Abstract
Bakgrunn
Nasofaryngeal karsinom (NPC) er en særegen Epstein Barr virus (EBV) -associated malignitet som er utbredt i Sør-Øst Asia. Peptidyl Prolyl-
cis-trans
isomerase NIMA-samspill 1 (PIN1) isomeriserer spesifikke fosforylerte aminosyreresiduer, noe som gjør det til et viktig regulator i celleoverlevelse og apoptose. I denne studien undersøkte vi bidraget fra PIN1 i NPC tumorigenesis og PIN1 potensielle rolle som et terapeutisk mål.
Metoder
uttrykk for PIN1 ble undersøkt i et panel av NPC cellelinjer, xenograft og primære svulster. De funksjonelle roller PIN1 i NPC celler ble belyst av knockdown og overekspresjon av PIN1 i
in vitro Hotell og
in vivo
nakne mus-modeller med henholdsvis siRNA og lenti-viral transfeksjon. Antitumor effektene av PIN1 inhibitor Juglone i NPC celler ble også vurdert.
Resultater
Vi avslørte konsekvent overekspresjon av PIN1 i nesten alle EBV-assosiert NPC cellelinjer, xenograft og primærsvulster. PIN1 undertrykkelse var istand til å hemme cyclin D1 ekspresjon og aktivering av caspase-3 i NPC-celler. Det positivt regulert NPC celleproliferasjon, kolonidannelse og forankrings-uavhengig vekst. Hemming av PIN1 undertrykte tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
.
Konklusjoner
Denne studien viser onkogene rolle PIN1 i NPC tumorigenesis, og viser at dets overekspresjon kan øke tumorcellevekst til ved oppregulering av cyclinD1. Våre funn informere utvikling av nye behandlinger rettet mot PIN1 for NPC pasienter
Citation. Xu M, Cheung CC-M, Chow C, Lun SW-M, Cheung ST, Lo KW (2016) Overuttrykte PIN1 Forbedrer kreft Vekst og Aggressivitet med Cyclin D1 Induksjon i EBV-Associated Nasofaryngeal Carcinoma. PLoS ONE 11 (6): e0156833. doi: 10,1371 /journal.pone.0156833
Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE
mottatt: 8 oktober 2015; Godkjent: 21 mai 2016; Publisert: 03.06.2016
Copyright: © 2016 Xu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudd fra det kinesiske universitetet i Hong Kong (Fokus Investigation Scheme-A), og Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Council – GRF ( 470413, 470312, 471211), CRF (CUHK8 /CRF /11R), AoE NPC (AoE /M-06/08), Tema-Based Research Scheme (T12-403 /11 og T12-401 /13-R).
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nasofaryngeal karsinom (NPC) er en særegen type hode og nakke kreft som oppstår fra epiteliale celler som dekker overflaten og slimhinnen i nasopharynx. Dette malignitet viser en tydelig etnisk og geografisk fordeling, og er spesielt utbredt i Sør-Kina, der nesten alle tilfeller er nonkeratinizing karsinomer assosiert med EBV infeksjon [1, 2]. Denne forening med EBV, i tillegg til eksistensen av multiple genetiske avvik [3], øker kompleksiteten av NPC forskning. De svake resultatene av konvensjonell kjemoterapi-strålebehandling for pasienter med avansert lokoregionalt sykdommer og fjernmetastaser representerer en terapeutisk utfordring [4]. Gitt den høye tilbakefall og metastaselige priser, er det av største viktighet at alternative behandlingsmetoder bli oppsøkt og utvikles.
Kreft utvikling innebærer en kompleks rekke av avvikende signalveier som fundamentalt resulterer i ukontrollert celleproliferasjon kontrollert av proline- rettet fosforylering [5]. PIN1 er en svært bevart enzym som binder seg til og isomeriserer bestemt fosforylert serin eller treonin rester foregå prolin (Ser /Thr-Pro) obligasjoner. Det induserer konformasjonsendringer i visse proteiner som spør endringer i sine egenskaper, inkludert katalytiske aktiviteter, subcellulære lokalisering, protein-protein interaksjoner og omløpshastighet [5, 6]. Således er PIN1 ansett som en viktig regulator i cellulære prosesser, slik som cellesyklusregulering, cellesignalisering, transkripsjon og skjøting, DNA-skade responser, celleoverlevelse og medikamentresistens [5, 7, 8].
Apart fra viktigheten av PIN1 i modulering av aktivering av forskjellige signaliseringsmolekyler, har det også vist seg å stabilisere virale oncoproteiner som human T-celle leukemivirus type i Tax-protein [9]. Videre PIN1 har blitt rapportert å være involvert i funksjonen av flere virus, inkludert Kaposis sarkom assosiert herpesvirus [10], human immunsviktvirus type I [11, 12] og hepatitt C-viruset [13]. Interessant nok har det også blitt vist å interagere med EBV-kode protein [14], selv om informasjon om dens rolle i EBV-assosierte maligniteter har vist seg mangelvare.
Målet med studien var å belyse rollen av PIN1 i utviklingen NPC som er konsekvent assosiert med EBV infeksjon. Ved å undersøke effekten av PIN1 uttrykk på EBV-assosiert NPC, avslørte vi dens bidrag til tumorcellevekst og tumordannelse.
Materialer og metoder
Cellelinjer, xenograft og primære svulster
Tre NPC cellelinjer C666-1 (en naturlig EBV-assosiert, udifferensiert type NPC) [15], Ht1 (en EBV-negative, godt differensiert type NPC) [16], Ht1-EBV (Ht1 infisert med EBV) [17], immortaliserte normale nasopharynx epitel-cellelinjer (NP69 og NP460) [18] som er etablert i våre laboratorier ble anvendt i denne studien. Den livmorhalskreft cellelinjen HeLa ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). To EBV-positive NPC xenotransplantater-xeno-666 [15], xeno-2117 [19], C15 og C17 [20] ble også inkludert. Xen-666 og xeno-2117 ble etablert av vår NPC gruppe som tidligere beskrevet [15, 19]. C15 og C17 ble hentet fra professor Pierre Busson som etablerte disse xenografter [20]. For immunhistokjemisk (IHC) farging studien ble 70 arkivformalinfiksert parafin innebygd (FFPE) primær NPC biopsier rekruttert fra vevet bank av Institutt for Anatomisk og Cellular Pathology på Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong (CUHK ). Studien protokollen ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for CUHK. Alle prøvene ble histologisk evaluert som udifferensierte eller dårlig differensierte karsinomer og bekreftet å være EBV-positive, som bestemt ved EBER
in situ hybridisering
[21]. Pasientenes egenskaper er presentert i tabell 1.
Transfeksjon og medikamentell behandling
Ht1, Ht1-EBV, C666-1 og HeLa-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% L-glutamin (Life Technologies). De NP69-celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium (KSFM) med bovin hypofyse ekstrakter og rekombinant epidermal vekstfaktor (Invitrogen). Alle cellene ble inkubert i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C.
To Silencer Velg validert sirnas målretting PIN1 (siPin1 544 og siPin1 545) og universell negativ kontroll siRNA (Livet Technologies) ble transient transfektert inn C666-1 hjelp Lipofectamine
TM 2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoller. Celler ble oppsamlet ved angitte tidspunkter for videre analyse. MG132 (Calbiochem) ble brukt til Ht1 og NP69 celler (10 og 15 mikrometer og 5 og 10 mikrometer, henholdsvis) for å studere proteasome nedbrytning av PIN1. Den PIN1 inhibitor Juglone (Calbiochem) ble brukt for å studere effekten av PIN1 inhibering på C666-1-celler (2, 4, 6 og 8 pM). Behandlede celler ble samlet opp og lagret ved -80 ° C inntil bruk. For å bestemme IC50 for Juglone ble cellene sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med forskjellige doser (Juglone 0,03 til 20 uM) i 24 timer. Celleviabilitet ble deretter bestemt ved en WST-1-analysen.
etablere stabile pin1-overekspresjon cellelinjer
Den pCDH og pCDH-pin1 plasmider var en gave, sjenerøst gitt av Dr. Roberta Pang, Kirurgisk avdeling, Universitetet i Hong Kong. En lentiviral systemet ble brukt til å etablere stabile PIN1-overexpressed NP69 cellelinje. Den pCDH lentiviral vektor ble pakket ved hjelp av tredje generasjons lentivirus system, i henhold til Lenti Startpakke produsentens protokoller (System Biosciences). Viral supernatanten (kultur media) ble høstet fra 293TN produsent celler 48 timer etter transfeksjon. Viruset (med en pCDH eller pCDH-PIN1 vektor og 10 ug pPACKH1-plasmid mix) ble oppsamlet og transdusert med TransDuxand inn i NP69-celler. PIN1 ekspresjon ble bekreftet ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og Western blotting. Grønn fluorescens protein (GFP) reporter-ekspresjon ble visualisert under fluorescensmikroskop for å sikre tilstedeværelsen av transdusert DNA.
Revers transkripsjon (RT) og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR)
RNA prøver stilles av TRIZOL og fenol-kloroform-ekstraksjon ble underkastet revers-transkripsjon ved bruk av MultiScribe revers transkriptase (Invitrogen). Den oppnådde cDNA ble anvendt for sanntids qPCR via SYBR grønn Master Mix (Applied Biosystems), ifølge produsentens protokoller. Primerne benyttet i denne undersøkelsen er oppført i Tabell 2. Det PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems). Hver prøve ble analysert i triplikat. Uttrykket av målgener ble normalisert mot husholdningsgenet β-actin hjelp av to
[- ΔΔCT]. Metode
Western blotting
Proteinprøvene ble separert i henhold til deres størrelse ved hjelp av elektroforese, og deretter elektro-overført til en nitrocellulosemembran ved å bruke en Bio-Rad Trans blot-celle. Nitrocellulosemembran ble inkubert med primære antistoffer over natten i 5% fettfri melk eller 5% bovint serumalbumin. Membranen ble deretter inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer. Måltallene proteiner ble oppdaget av kjemiluminescerende underlag (GE Life Science) og det utsendte signal ble oppdaget på X-ray filmer (Kodak). Membranene ble undersøkt med antistoffer mot humant PIN1 (Calbiochem), aktin (Santa Cruz), cyclin D1 (Lab Vision), β-catenin, c-juni, c-Jun (Ser73) og c-juni (Ser63) (cellesignalisering ).
Immunhistokjemisk farging
FFPE- prøvene ble seksjonert (4 mikrometer), de-paraffinized og rehydrert for påfølgende farging. Etter antigen gjenfinning, ble endogen biotin aktivitet blokkert av normal bovin serum og delene ble inkubert i primære antistoffer (anti-pin1, Calbiochem) i en fuktig kammer. HRP-merkede sekundære antistoff ble påført seksjonene og, til slutt, 3,3′-diamino-benzidin (DAB) substrat ble anvendt for fargeutvikling. PIN1 uttrykk og lokalisering ble visualisert i rødt og kjernene ble kontra med hematoksylin, som dukket opp blå. Skinnene var så dehydrert og montert med Permount montering medium (Fisher Scientific).
Caspase-3 aktivitetsanalyse
celle apoptose av behandlet og ikke-behandlede celler ble påvist ved hjelp av CaspACEAssay
TM System i henhold til produsentens protokoller (Promega). Wells i duplikater inneholder blank (uten celleekstrakt), negativ kontroll (utdrag fra ubehandlede celler), indusert apoptose (utdrag fra pin1 hemmerbehandlede celler) og celler behandlet med caspase-hemmer (utdrag fra PIN1 inhibitor- og Z-VAD-FMK den kaspaseinhibitor-behandlede celler) ble inkludert i forsøkene. Forsøkene ble utført in triplo og absorbansen av fargene utviklet ble målt ved en bølgelengde på 405 nm med en Perkin Eimer 1420 Multilabel Counter Victor 3 (Perkin Eimer). Caspase-spesifikke aktivitet ble beregnet i henhold til produsentens retningslinjer.
WST-1 og BrdU-analyser
celleproliferasjon reagens WST-1 (Roche) ble anvendt for å bestemme frekvensen av celleproliferasjon i treated- og ikke-behandlede celler. De behandlede celler ble sådd i en 96-brønns plate ved en densitet på 3000-8000 celler per brønn. Cellelevedyktigheten ble bedømt hver 24. time av WST-1, kontinuerlig, i 5 dager. Absorbansen i hver brønn ble målt ved en bølgelengde på 450 nm og normalisert ved hjelp av en bølgelengde på 690 nm, detektert av Victor 3 (Perkin Eimer). Celleproliferasjon ble også målt i form av DNA inkorporert i prolifererende celler ved hjelp av BrdU analysen (Cell Proliferation ELISA, BrdU kolo Kit, Roche).
Anchorage uavhengig vekst analysen
Det behandlede og ikke behandlede celler ble sådd ut i soft agar (base agarose: 1,8% agarose i KSFM, topp agarose: 0,9% agarose ferdigblandet med celler, 2 ml liggende KSFM medium) for å evaluere deres vekst i et forankringsuavhengig. Platene ble inkubert ved 5% CO
2 ved 37 ° C i en måned. Koloniene ble visualisert ved anvendelse av 0,1% p-iodonitro tetrazolium fiolett (INT) flekk (Sigma-Aldrich), og deretter telles.
kolonidannelse assay
Den behandlede og ikke-behandlede celler ble sådd på 8×10
3 celler per brønn (C666-1) eller 1X10
3 celler per brønn (NP69) i seks-brønns plater. Cellene ble holdt ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO
2 i 21-28 dager. Koloniene som ble dannet ble fiksert med metanol og visualisert med blått ved hjelp av Giemsa (Sigma-Aldrich) farging. Koloniene som inneholder over 50 celler ble talt opp.
In vivo
tumorigenicity
Å belyse
in vivo
tumorigent effekten av pin1, NP69 celler (behandlet med sirnas av PIN1 eller med vektor kontroll) ble subkutant inokulert i flankene av BALB /c naken mus (nu /nu) (4 mus per gruppe). Alle mus ble bedøvet med 2,2,2-tribromoethanol (Avertin) før inokulering. Matrigel (BD Bioscience) ble anvendt i den inokulering fremgangsmåte for NP69. Musene ble inspisert daglig i tumordannelse og størrelsene av tumorer som ble dannet ble registrert. For å bestemme den anti-tumor effekt av PIN1 inhibitor
in vivo
, Juglone (0 mg /kg, 0,5 mg /kg, 1,5 mg /kg) ble injisert intra-peritonealt inn i nakne mus implantert med C666-1 luciferase cellene når tumorene hadde nådd sine respektive størrelser. Tumorstørrelse ble målt daglig, og luciferase-saltet ble injisert inn i nakne mus på dagene 0, 6 og 8 for å overvåke endringer i tumorstørrelse via en IVIS
TM 100 Imaging system. Alle mus ble avlivet på slutten av forsøkene ved cervikal dislokasjon og tumorene ble bevart for ytterligere analyse. Ingen mus var syk, døde eller nødvendig tidlig avslutning i løpet av denne studien. Etisk godkjenning er innhentet fra Universitetet forsøk med dyr etiske komité (AEEC), CUHK, og dyret lisensen ble godkjent av Hong Kong regjeringen, Department of Health.
Luciferase reporter analysen
C666 -1-celler ved 60% konfluens i 96-brønns plate ble ko-transfektert med FR-TK Luc-plasmid, PIN1 siRNA og reporter plasmid. Etter 48 timers transfeksjon ble cellene lysert med en 1X passiv lyseringsbuffer (Promega). Lysatene ble deretter overført til en 96-brønns plate og luciferase-aktivitet ble analysert ved hjelp av den doble luciferase reporter Kit (Promega) ifølge produsentens protokoller. Luciferase-signalet ble målt ved Victor 3 (Perkin Eimer) med eller uten automatiske injeksjoner. Resultatene ble uttrykt som forholdet mellom Firefly luciferase aktivitet for å Renilla luciferase aktivitet.
signalveien rekke
En Cancer 10-Pathway Reporter Luciferase Kit (SA biovitenskap) ble benyttet for å bestemme signalveien avvik i de behandlede celler. I korte trekk, ble reporter plasmider på Cignal Finder Array Plate resuspendert og blandes med 0,8 mL Fugene HD reagens (Roche) i 100 mL OPTI-MEM medium (Invitrogen). Transfeksjon komplekset ble tillatt å dannes ved romtemperatur i 20 minutter. De behandlede cellene ble deretter samlet opp og revers-transfektert med reporter plasmid i en tetthet på 1.5X10
4 celler per brønn. Den dual-luciferase reporter-analysen ble utført etter 24 timers inkubering.
Statistisk analyse
Alle eksperimenter ble utført i tre paralleller, og resultatene ble presentert som gjennomsnitt med standardfeil (SEM) . Student t-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans, med en
P
-verdi på mindre enn 0,05 ansett som signifikant.
Resultater
Overuttrykte PIN1 i NPC primære svulster og tumorlinjer
ved hjelp av immunhistokjemisk farging, vi har oppdaget at overekspresjon av PIN1 i 70/70 (100%) NPC primære tumorer, sammenlignet med det tilstøtende normale nasofaryngeal epitelet (figur 1A). PIN1 overekspresjon ble også demonstrert i et panel av EBV-positive NPC cellelinje (C666-1) og xenotransplantater (C15, C17, xeno-2117 og xeno-666) ved Western blotting, mens bare svak PIN-ekspresjon ble påvist i udødelig normal nasofaryngeale epiteliale cellelinjer (NP460 og NP69) (figur 1B). Til tross for den dramatiske reduksjonen i PIN1 protein uttrykk i immortaliserte normale NPC celler, pin1
mRNA transkripsjoner ble ikke observert noen åpenbare forskjeller i
mellom de normale NP cellelinjer og NPC svulster. Dette funnet antyder en post-translasjonell regulering av PIN1 i normale nasofaryngeale celler.
(A) IHC farging ble brukt til å illustrere overekspresjon av PIN1 i representative NPC primære tumorer (NPC1-NPC4). Alle tilfellene var EBV-positive udifferensiert karsinom. NPC1, NPC3 og NPC4 er fra pasienter med stadium 3 sykdommen. NPC2 er fra en pasient med trinn 2 NPC. Sterke PIN-signaler ble funnet i kreftceller, som blir markert med gul «
*». Den tilstøtende normal epitel tjente som kontroll i hvilken svake pin1 signaler ble observert. De røde pilene viser normal nasopharyngeal epitel. (B) Uttrykk for PIN1 i NPC tumorlinjer, xenografts og udødeliggjort normale NP celler, påvist ved QRT-PCR (øvre panel) og Western blot (nedre panel). For QRT-PCR,
PIN1
transkripsjon i NP460 ble brukt som en referanse. Den relative uttrykk for
pin1
transkripsjoner ble angitt som en fold forskjell over referansen. p-aktin ble benyttet for lasting normalisering. Tilsvarende ACTIN ble anvendt som en indre kontroll lasting i Western blot-analyse. Den svake PIN1 uttrykk i NP69 og NP460 antydet at nedregulering av PIN1 involvert post-translasjonell regulering.
For å bestemme mekanismen av post-translasjonell regulering på pin1 proteiner, HK-en og NP69 ble behandlet med den proteasominhibitor MG132 (karbobenzoksy-Leu-Leu-leucinal). The Western blot Resultatene viste økt PIN1 protein uttrykk i både Ht1 og NP69 celler etter MG132 behandling (S1 fig). Dette indikerer at PIN1 protein uttrykk er regulert av proteasome degradering.
Den konsekvente overekspresjon av PIN1 antyder sitt potensial onkogen rolle i NPC utvikling. For å undersøke dets onkogene funksjon, ble sirnas og PIN1 inhibitor Juglone benyttet for å bestemme effekten av PIN1 undertrykkelse på NPC cellevekst. Deretter ble virkningene av PIN1 uttrykk på cellevekst og tumordannelse undersøkt i normale nese-svelg epitelceller (NP69) transfektert med en vektor som uttrykker PIN1.
PIN1 regulerer NPC cellevekst og cyklin D1 uttrykk
effekten av PIN1 knockdown på NPC cellevekst ble undersøkt ved trans C666-1 celler med pin1 spesifikke sirnas (siPin1 544 og siPin1 545). 2A og 2B viser markant nedregulering av
PIN1
mRNA og protein i C666-1cells transfektert med siPIN1. Resultatene av WST-1-analysen demonstrerte observerbar veksthemming i siPIN1-transfekterte C666-1-celler, sammenlignet med kontrollen (Fig 2C). Videre er evnen til kolonidannelse ble signifikant redusert i siPIN1-transfekterte C666-1 (figur 2D). Disse funnene tyder på at PIN1 uttrykk regulerer NPC cellevekst. Resultatene av BrdU-analysen viste signifikant suppresjon av DNA-syntese i de pin1 knockdown NPC-celler (figur 2E). Viktigere, ble ekspresjonen av cellesyklusen regulator cyklin D1 trykt i PIN1 knockdown C666-1-celler (figur 2B). Den ko-transfeksjon av pCMV-cyclinD1, en cyklin D1-uttrykkende vektor med siPIN1, gjenopprettes den cyklin D1 uttrykk, celleproliferasjon, DNA-syntese og kolonidannelse evne til C666-1-celler sammenlignet med de av siRNA-behandlede celler (S2 fig) . Dette tyder på at PIN1 regulerer NPC cellevekst ved å modulere cyklin D1 uttrykk.
PIN1 undertrykkelse hemmer cellevekst, syntese DNA, kolonidannelse evne og cyklin D1 ekspresjon i NPC-celler (A) QRT-PCR og (B) Western blot ble brukt i nedregulering av PIN1 transkripsjon og protein uttrykk i PIN1 sirnas (siPIN1 544 og siPIN1 545) -behandlet NPC celler og C666-1 hhv. I disse pin1 knockdown celler ble redusert cyclin D1 uttrykk observert. ACTIN ble anvendt som kontroll lasting i Western blot-analyse. (C) WST-1-analysen viste veksthemming i NPC celler transfektert med siPin1 544 og siPin1 545. (D) Colony formasjon evne ble betydelig undertrykt i pin1-forstummet C666-1 celler. Representative bilder av kolonier dannet av siRNA-behandlede og kontrollceller vises. Statistisk signifikans ble bestemt av Student t-test, der en
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (*
P
0,05, **
P
0,01). (E) En BrdU analysen ble brukt til å avsløre signifikant hemming av DNA-syntese i PIN knockdown NPC celler.
PIN1 inhibitor induserer caspase-3 og reduserer tumorstørrelse
En PIN1 inhibitor, Juglone, ble brukt til å belyse effekten av PIN-hemming i NPC celler
in vitro Hotell og
in vivo
. En WST-1-analysen viste at halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) av Juglone for C666-1 og Ht1 var 6 og 10 pM, respektivt (figur 3A). Dette funn indikerer at C666-1 celler med høy PIN1 uttrykk er mer utsatt for Juglone behandling. Den PIN1 inhibitor Juglone undertrykte cyclin D1 uttrykk i C666-1 celler (figur 3B, venstre panel).
in vivo
virkningen av inhibitoren på PIN1 cyklin D1 undertrykkelse ble ytterligere bekreftet ved intra-tumor injeksjon av Juglone til C666-1 xenotransplantater i nakne mus modeller (figur 3B, høyre panel). Juglone behandling også betydelig forbedret caspase-3-aktivitet i C666-1 celler, sammenlignet med kontrollene (Fig 3C). Resultatene tyder på at Juglone hemmer cellevekst og induserer apoptose i celler NPC.
(A) HK-1 (venstre panel) og C666-1 (høyre panel) ble behandlet med den PIN1 inhibitor Juglone i 24 timer for å bestemme medikamentdosen følsomhet. IC50-verdiene til C666-1 og Ht1 celler var 6 pM og 10 pM, respektivt. (B) Ekspresjon av cyclin D1 ble undertrykket ved Juglone på en doseavhengig måte, men ble ikke påvist noen signifikante endringer i β-catenin ekspresjon. Ekspresjonen av cyclin D1 og β-catenin i Juglone-behandlede C-666 xenograft modell ble undersøkt ved Western blot. Redusert ekspresjon av cyclin D1 ble observert i tumoren som hadde fått Juglone behandling. PIN1 hemming førte til undertrykkelse av cyclin D1 både
in vitro Hotell og
in vivo
, og det var en beskjeden reduksjon i β-catenin nivå i
in vivo
modell . (C) De C666-1-celler utviste signifikant høyere caspase-3 aktivitet etter Juglone behandling, sammenlignet med de ubehandlede eller DMSO-behandlede motparter. Dette indikerer at PIN1 hemming kan aktivere caspase apoptotiske sti i NPC celler. Statistisk signifikans ble bestemt av Student t-test,
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (*
P
0,05, **
P
0,01).
fig 4A og 4B demonstrere
in vivo
antitumor effekt av Juglone i NPC celler. ROI tellingen ble sterkt redusert i mus behandlet med Juglone, sammenlignet med kontrollene (fig 4a). Som figur 4B viser, ble svulststørrelser i de mus som var behandlet med Juglone betydelig redusert, sammenlignet med kontrollen (Fig 4B). En signifikant inhibering av tumorvekst ble observert i mus behandlet med 1 mg /kg og 1,5 mg /kg Juglone.
(A) ved hjelp av
in vivo avbildning
, tumorvekst av luciferase-merket C666-1 ble avslørt etter behandling med forskjellige doser av Juglone (ROI teller per million fotoner per sekund). Luciferase signal ble økt i kontroll ubehandlede tumorer under Juglone behandling. I mus behandlet med Juglone i forskjellige doser (0,5, 1 og 1,5 mg /kg), var konsekvent lavere luciferase signaler observert i løpet av de 8-dagers behandlingsperioder. (B) signifikant inhibering av tumorvekst ble vist på mus som ble behandlet med 0,5, 1 og 1,5 mg /kg Juglone. Fire nakne mus ble anvendt i hver studie gruppe. Statistisk signifikans ble bestemt av Student t-test, der en
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (*
P
0,05, **
P
0,01)
PIN1 induserer forankringsuavhengig vekst av nasofaryngeale epitelceller
tumorigent effekten av PIN1 overekspresjon ble videre undersøkt i en udødelig nasofaryngeale epitel cellelinje (NP69) transfektert. med to pin1 ligner (pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-pin1 /»Pin1 1 #» og «pin1 2 #»). Overekspresjon av
pin1
transkripsjoner og proteiner ble observert i pin1-transfektert NP69 celler (figur 5A). Figur 5A viser den høye transfeksjonseffektiviteten av pin1-transfekterte celler som uttrykker GFP.
(A) overekspresjon av PIN1 ble påvist i NP69-celler transfektert med Pin1-uttrykkende lenti-virale vektorer (pin1 1 # 2 # og pin1 ) ved qPCR (venstre panel) og Western blot (midtre panelet). Representative bilder av pin1-transfekterte celler ved lyse felt (til høyre øvre panel) og fluorescens-feltet (høyre nedre panel) er vist. Transfeksjonseffektiviteten ble overvåket ved GFP uttrykk. (B) Forbedret forankringsuavhengig vekst på soft agar i NP69 celler med PIN1-overekspresjon, sammenlignet med kontrollceller (venstre øvre panel, kolonier i 6-brønners plater, venstre nedre panel, kolonier henhold mikroskop, panel rett, gjennomsnittsdata i histogrammet ). (C-D) ingen signifikant effekt av PIN1 overekspresjon på cellevekst og kolonidannelse egenskaper ble påvist i de immortaliserte nasofaryngeale epitelceller NP69, ved WST-1 og kolonidannelsesbestemmelsen, respektivt. Statistisk signifikans ble bestemt av Student t-test, der en
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (*
P
0,05).
Den overekspresjon av PIN1 i N69 celler betydelig indusert forankringsuavhengig cellevekst i de myke agar-analyser (figur 5B). Antallet kolonier som dannes i bløt agar av pin1-uttrykkende celler NP69 var signifikant høyere enn de av vektorkontroll. Imidlertid gjorde PIN1 overekspresjon ikke indusere celleproliferasjon og kolonidannelse evne i NP69 celler (figur 5C og 5D).
PIN1 overekspresjon aktiverer MAPK /JNK veien
En reporter luciferase assay viste at MAPK /JNK-signalreaksjonsveien ble signifikant aktivert i NP69-celler som stabilt uttrykker PIN1, sammenlignet med de transfektert med en vektor (figur 6A). Aktivering av HAKK, p53 og NF-kB trasé ble også observert i pin1-uttrykt NP69 celler, selv om det ikke statistisk signifikant. Bortsett fra cyclin D1, bekreftet Western blotting den oppregulering av både c-Jun og fosforyl-c-Jun (Ser63 og Ser73) i NP69 celler stabilt transfektert med PIN1 (fig 6B). Dette funn tyder på at PIN1 induserer veksten av nasofaryngeale epitelceller ved å aktivere MAPK /JNK-reaksjonsveien.
(A) Ved å bruke den Cancer 10-hovedbane reporter Luciferase-analyse, ble det observert signifikant aktivering av MAPK /JNK-signalreaksjonsveien i to stabilt PIN1-overxpressing NP69 cellelinjer (NP69lenti-PIN1 1 # og NP69lenti-PIN1 2 #). For disse PIN1-uttrykkende celler, ble aktiviteten også moderat aktivert i HAKK, P53 /DNA-skade og NF-kB veier. (B) Western blot analyse viste oppregulering av c-Jun, fosforylert c-Jun (Ser63 og Ser73) og cyclin D1 i de stabile pin1-transfektert NP69 celler. Statistisk signifikans ble bestemt av Student t-test, der en
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (*
P
0,05).
diskusjon
I en fersk undersøkelse, Lu
et al
. demonstrert foreningen av pin1 promoter polymorfismer og risiko for NPC [22]. I denne studien, gir vi den funksjonelle bevis på viktigheten av PIN1 overekspresjon i NPC tumorigenesis. Vi viser at PIN1 undertrykkelse hemmer
in vitro Hotell og
in vivo
tumorvekst i NPC celler mens overekspresjon induserer ankeruavhengig vekst av nasofaryngeale epitelceller. Funnene tyder på at PIN1 overekspresjon bidrar til NPC tumorigenesis, og at dens hemming kan være en potensiell terapeutisk strategi for EBV-assosiert NPC.
PIN1 er et viktig enzym som binder fosforylert Ser /Thr-Pro motiver og katalyserer cis /trans-isomerisering av prolin-inneholdende peptider [5]. Overekspresjon av PIN-koden har blitt rapportert i forskjellige humane tumortyper, inkludert bryst [23], esophageal [24], prostata [25] og tykktarmskreft [26, 27]. I denne studien ble konstitutive PIN1 overekspresjon funnet i EBV-assosiert NPC tumorceller, men PIN1 protein ble nesten ikke detektert i EBV-negative nasofaryngeale epitelceller. Siden
PIN1
transkripsjon er lik i begge NPC og normale celler NP, PIN overekspresjon i tumorcellene reguleres ved post-transkripsjonelle mekanismer. En fersk studie rapporterte at PIN1 uttrykk er regulert av svulsten undertrykkende miRNA MIR-296-5p i prostata kreft [28]. Imidlertid er avvikende mir-296-5p uttrykk sjelden påvises i NPC [29]. Restaureringen av PIN uttrykk i MG132 behandlet NP celler tyder på at prosessen med proteasomal nedbrytning er en viktig mekanisme i å regulere PIN1 funksjon. Basu
et al
. viste at proteasomal nedbrytning av PIN1 var avgjørende i sin interaksjon med BCL2 og svulst celle overlevelse [30]. Sammen med de nåværende funn, kan mangelen på eller utilstrekkelig proteasomal nedbrytning være en potensiell mekanisme for å forklare PIN1 akkumulering i EBV-assosierte NPC, som senere hjelpemidler tumorcelleoverlevelse. I vår siste undersøkelse, viste vi et samspill av EBV latent protein EBNA1 med PIN1 i NPC celler (upubliserte data). Ikke desto mindre, det bindende hemmet ikke proteasomal degradering PIN1.
