innenfor en vevsprøve men at tiltaket alene ikke er tilstrekkelig for å overvåke vaskulære endringer i løpet av en behandlingsperiode [3]. Andre funksjonelle og morfologiske parametere som blodvolum, permeabilitet, microvessel tetthet, fartøy diameter, forgrening mønstre, andre mål på fartøy form og tumor stoffskifte kan være assosiert med tumor angiogenese.
De mekanismene bak de forbedrede antitumor effekter av de kombinerte behandlinger kan variere mellom de antiangiogene midler, og har ikke blitt fastslått endelig. Antiangiogene midler som forstyrrer vaskulær endotelial vekstfaktor reaksjonsveien er blitt demonstrert å normalisere tumorvaskulatur. Noen forfattere mener at de normaliserte vaskulære nettverk er preget av lavere fartøy tortuosity og lavere fartøy tetthet. [4], [5], [6].
klinisk oppfølging av effektene av anti-angiogen behandling krever en avbildning modalitet som registrerer de morfologiske egenskapene til tumor fartøy med høy sensitivitet og spesifisitet. Videre, siden den antiangiogene behandling krever gjentatte behandlinger, er sterkt ønskelig et ikke-invasiv teknikk [7]. Konvensjonelle bildediagnostikk som computertomografi, magnetisk resonans eller ultralyd ikke gir et detaljert bilde av tumorårer, noe som resulterer i begrenset bruk for
in vivo
kreft evaluering [7]. Non-invasiv karakterisering av tumorårer fører til en bedre forståelse av terapi effekter og bidrar til å optimalisere og tilpasse terapeutiske intervensjoner. [8].
Confocal laser endomicroscopy (CLE) lar
in vivo
mikroskopisk analyse av mage-tarmslimhinnen og dens microvascularization ved endoskopi ved hjelp av topisk eller systemisk administrerte kontrastmidler, [7], [9 ]. Målrette markører for angiogenese, i samarbeid med molekylære CLE undersøkelser (immunoendoscopy), legger funksjonell analyse i den morfologiske aspekter av neoplastisk prosess [7]. Derfor, i motsetning til konvensjonelle metoder for vaskulær vurdering, CLE tilbyr en unik mulighet til å selektivt forbedre ulike nivåer av microvasculature.
I en tidligere studie viste vi at CLE metoden er mulig for å avbilde ulike aspekter av tumorvaskulatur fra ferske biopsiprøver lik den tiden aksepterte histopatologiske teknikker [9]. I denne studien evaluerte vi nye vaskulær nettverksparameterne er vanskelig å bedømme med konvensjonelle immunhistokjemi i pasienter med trinnvise klinisk T3 primær kolorektal karsinom, uten metastatisk spredning, ved hjelp av CLE i kombinasjon med fluorescerende merkede anti-CD31-antistoffer for merking av både normale og tumorblodkarene .
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen og godkjent av etikkomiteen ved University of Medicine og Pharmacy av Craiova . En skriftlig informert samtykke ble gitt til hver pasient før studiestart.
Pasient Kjennetegn
biopsiprøver ble innhentet fra fem pasienter rekruttert ved Research Center of Gastroenterology og Hepatology Craiova, Romania før under enhver terapi (tabell S1). Pasientene ble tidligere diagnostisert med primær kolorektal adenokarsinom (G1-G2 histologisk grad) under rutinemessig koloskopi prosedyrer. Pasient 1 gjennomgikk behandling med bortezomib i kombinasjon med cellegift og strålebehandling etterfulgt av kirurgi. Pasient 2 hadde en historie med kirurgi etterfulgt av kjemoterapi for ondartet svulst i rektosigmoid krysset fire år før, og ble diagnostisert med lokalt tilbakefall ved oppfølging. Han ble behandlet med kirurgi og kjemoterapi adjuvant med 5-fluorouracil (5-FU). Pasienter 3 og 5 gikk kirurgisk reseksjon etterfulgt av kjemoterapi, med neoadjuvant stråling for en med rektal kreft. Pasient 4 hadde en historie med hjerteklaffsykdom, kronisk hepatitt C-infeksjon og lavt antall blodplater og ble først behandlet med FUFOL diett, men nektet videre behandling, inkludert reseksjon. På tidspunktet for denne analysen, alle fem pasientene var i live ved mer enn ett år etter at den første evalueringen.
Immunohistochemistry Evalueringen ble utført på kirurgiske prøver fra fire pasienter, mens endoskopiske biopsier samlet inn før oppstart av kjemoterapi ble brukt for pasienten som nektet operasjonen.
pasientene ble utarbeidet for koloskopi ved inntak av en vanlig foreskrevet oral elektrolytt kylling løsning. Sammenkoblede biopsier ble samlet ved hjelp av en colonoscope (CFQ160ZL, Olympus, Tokyo, Japan) fra normal slimhinne tatt på ca 10 cm fra svulsten og fra alle makroskopisk synlige lesjon og straks midt i fysiologisk saltvann. De friske biopsiprøver ble inkubert i mørket med en Alexa-Fluor 488-merket anti-CD31 (PECAM) antistoff (mus anti-human IgG1, fortynnet som 1:10 i PBS med 1% BSA, Exbio, Praha, Tsjekkia) i 1 time ved 37 ° C. Inkubasjonstiden og fortynningsforholdet ble optimalisert for å gi den høyeste penetrasjon inne i vevet, og det sterkeste signalet fluorescens for ferske biopsiprøver som beskrevet tidligere [9]. Umiddelbart etter inkubering ble biopsiprøver plassert på objektglass som skal avbildes med CLE-metoden.
Confocal Laser Endomicroscopy
Imaging ble utført ved bruk av et dedikert endomicroscopy system (Pentax EC-3870 CIFK, Tokyo, Japan), med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og med en maksimal lasereffekt på ≤1 mW ved overflaten av vevet kontrolleres av brukeren i løpet av undersøkelsen for optimal avbildning kontrast. Den CLE Prosedyren ble utført som følger: den distale spissen av endoskopet ble plassert på respektive slimhinne området fra histologi glassplater, etterfulgt av samling av serie konfokale bilder (7 mikrometer tykk, 0,7 um lateral oppløsning og det synsfeltet til 475 mikrometer × 475 mm) opp til en maksimal dybde på 250 mikrometer ved å trykke på en fot bryter pedal.
CLE bildebehandling og analyse
stedet med de beste vaskulær dekning gjennom hele dybden av biopsiprøve ble valgt for de morfometriske målingene. For hver pasient, 80-100 seriebilder for hver biopsi prøve, tumor vs. normalt vev ble slått sammen til bildestakker. Z projeksjon av hvert bildestakk ble innhentet ved hjelp av ImageJ NIH programvare (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, SUA) for å analysere hele vaskulære nettverk fanget i biopsi prøven (Fig. 1 A og B). Alle bildene ble kalibrert og en farge overlegg ble brukt for en bedre æren av blodkar. Å ta hensyn til romlig heterogenitet innen hver prøve, to 50 × 475 mikrometer rektangulære regioner av interesse (Rois) sentrert i midten av hvert bilde i horisontal og vertikal retning ble markert på bildet (figur 1 C og D). Den 50 mikrometer bredde ROI ble valgt ved inspeksjon av alle prøver å tillate flere bifurcations og hele fartøy segmenter i hver prøve. Den morfometriske parametere ble målt i hvert ROI, og deretter i gjennomsnitt for å oppnå en enkelt verdi for hver prøve.
Z projisering av bildet stabelen for normal (A) og tumor (B) mikrovaskulaturen, tilsynelatende med mer buktet forgrenet fartøy. Fartøyet lengde ble målt ved bruk av segmenterte linje verktøy og rapporteres i mikrometer. Den tortuosity indeksen ble beregnet som forholdet mellom segmenterte og rett linje lengder for både normal (C) og ondartet (D) human colorectal vev. * Målestokk er 50 mikrometer.
Vaskulær parametermålinger
diametre fartøy, fartøy tetthet, fartøy lengde, tortuosity indeks og datter /mor-forhold ble målt for hvert fartøy i ROI. Verdiene for de to ROI per pasient ble tatt i gjennomsnitt for å oppnå en gjennomsnittsverdi pr pasient. Til slutt, ble verdiene for hver enkelt pasient midlet over alle pasientene og resultatene uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (tabell 1). Fartøyet Tettheten ble beregnet som den gjennomsnittlige antall fartøy pr ROI dividert med det skannede volum (ROI område multiplisert med en dybde på 250 pm i Z-retningen), og deretter normalisert til en 1 mm
3 volum.
Ved hjelp av ImageJ sin rett linje funksjon, diameteren av hver vaskulær segment som falt helt eller delvis i ROI, ble målt mellom to tilstøtende forgreningspunkter.
fartøyet lengde for både normal og kolorektal cancer tumor prøvene ble målt ved å trekke midtlinjen av hvert kar segment ved hjelp av segmenterte linjen verktøyet. Den tortuosity indeksen for hvert fartøy segment ble beregnet som forholdet mellom segmenterte og rette linjelengder. Datteren /mor-forhold (DMR) ble beregnet som forholdet mellom summen av kvadratene av datteren fartøy radier over kvadratet av radius moderfartøyet, vurderer moren som det største skipet på et forgreningspunkt. Denne målingen er en indikasjon på avvik fra en trestruktur topologi i hvilket tilfelle DMR er omtrent en.
Histopatologisk Assessment
histopatologisk Vurderingen ble utført på kirurgiske prøver (i stedet for den friske biopsi prøvene brukes til CLE), med ett unntak når en endoskopisk biopsi ble brukt fra en pasient som nektet kirurgiske inngrep. Prøvene ble fiksert i 4% nøytral bufret formalin og behandlet for rutine parafin innebygging og seksjonering som 4 mikrometer tykke seksjoner. (Hjelpemiddel Informasjon S1).
Fra hver blokk, en sklie var farget med hematoxylin- eosin for patologisk diagnose, og de neste seriesnitt ble benyttet for immunhistokjemi å visualisere CD31 antigenet. I korthet, når mikrobølgeovnen i citrat-buffer (pH = 6), i en antigen gjenfinning metode, ble seksjonene avkjølt til romtemperatur og inkubert i 30 minutter i 1% hydrogenperoksyd for å slukke endogen peroksidase. For å blokkere uspesifikke antigene seter, ble prøvene blokkert i 30 minutter i 2% skummet melk (Bio-Rad, München, Tyskland) og det første antistoff ble inkubert over-natt ved 4 ° C (anti-CD31, mus anti human, IgG1, klone JC70A, Dako, Glostrup, Danmark, fortynnet som 1:100 i PBS med 1% BSA). Den neste dag, ble objektglassene skylt, blir signalet fra den første antistoffet ble amplifisert ved hjelp av en peroksydase-konjugert polymersystem (EnVision Dako, Redox, Bucuresti, Romania), og deretter påvist med 3,3′-diaminobenzidin – DAB (Dako) . Alle trinn vaske ble gjort i 1x PBS buffer. Etter en hematoxylin farging ble lysbildene coversliped og evalueres av et Nikon Eclipse 55i mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) koblet til en 5 Mp farge CCD kamera (Nikon) og et bilde-analyse stasjon (Bilde ProPlus AMS programvare, Media Kybernetikk Bethesda, Maryland, USA).
Fire bilder fra tetthet områder de høyeste vaskulære ble tatt til fange under samme belysning forhold og med et 40x objektiv for hvert enkelt tilfelle, og arkiveres som ukomprimerte TIFF-bilder. En stylus-designen penn ble benyttet til å tegne omrisset av fartøyene (som visualiseres ved DAB farging) i Bilde ProPlus programvarepakken. Alle disse områdene av interesse (Rois) var pseudo-farget i svart og måles automatisk som totale vaskulære områder og totale vaskulære tall per 40x området, etter som resultatene var normalisert for 1 mm
2 områder. Alle endelige målingene benyttes middelverdiene for alle bilder tatt fra hvert enkelt tilfelle og histopatologiske profil.
Statistical Analysis
De morfometriske målene i ImageJ ble eksportert for dataanalyse i Microsoft Office Excel (Microsoft , Redmond, Washington, USA). Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil. Alle målte kar-parametere ble ansett å være avledet fra en normalfordeling som før [9], [10], og derfor statistiske forskjeller mellom normal og tumor blodkar ble beregnet ved hjelp av t-test, og p-verdier ≤0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Confocal Laser Endomicroscopy
CLE prosedyre ga en detaljert observasjon av tilstøtende tumor og normal slimhinne seksjoner med synlig fluorescerende signal (fig. 1). Både de normale og tumorkarene synes buktet samlet, men det var ikke klart fra visuell analyse av bildene hvorvidt det er en betydelig forskjell mellom normale og tumorkarene eller om tortuosity opprettholdes ved nivået for de enkelte vaskulære fragmenter.
den midlere diameter av fartøyer i tumorprøver (9,46 ± 0,4 um) var betydelig større enn i den normale prøven (7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166) (tabell 1). Tilsvarende fartøyet tettheten var signifikant høyere i kolorektal kreft (5541.05 ± 262.81 fartøy /mm
3) enn den normale tykktarmsslimhinnen (3755,79 ± 194.96 fartøy /mm
3, p = 0,0006).
i motsetning til den visuelle vurderingen merket tortuosity indeksen og fartøy lengde var ikke statistisk forskjellig mellom normal (tortuosity indeksen var 1,05 ± 0,016 og fartøy lengde var 28,30 ± 3,27 mikrometer) og svulstvev (tortuosity indeksen var 1,07 ± 0,008 og fartøy lengde 26,49 ± 3,18 um) (tabell 1). Gjennomsnittlig datter /mor forholdet var 1,15 ± 0,09 i normal prøven og 1,21 ± 0,08 i tumorprøver (p = 0,6531). Dataene for hver pasient er vist i tabell 2. Selv en liten prøvestørrelse, det er ingen store variasjoner mellom pasientene. Som et mulig unntak, i pasient to verdiene for datter /mor forholdstall var større enn en i både tumor og normale prøver og (1,53 og 1,46 henholdsvis) som kan gjenspeile et spesielt vaskularisert og heterogen blodkar, men i gjennomsnitt over alle pasienter, verdiene var nær 1.
Immunohistochemistry
for å se om de CLE fartøyet signalene ble korrelert med histologiske data, fartøyet diameter og fartøyet tetthet oppdaget av CLE var kvalitativt sammenlignet med CD31-farget fartøy i en histologisk del fra den samme pasient. Det vaskulære området var 8,19 ± 1,35% i kolorektal cancer, betydelig høyere enn i normal slimhinne, 3,17 ± 0,48% (p = 0,0084). MVD for kolorektal normal slimhinne og svulstvev var også signifikant forskjellig (185,73 ± 33,21 /mm
2 og 309,28 ± 32,26 /mm
2 henholdsvis p = 0,0280, Tabell 3).
Diskusjoner og Konklusjoner
Vanligvis, i tumor vaskulære undersøkelser microvasculature er beskrevet bare fra fartøy diameter og tetthet synspunkt fordi disse funksjonene kan måles fra histologiske skiver. Vi har også utført en immunhistokjemisk studie på våre prøver, og fikk lignende resultater til litteraturen (større MVD og vaskulær område i tumorer versus normalt vev) [9], [11], [12], [13]. I tillegg har vi undersøkt flere parametere av vaskularisering fra volumetriske prøver, slik som fartøyets lengde, indeksen for tortuosity og datter /mor-forhold, som lett kan kvantifiseres med CLE på grunn av dets større inntrengningsdybde i vevet (opp til 250 um). Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra datter /mor forholdstall og tortuosity indeksen i kolorektal kreft blodkar.
Anatomisk, tumor microvessels er generelt mer utvidet, kronglete, og saccular med uregelmessige mønstre av samtrafikk og forgrening [ ,,,0],14]. Overekspresjon av noen pro-angiogene faktorer, slik som VEGF, fører til dannelse av en ny vaskulatur som er strukturelt unormal ved makroskopiske og mikroskopiske nivåer, og det er generelt ansett at disse abnormiteter forsterkes som tumoren fortsetter å utvikle [15]. Derfor microvessel tetthet øker gradvis fra lavgradig til høygradig neoplasi til kreft [16]. Tilsvarende i den foreliggende studie har vi funnet en signifikant høyere kar tetthet og en diameter av tumorkarene.
Mesteparten av litteraturen gir bare en kvalitativ analyse på fartøyet lengde og tortuosity i tykktarmskreft. Yuan et al. (1996), forutsatt tidlige tegn på at nøytralisering av tumor-celle-avledede VEGF kunne reversere noen av de forandringer av tumoren microvasculature som vaskulær diameter og tortuosity [17]. Tatt i betraktning det faktum at en strategi for vellykket behandling med anti-angiogene midler, er å redusere tortuosity av unormale fartøyene [18], er en kvantitativ vurdering nødvendig. Vanligvis ble vaskulær tortuosity evaluert fra 2D-bilder [19]. Tidligere forskning definert ulike typer fartøy tortuosity avhengig av fartøyets lengde og viste at fartøyet tortuosity og lengden er variabel i svulster [20]. I våre konfokale optiske seksjoner, ondartede blodårene dukket opp mer utvidet og mer buktet i forhold til normale prøver. Interessant, til tross for visuell undersøkelse, erholdt vi ingen statistisk signifikans når vi beregnet sin indeks på tortuosity. Dette kan reflektere at den kronglete utseende kan gis av den mekaniske deformasjonen som hele svulstvev vokser heller enkelte fartøys fragmenter være kronglete. En nylig tredimensjonalt kvantifisering studie viste ingen forskjeller i tortuosity og fartøy lengde mellom kapillærer hos friske og kreft vev [21], mens kvantitative studier i tredimensjonale svulster på senere stadier av vekst viste en nedgang i kar lengde [20], [ ,,,0],22], [23].
det var ikke en signifikant forskjell i datter /mor forholdet mellom normal og svulst forgrening nettverk og verdiene er nær 1 (1,15 ± 0,09 vs. 1,21 ± 0,08). Denne parameteren er avledet fra Murray lov til å koble store fartøy til små fartøy som er benyttet ved tykktarmskreft angiogenese. Murray lov, som er tilgjengelig for asymmetrisk, så vel som symmetrisk forgrening systemer, fremgår det at den tredje potens av radien for en moderfartøyet er lik summen av kuber av radiene av døtrene og refererer til optimaliseringen av blodkar diameter og av blodvolum i henhold til de metabolske kravene [24]. En begrensning av vår undersøkelse er at retningen av blodstrømningen ikke er kjent, derfor den nøyaktige betegnelse på moderfartøyet kan ikke angis. Dette brist kan rettes med
in vivo
observasjon av blodstrøm i tumorer, ved hjelp av klinisk godkjente kontrastmidler.
nytten av å bruke morfometriske parametere som biomarkører kan avhenge av scenen av svulst utvikling . Vi beregnet morfometriske parametere som måler ulike aspekter av kolorektal tumorer microvasculature tar hensyn bare T3 iscenesatt, godt til moderat differensiert karsinom (G1-G2 klasse), uten metastaser. I 1997, Robert D. Cardiff et al. beregnes indeksen for tortuosity i en studie basert på en mus brysttumor modell system, ved hjelp av histologi kombinert med datastøttet intramikroskopi og mus injisert med FITC [25]. Han anså denne parameteren en prognostisk faktor og viste at det var statistisk signifikant når korrelert med en høyere metastatisk rate. Tilsvarende ytterligere langtidsstudier på større grupper av pasienter er nødvendig for å se om alle morfometriske parametere viser sterk sammenheng med kolorektal adenokarsinom gradering, og hvis de kan relatere til behandlingsresultat og prognose.
Annen metode kan brukes til studier som følge effekten av anti-angiogenese behandling (f.eks bevacizumab) på vaskulær forgrening, tortuosity og beholdervolum i tumorer [8], [26].
Ettersom effekten av kjemoterapi avhenger av tilstedeværelsen av en tilstrekkelig svulst blodtilførsel for å sikre levering av legemidler, «normalisering» av tumoren vaskulære nettverket er ønskelig. Dermed vurdere forskjellene mellom fartøy lengde, tortuosity og forgreninger mønstre med CLE bildebehandling og frisk biopsi flekker kan være nyttig for å identifisere kategori av pasienter som kan ha nytte av neoadjuvant angiogenetic terapi. . [27]
I dag representerer tredimensjonal confocal laser endomicroscopy rekonstruksjon en utfordring [28] – [30]. Bruke CD 31 antistoffer fluorescensmerkede med en fluorokromkonjugerte (Alexa Fluor 488) og CLE for identifisering av skip fra ferske biopsiprøver, kan vi anslå deres form, forgrening funksjoner og tetthet. To store fordeler ved denne metode er den kortere behandlingstid (en time vs. flere timer til dager), og ingen gjenstander fra vev fiksering og prosessering for IHC. Fremtidige lignende studier kan omfatte mer spesifikke markører for svulst neoangiogenesis i forhold til panendothelial markør som brukes i denne studien.
En direkte sammenligning av morfometriske parametere mellom CLE og IHC er vanskelig og lite relevant. En må sammenligne resultatene fra en parafin-embedded tissue seksjon brukt i konvensjonell IHC for klinisk diagnose, med informasjon fra 3D stabelen innhentet i en enkelt CLE skanning som ble analysert i denne studien. En 2D skive tillater ikke en nøyaktig måling av fartøyets lengde, tortuosity eller mor /datter-forhold. En annen vanskelighet er at CD31-antistoff og vev behandlingstrinn (frisk kontra faste og parafin-innleiret) er forskjellig mellom de to fargeteknikker, og forårsaker sannsynligvis forskjellige verdier for den samme parameteren på grunn av forskjeller i bearbeidingsteknikker.
i sammendraget, i dagens manuskript viste vi at konfokal laser endomicroscopy er mulig for å måle flere vaskulære parametre fra ferske tumor biopsier enn konvensjonell immunhistokjemi alene. Dessuten har vi presentert et rammeverk som fanger opp noen av de grunnleggende funksjonene i tykktarmskreft microvascularization, ved hjelp av en reproduserbar non-invasiv teknikk og målrettet panendothelial markører på ferske biopsier. Verifikasjon bør gjøres i fremtidige eksperimenter ved hjelp av konfokal laser endomicroscopy
in vivo
ved å manipulere svulst morfologi gjennom variasjoner i svulst vascularization. Forutsatt nye kontrastmidler vil være klinisk tilgjengelig, fremtid
in vivo
bruk av CLE kan føre til identifisering av nye biomarkører basert på morfometriske egenskapene til tumor blodkar.
Resultatene er nyttige for videre forståelse av kolorektal kreftutvikling og pasientutvalgskriterier. Videre, som definert av Ehling J et al (2013), ikke-invasiv karakterisering av tumorkarene fører til en bedre forståelse av terapi effekter, bidrar til å optimalisere og kombinere terapeutiske intervensjoner [8]. Resultatene utvide våre tidligere mulighets funn til evalueringen av nye vaskulære parametere som er viktige i forvaltningen av kreft, men som er vanskelig å måle fra immunhistokjemiske seksjoner (den fartøy /mm
3, fartøyets lengde, indeksen for tortuosity og mor /datter-forhold). Vi har vist at reproduserbarhet av fremgangsmåten ved å sammenligne de to vanlig brukte parametere (kar diameter, kar tetthet) til den tradisjonelle immunhistokjemi. Ved hjelp av CLE avbildningsteknikk for å analysere 3D microvascular arkitektur svulster er egnet for både kvantitative og kvalitative angiogenese målinger in vivo og kombinert med målrettede antistoffer.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Pasient egenskaper og immunhistokjemi resultater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091084.s001 plakater (DOC)
