Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft er i utgangspunktet avhengig av androgener for overlevelse og vekst, noe som gjør hormonbehandling hjørnesteinen behandling for sent stadium svulster. Men til tross for første remisjon, kreft vil uunngåelig gjenta seg. Denne studien var designet for å undersøke hvordan androgen-avhengige prostatakreftceller til slutt overleve og fortsette vekst under androgen-fratatt og antiandrogen supplert forhold. Som modellsystem, vi brukte androgen-responsive PC346C cellelinje og sine terapiresistente underlinjer:. PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2
metodikk /hovedfunnene
Microarray teknologien ble brukt til å analysere forskjeller i genuttrykk mellom androgen-responsive og terapiresistente PC346 cellelinjer. Microarray analyse avdekket 487 transkripsjoner forskjellig-uttrykt mellom androgen-responsive og behandlingsresistente cellelinjer. De fleste av disse genene var felles for alle tre behandlingsresistente underlinjer og bare et mindretall (~ 5%) ble androgen-regulert. Pathway analyse viste anrikning av funksjoner som involverer cellulær bevegelse, cellevekst og celledød, så vel som sammen med kreft og reproduktive system sykdom. PC346DCC uttrykt gjenværende nivåer av androgenreseptoren (AR) og viste en betydelig nedregulering av androgen-regulerte gener (p-verdi = 10
-7). Oppregulering av VAV3 og TWIST1 onkogener og undertrykkelse av den DKK3 tumor-suppressor ble observert i PC346DCC, noe som tyder på en potensiell AR bypass-mekanisme. Påfølgende validering av disse tre genene i pasientprøver bekreftet at uttrykket ble deregulert i løpet av prostatakreft progresjon.
Konklusjon /Betydning
terapiresistent veksten kan skyldes tilpasninger i AR vei, men androgen- uavhengighet kan også oppnås ved alternative overlevelse mekanismer. Her har vi identifisert TWIST1, VAV3 og DKK3 som potensielle aktører i omgåelsen av AR veien, noe som gjør dem gode kandidater som biomarkører og nye terapeutiske mål
Citation. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van Weerden WM, jenster G (2010) Omkjøring Mekanismer av androgen Receptor Pathway i terapiresistent prostatakreft cellemodeller. PLoS ONE 5 (10): e13500. doi: 10,1371 /journal.pone.0013500
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 1 juli 2010; Godkjent: 29 september 2010; Publisert: 19 oktober 2010
Copyright: © 2010 Marques et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet presentert i dette manuskriptet ble finansielt støttet av nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO), gjennom ZonMW stipend 903-46-187, og av det nederlandske Cancer Society (KWF), gjennom tilskudd NKB97-1479 og DDHK 2001-2455. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til mannlige kreftdødsfall i de vestlige land og et økende problem i de vedta vestlig livsstil og kosthold. Fremskritt innen screening og diagnostisering har tillatt påvisning av svulster på tidligere stadier, når kurativ behandling er fortsatt mulig. For sent stadium disseminert sykdom imidlertid dagens behandling er bare palliativ og ingen kurativ behandling eksisterer. Etter veksten av prostata tumorer opprinnelig er androgen-avhengig, er metastatisk cancer vanligvis behandlet med androgen ablasjon, med eller uten anti-androgen supplemente [1], [2]. De aller fleste av disse pasientene viser en betydelig klinisk respons, men kreften slutt gjentar seg innen 12-18 måneder. Disse tilbakevendende tumorer har unnsluppet androgen undertrykkelse og ble motstandsdyktig mot hormonterapi, referert til som hormon ildfast eller kastrering-resistente PCa. For å overleve og fortsette veksten i en androgen-belastede miljø PCA celler må enten tilpasse androgen reseptor (AR) veien til androgen fattige forhold eller påberope alternative overlevelse og vekst trasé [3]. Mye eksperimentelle bevis eksisterer for å støtte begge mekanismer, som ikke nødvendigvis er gjensidig utelukkende. AR ekspresjon ble vist å bli opprettholdt i de fleste pasienter som gjennomgikk hormonbehandling og viste tilbakevending av sykdom, tyder på en rolle for AR også i sent stadium sykdom [4], [5]. Videre er det AR-genet amplifisert og /eller overuttrykt i 30% av de hormonterapi refraktære tumorer, og det er blitt foreslått dette kan sensibilisere reseptoren for gjenværende androgen konsentrasjoner og antiandrogener er tilstede i henhold til hormonell behandling [6], [7 ], [8]. Videre er det flere AR mutasjoner, noe som resulterer i økt aktivitet eller utvidet ligand-spesifisitet til alternative steroider og antiandrogener, har vært assosiert med sykdomsprogresjon [9], [10]. Andre modifikasjoner av AR bane som kan indusere hormon-ildfast vekst inkluderer intratumoral steroidogenesis, ligand-uavhengig aktivering av krysstale med andre signalveier, endringer i balansen av AR co-regulatorer eller uttrykk for konstitutivt aktive avkortede AR isoformer [3] , [11], [12]. Interessant nok har senere arbeider av andre og oss avslørte at AR reaksjonsvei kan være selektivt dempes ved avansert /metastatisk sykdom [13], [14], [15]. Siden AR veien er også involvert i prosesser av celledifferensiering og prostata modning, er det fristende å foreslå at PCA celler etter hvert kan få vekstfordel ved å hemme AR indusert differensiering. Etter oppfordring fra disse resultatene, vi fokuserte studien på alternative overlevelse og vekst trasé, som er uavhengig av AR aktivering. For å omgå effektivt AR vei, må kreft epitelceller kunne overleve de apoptotiske signaler utløst av hormonelle behandlinger og påkalle alternative vekst veier. Autokrin produksjon av vekstfaktorer eller dets reseptorer, aktivering av onkogener og hemming av tumor-suppressor-gener er alle mulige mekanismer for å omgå AR pathway. I overensstemmelse med denne hypotesen, parakrine vekstfaktorer som normalt utskilles av prostata stromaceller, så som epidermal vekstfaktor (EGF), insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF1), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), keratinocytt vekstfaktor (KGF) eller interleukin 6 (IL6), er funnet å være overekspresjon i hormon ildfast kreft i forbindelse med en bryter for å autokrin produksjon av kreft epitelceller [16]. I tillegg til å være potensielle mitogener, montering bevis indikerer at disse veksthormoner er også i stand til å krysstale med det AR signalveien, som fører til ekspresjon av AR målgener i fravær av androgener [17]. Derfor har det fortsatt å være etablert om autokrint produksjonen av disse vekstfaktorer representerer en tilpasning eller en true bypass av AR signalveien. Endringer i anti-apoptotiske
BCL2
onkogen og i pro-apoptotiske
P53 Hotell og
PTEN
tumor-suppressor gener har også blitt funnet i prostatakreft [18], [19]. Men disse hendelsene kommer som oftest før sent stadium progresjon, noe som gjør dem mindre sannsynlige kandidater til bryteren til hormon-ildfast vekst i sent stadium sykdommen. Likevel, ved å hemme PCa celledød og skiftende balansen mot mobilnettet spredning, gener som er involvert i reguleringen av apoptose kan også spille en rolle i hormon-ildfast vekst.
For å utforske mekanismen (e) der androgen- avhengige PCA celler blitt resistente mot hormonbehandling, brukte vi mikromatriser å avhøre forskjeller i genuttrykk mellom androgen-responsive og terapiresistente cellelinjer. Som modellsystem vi brukte androgen-responsive PC346C cellelinje og sine terapiresistente underlinjer PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2. Disse underlinjer ble avledet fra foreldre PC346C ved langvarig androgen ablasjon (PC346DCC), supplert med antiandrogen hydroksyflutamid (PC346Flu1 og PC346Flu2) [20], [21]. Tidligere studier viste tydelige AR modifikasjoner i alle tre behandlingsresistente underlinjer, noe som tilsvarte mangfoldig mekanisme av hormon-ildfast vekst. Mens PC346DCC, som uttrykker svært lave nivåer av AR og PSA, viste tegn på forbikobling av AR vei, PC346Flu1 oppviste 4-fold AR oppregulering og PC346Flu2 ble vist å bære T877A AR mutasjonen. Begge PC346Flu1 og PC346Flu2 underlinjer replikere utviklingen til hormonterapi refraktær sykdom gjennom tilpasninger av AR veien. Derfor fokuserte vi på PC346DCC underlinjen til å velge for gener spesielt involvert i bypass av AR veien. I tillegg til å gi ny innsikt i mekanismene for PCa progresjon, kan genene som er identifisert her være nyttig som prognostiske markører og potensielle mål for nye terapeutiske tilnærminger.
Metoder
Reagenser og cellelinjer
PC346C-cellelinjen ble avledet fra prostata tumor av en pasient med ikke-progressiv prostata adenokarsinom (T4N0M0) [20], [21]. Den PC346DCC ble PC346Flu1 og PC346Flu2 underlinjer avledet fra PC346C på langsiktig kultur i kull-strippet medium, uten eller med antiandrogen hydroksyflutamid tilskudd, henholdsvis. Utvikling og karakterisering av disse cellelinjene er blitt publisert tidligere [20], [21]. Den grunnleggende dyrkningsmedium anvendt i opprettholdelsen av PC346 cellelinjer besto av DMEM-F12-medium (Cambrex BioWhitaker, Belgia) supplert med 2% føtalt kalveserum (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Tyskland), 1% insulin-transferrin-selen (Gibco BRL), 0,01% bovint serumalbumin (Boehringer Mannheim, Tyskland), 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (Sigma-Aldrich), penicillin /streptomycin antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin; BioWhitaker, Belgia ); pluss følgende tillegg: 100 ng /ml fibronektin (Harbor bio-produkter, Tebu-bio, Nederland), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Nederland), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM phosphoethanolamine, 0,6 ng /ml trijodtyronin og 500 ng /ml dexametason (alt fra Sigma). PC346C celler ble holdt i kultur i komplett medium som er beskrevet ovenfor, supplert med 0,1 nM 17-methyltrienolone (R1881, NEN, Boston, MA, USA). PC346DCC seleksjonsmedium ble supplert som beskrevet ovenfor, men utarmet fra androgener ved bruk av dekstran-belagt trekull (DCC) ble behandlet FCS. PC346Flu1 og PC346Flu2 dyrkingsmedium ble også androgen oppbrukt ved å bruke 2% DCC-FCS, og supplert med en mikrometer av hydroksyflutamid (OH-Flutamide, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA).
Celler ble dyrket i T25 Primaria ™ vevskulturflasker (BD Biosciences Benelux NV, Nederland) ved 37 ° C under 5% CO
2 fuktig atmosfære.
Expression microarray analyse
Celler ble sådd i deres respektive seleksjonsmedium for å nå -50% konfluens og tillatt å vokse i 2 dager. Deretter ble cellene skylt to ganger med PBS og lagret ved -20 ° C inntil RNA isolering. Total RNA ble isolert med RNAzol B-reagens (Campro Scientific, Veenendaal, Nederland) og ytterligere renset ved RNeasy kolonner (Qiagen) med mot-kolonne DNA-fordøyelse, i henhold til produsentens protokoll. RNA kvalitet ble kontrollert på 1% agarosegel.
Cy3- eller Cy5-merkede RNA-prober ble fremstilt ved å inkorporere amino-allyl UTP i løpet av RNA-amplifikasjon, etterfulgt av kobling med N-hydroksysuksinimid modifiserte fargestoff. I korthet, ble 3 pg RNA anvendt for en T7-baserte lineære mRNA amplifikasjonsprotokoll, tidligere beskrevet [22]. Amino-allyl UTP, pluss lik mengde av umodifisert rUTP, ble innlemmet i Arna med T7 Megascript Kit (alle fra Ambion), i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Amplifisert RNA ble renset og konsentrert ved hjelp av Microcon-YM 30 kolonner (Amicon®) for å skylle tre ganger med 300 ul RNase-fritt vann. Til slutt, 2 ug aminoallyl-modifisert RNA, i en maksimalt 3,33 ul RNase-fritt vann, ble inkubert med 1,66 pl natrium-bikarbonat-buffer (0,3 M, pH 9) og 5 pl Cy3- eller Cy5- fargestoff (CyScribe Post-merking Kit, Amersham, NJ, USA), i 1 time i mørke ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset med 5 ul 4 M hydroksylamin-HCl (Sigma), ble contra-merkede prober kombinert og renset /konsentrert ved hjelp av Microcon-YM 30. Probe ble oppsamlet i 5-15 ul sluttvolum og resuspendert i 80 ul Ambion hybridiseringsbuffer nummer 1 .
For microarray vi brukt dobbel-dye oligoarrays som representerer ca 15 000 menneskelige gener, som merket RNA fra hver terapiresistent underlinjen ble cohybridized med kontra merket PC346C. Fire mikromatriser ble utført per tilstanden ved hjelp av to forskjellige celle passasjer i dye-swap. Dette ble gjort for å ta hensyn til biologisk variasjon og for å utelukke dye-fortrinnsrett binding til oligonukleotider på microarray. De oligoarrays brukt i denne studien ble produsert ved Erasmus Senter for Biomics. Kort fortalt, et menneske 18,584 oligonukleotider bibliotek (Compugen, Sigma-Genosys) ble oppdaget på aminosilan lysbilder ved hjelp av en Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Canada). Kontroll flekker inkludert landemerker, småblødninger buffer, fremmede oligonukleotider (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly d [A] 40-60, laks sperm DNA, og menneskelig COT-1 DNA. Før hybridiseringen ble microarray lysbilder prehybridisert i 5x SSC, 0,05% SDS, 4% BSA-oppløsning i 30 minutter ved 45 ° C, vasket to ganger med RNase-fritt vann i 2 minutter, skyllet med isopropanol og spinn-tørket i 3 minutter ved 1500 g. Microarray hybridiseringer ble utført over natten ved 45 ° C, med kontinuerlig omrøring, i en HS4800 Hybridisering stasjon (Tecan Benelux BV). Til slutt ble de vasket arrays automatisk i Hybridisering stasjon ved hjelp av.: 2x SSC /0,05% SDS (ved 45 ° C), 1 x SSC og 0,2 x SSC (ved romtemperatur), og tørket under en strøm av N2, før skanning
datauttrekk og analyse
Arrays ble skannet i en ScanArray Express HT scanner (Perkin Elmer, Nederland BV) og spot intensiteter ble kvantifisert ved hjelp Imagene programvare (Bio Discovery Inc, El Sequndo, CA, USA ). For å balansere Cy3 og Cy5 stikk intensiteter, Loewess normalisering per undergruppe ble utført ved hjelp limma-pakke (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) fra Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [23] , [24]. Å skalere mellom arrays, ble den globale median intensitet per array satt til 1000. Dye intensiteter under 200 ble deretter terskel på 200, for å redusere støy og gjøre fold-endring på lav intensitet spekter mer robust mot uteliggere. Flekker med intensiteter under terskelen (200) for både Cy3 og Cy5 kanaler i mer enn 2 av de 4 matriser utføres per underlinjen ble ekskludert fra analysen. Prøve å referere forhold ble deretter beregnet og 2log forvandlet. Flekker som viste motsatt effekt for dye-swap /biologiske replikater ble ekskludert fra videre analyse; effekter ble kalt motsatt hvis gjennomsnitts 2log ratio for per underlinjen var ≥0.5 for en fargestoff og under ≤-0,5 for dye-swap. Etter normalisering og alle de ovennevnte kvalitetskontroller, ble 2log intensitetsforhold midlet for replikater av hver sublinje. Disse dataene ble lagret i SRS7 (Sequence Retrieval System versjon 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Tyskland), som også ble brukt til sammenligninger med andre tidligere publiserte /offentlig tilgjengelige databaser [25]. Den microarray data ble avsatt i Gene Expression Omnibus repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/under GEO sjonsnummer GSE21596). Hierarkisk clustering og datavisualisering ble utført ved hjelp Cluster og Utforsker programmer (Eisen Labs: https://rama.lbl.gov). Analyse av betydning Mikromatriser (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) ble benyttet for å bestemme hvilke gener som var statistisk forskjellig mellom stimulerte prøver og ikke-stimulerte referanser. Gene ontologi clustering ble utført ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [26], [27]. Den veien og funksjonelle analyser ble generert gjennom bruk av Oppfinnsomhet Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
cDNA syntese og RT-PCR-analyse
Normal og vevsprøver fra pasienter som brukes for kvantitativ real-time RT-PCR-analyse ble hentet fra den frosne vev bredden av Erasmus Medical Center (Rotterdam, Nederland). Prøvene ble samlet inn mellom 1984 og 2001. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Erasmus MC Medical Ethics Committee i henhold til medisinsk forskning som omfatter mennesker loven. Ytterligere informasjon om disse prøvene ble gitt tidligere. [28] Totalt RNA ble isolert som beskrevet ovenfor, og cDNA ble syntetisert ved anvendelse MMLV-revers transkriptase kit og Oligo (dT)
12-18 primer (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. cDNA-prøvene ble lagret ved -20 ° C. TaqMan real-time PCR-analyse ble utført på en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), ved bruk av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Validerte primere og prober fra TaqMan genuttrykk Analyser (Applied Biosystems) ble brukt for kvantifisering av VAV3 (Hs00916821_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1), DKK3 (Hs00951307_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1), i henhold til PCR-innstillingene som tilbys av Applied Biosystems. PBGD ble kvantifisert ved bruk av 0,33 mikrometer primere termin: CATGTCTGGTAACGGCAATG og omvendt: GTACGAGGCTTTCAATGTTG primere, i kraft SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), i henhold til termo protokoll anbefalt av produsenten. Transkripsjon mengder for hver prøve ble normalisert mot gjennomsnittet av to endogene referanser og i forhold til en kalibrator. De to housekeeping gener brukes som endogene referanser var
PBGD Hotell og
GAPDH
; en blanding av cDNA fra prostata carcinoma xenotransplantater ble anvendt som kalibrator. Grafer og statistikk ble utført med GraphPad Prism (versjon 3.0). P-verdier 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Differensial genuttrykk profil mellom androgen-responsive PC346C og sine terapiresistente underlinjer
Expression rekke analyse ble utført. for å undersøke om AR veien er fortsatt aktiv i hormon-terapi ildfaste cellene under androgen-belastede forhold og identifisere mulige alternative vekst /overlevelse veier. Hver av terapi-resistente underlinjer ble dyrket i deres respektive seleksjonsmedium (steroid-strippet medium for PC346DCC, supplementert med 1 mM OH-flutamid for PC346Flu1 og Flu2) og hybridisert på mikromatriser, sammen med den paren androgen-responsive PC346C (dyrkede i fullstendig medium supplementert med 0,1 nM R1881). Å ta hensyn til den biologiske variasjon og dye-fortrinnsrett binding til oligonukleotider på microarray, ble fire arrays utført per tilstanden ved hjelp av to uavhengige celle passasjer i dye-swap. Variasjon i uttrykket mønsteret ble analysert per terapiresistent underlinjen, og flekker ble ansett for å være forskjellig uttrykt hvis den absolutte 2log forholdet ≥ 0,5 (ratio ≥ 1,42 eller ≤0.71) i minst tre av de 4 arrays og for gjennomsnittet av alle fire arrays. Ifølge disse kriteriene, var det totalt 487 ulikt regulert transkripsjoner i terapiresistente underlinjer i forhold til androgen-sensitive PC346C, hvorav de fleste var overlapp alle tre ildfaste underlinjer (Fig. 1). Med 276 ulikt regulert transkripsjoner, PC346DCC viste den sterkeste avvik fra foreldrelinjen, mens PC346Flu2 avslørte de minst endringer (127 transkripsjoner). Analyse av betydning Mikromatriser (SAM) ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av de utvalgte gener og, ved en 5% falsk funnrate, 392 av de 487 (80%) valgt nådde statistisk signifikans. De 100 differensielt uttrykte gener mellom terapi-resistente og androgen-responsiv cellelinjer, respektive uttrykk forholdstall og statistisk analyse er presentert i tabellene 1 og 2. En omfattende liste over alle de regulerte gener pr sublinje er gitt i tabellene S1 S3 . Interessant, en betydelig andel (64/487) av de differensielt regulert genene gruppert på forskjellige genomiske steder på kromosom 4, 5, 6, 8, 11 og 18 (p-verdi 0,05; tabell 3).
PC346C var dyrket i komplett medium med 0,1 nM R1881, mens hormon-ildfast underlinjer var kultur i dekstran-belagt trekull strippet medium (PC346DCC), supplert med en mikrometer av antiandrogen hydroksyflutamid (PC346Flu1 og PC346Flu2). A) Varme kartet representasjon: røde og grønne farger representere oppregulering og nedregulering, henholdsvis, mens svart indikerer ingen forskjell mellom underlinjer og foreldre PC234C celler. Grå firkanter angir manglende data, enten på grunn av lave nivåer, dårlig datakvalitet eller fravær av prober for den respektive transkriptet i matrisen plattformen benyttet ved undersøkelsen. B) Venn-diagram over antall regulerte gener i de forskjellige underlinjer.
AR veien er nedregulert i PC346DCC
For å undersøke aktiverings tilstanden i AR sti i PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2 ble SRS databasen brukes til å koble og sammenligne våre presentere data med en tidligere etablert androgen-respons gen signatur (fig. 2A). Dette androgen-respons signatur ble bestemt ved uttrykket mikromatriseanalyse, etter stimulering av de forskjellige PC346 cellelinjer med det syntetiske androgen R1881 eller antiandrogen hydroksyflutamid (tabell S4). Av de 487 differensielt regulerte transkripsjoner i terapiresistente underlinjer, bare 27 var AR målgener ( 6%), noe som indikerer at andre gener og stier er også involvert i hormonterapi ildfast spredning av disse underlinjer. Videre AR målgener ble nedregulert i PC346DCC (p-verdi = 10
-7), mens deres uttrykk i PC346Flu1 og PC346Flu2 ikke var signifikant påvirket (Fig. 2B). Imidlertid, selv om det ikke statistisk signifikant for den AR reaksjonsveien som en helhet, PC346Flu1 og PC346Flu2 gjorde viser lavere induksjon av noen androgen-responsive gener som KLK2, STEAP1, STEAP2 og EHF.
Forskjellig-uttrykte gener i PC346 hormon -refractory underlinjer versus foreldre PC346C var knyttet til en tidligere etablert androgen-respons-genet signatur (se Materialer og metoder). (A) Termisk kart representasjon av androgen-responsive gener deregulerte i en hvilken som helst av de PC346 hormon ildfast underlinjer. Fargevalg som beskrevet i fig. 1. (B) Venn-diagram og respektive statistikk.
Gene ontologi og sti analyse identifiserer kreft signatur
Den valgte 487-genet signaturen ble klassifisert i henhold til Gene ontologi (GO) biologiske prosesser ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) [26], [27]. Stempler clustering analyse viste berikelse i kategorier som er involvert i organutvikling, reproduktive system differensiering, cellevekst, differensiering og apoptose (tabell 4). Oppfinnsomhet Pathway Analysis ble brukt til å identifisere berikelse i «sykdommer og lidelser», «molekylære og cellulære funksjoner», og for å søke etter indre trasé /nettverk innen de utvalgte gensettene (www.ingenuity.com). Kreft og reproduksjonssystemet sykdom ble rangert på topp tre av «sykdommer og lidelser», som logisk bekreftet anriking av gener assosiert med PCA som hepsin, Clusterin, vitamin D reseptor, trekløver faktor 3, tumor protein D52, AR selv og flere av målgener (fig. 3a og 3b, henholdsvis). Videre brukte vi Network analyse for å skjerme den 276-genet signaturen PC346DCC for potensielle alternative vekst veier som kan være involvert i å omgå AR signalering. Interessant, signaliserer via vekst-hormon reseptor (GHR), insulinreseptoren (INSR) og epidermal vekstfaktor reseptor var blant de 10 beste Networks (Poeng = 20) som viser deregulering i PC346DCC (Fig. 3C).
Top 5 biologiske funksjoner anriket i terapi-resistente underlinjer: (a) sykdommer og forstyrrelser, (B) molekylære og cellulære funksjoner. (C) Eksempel på nettverksanalyse for PC346DCC viser deregulering av hormon og vekstfaktor-reseptor signalisering: oppregulert gener er representert i røde og fortrengte gener i grønt. Analysene ble utført ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare (www.ingenuity.com).
Integrative analyse viser gener deregulerte i prostata kreft progresjon
For å identifisere gener modulert ved PCA som kunne forklare hormonterapi ildfast vekst gjennom bypass av AR bane, knyttet vi den 276-genet signatur fra PC346DCC med data fra syv PCA microarray studier publisert tidligere (tabell 5) [14], [29], [30], [31 ], [32], [33], [34]. Bare gener som er tilstede i minst 5/7 databaser (209 gener) og deregulerte i minst 3/7 (111 gener) ble inkludert for videre analyse. Hierarkisk clustering utført på signatur gener (første kolonne), ved siden av primær kreft vs. normal prostata (andre kolonne), metastatisk kreft vs. primær kreft (tredje kolonne), og til slutt hormon-ildfast vs. hormon-naive sykdom (fjerde kolonne ), er vist i fig. 4. Omtrent 30% av genene forskjellig uttrykt i PC346DCC ble funnet å være konsekvent deregulert i metastatisk PCa forhold til organ begrenset sykdom.
276-genet signatur fra PC346DCC var knyttet til data fra 7 prostatakreft microarray databaser av primær (Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu), metastatisk (Chandran, Lapointe, Varambally, Tomlins, Yu) og hormonterapi ildfaste tumorer (Tamura, Tomlins og beste). Bare gener som er tilstede i minst 5/7 databaser (209 gener) og deregulerte i minst 3/7 (111 gener) ble inkludert i analysen. Heat-kart representasjon av (A) 72 uttrykt og (B) 39 trykt gener i PC346DCC. (C) deregulert gener valgt for videre qPCR analyse. Fargevalg som beskrevet i fig. 1. Grey firkanter angir manglende data, enten på grunn av lave nivåer, dårlig datakvalitet eller fravær av prober for den respektive transkriptet i matrisen plattformen benyttet ved undersøkelsen. PC-NAP: prostatakreft minus normal tilstøtende prostata; MET-PC: metastase minus primære prostatakreft; HR-HN. Hormonterapi ildfast minus hormon naive svulster
TWIST1, DKK3 og VAV3 som markører for sykdom diagnose og prognose
Basert på deres anerkjente patologiske funksjoner og konsekvent deregulering i flere PCA databaser, vri homolog 1 (TWIST1), VAV 3 guanin nukleotid utveksling faktor (VAV3) og dickkopf homolog 3 (DKK3) ble valgt for sin potensielle rolle i bypass av AR veien. På denne måte TWIST1 og VAV3 er antatte onkogener er involvert i veksthormon signalering, slik det er åpenbart av oppfinnsomhet Pathway-analyse (fig. 3C). På den annen side, er DKK3 en tumor suppressor, som viser sterk nedregulering i datasett fra Chandran
et al.
, Lapointe
et al.
Og Varambally
et al.
(fig. 4C). Mens TWIST1 viste konsistent oppregulering i grunnskolen og metastatisk PCA datasett fra Varambally
et al.
, Yu
et al.
, Lapointe
et al.
Og Chandran
et al.
, VAV3 ble nedregulert i primære svulster etterfulgt av oppregulering i metastase (fig. 4C).
Kvantitativ RT-PCR ble utført på et uavhengig sett med prostata prøver, innhentet ved radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon av prostata av pasienter som opereres ved Erasmus MC klinikken. Dette panelet inneholdt 21 benign prostata vevsprøver og 74 adenokarsinomer på ulike sykdomsstadier. Kvantitativ PCR analyse viste (henholdsvis P-verdi = 0,0001 og 0,002,) oppregulering av TWIST1 i primær PCA prøver og lymfeknutemetastase. Det ble ikke observert forskjell mellom hormon-ildfast (hrpc) og hormon naive svulster (HNPC) (Fig. 5A). DKK3 uttrykk var betydelig redusert ved PCA og lymfeknutemetastase (P-verdi ≤0.0001), selv om ingen forskjell ble observert under progresjon fra organ begrenset til metastatisk eller hormon-refraktær sykdom (fig. 5B). VAV3 uttrykk redusert gradvis i løpet PCa progresjon, med de laveste nivåene observert i metastatisk prostatakreft (P-verdi = 0,0001 for Post lineær-trend test) og hormon-ildfast prøver (P-verdi = 0,005 for HNPC vs. hrpc Fig. 5C ). Lymfeknute prøver ble fjernet fra VAV3 analyse i fig. 5C, fordi VAV3 ble sterkt uttrykt i normal lymph node i forhold til normal prostata vev (data ikke vist). I disse innstillingene, kan tilstedeværelsen av rester av normal lymfeknute vev føre til overestimering av den virkelige VAV3 kvantitet i lymfeknutemetastase. Kaplan-Meier-analysen viste en direkte sammenheng mellom VAV3 ekspresjon og metastase-overlevelse (p-verdi = 0,004 for Logrank trend test Fig. 5D).
prostata tumorprøver ble oppnådd ved radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon av prostata pasienter som blir operert ved Erasmus MC klinikken. Dette panelet inneholder 21 godartet prostata vevsprøver og 74 adenokarsinomer på ulike sykdomsstadier. (A) TWIST1; (B) DKK3; (C) VAV3 uttrykk i prostata prøver; (D) VAV3 metastase overlevelse analyse. NAP: normal tilstøtende prostata; PC: primære prostatakreft; LNmet: lymfeknutemetastase; PC-Met: ikke-progressive organ-confine prostatakreft; PC + Met: primære svulst fra progressiv prostatakreft som enten hadde eller utviklet metastaser under påfølgende oppfølging; HN: hormon-naive; HR: hormonterapi ildfaste materialer; (*) P-verdi ≤0.0001 og (**) p-verdi ≤0.005 hjelp Mann-Whitney to-tailed test. (***) P-verdi ≤0.0001 med Post lineær-trend test.
Diskusjoner
I denne studien brukte vi microarray analyse for å identifisere forskjeller i genuttrykk mønster av androgen-responsive PC346C cellelinje og sine terapiresistente underlinjer: PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2. Denne analysen oppdaget 487 transkripsjoner forskjellig regulert i hormonterapi ildfaste celler versus foreldre PC346C. Mange av disse var felles for alle terapi-resistente underlinjer, til tross for de forskjellige AR pathway modifikasjoner, noe som tyder på lignende vekstfremmende tilpasninger (fig. 1). Disse delte gener kan deles inn i fire hovedkategorier: Regulering av cellesyklus progresjon og spredning, utvikling og cellulær differensiering (CLEC3B, KCNJ8, ADAM29, DNMT3A), fettsyrer og steroid (ex HPN, NDN, ATR, ABL2, DHRS2.)
