Abstract
Kreft-assosiert kakeksi er en kompleks metabolske tilstand preget av den progressive tap av kroppsfett og forverring av muskelmasse. Selv om de cellulære og molekylære mekanismer for kakeksi er ufullstendig forstått, har tidligere undersøkelser antydet mitokondriell dysfunksjon i murine modeller av cancer cachexia. For bedre å forstå den metabolske skift i kreft-indusert kakeksi, studerte vi effektene av forsterket oksidativ kapasitet på muskelsvinn ved hjelp av transgene mus som over-uttrykker peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma Co-aktivator-1α (PGC-1α) i skjelettmuskulatur i en Lewis lungekarsinom-implantert modell. Økning av mitokondrier biogenese ble observert i skjelettmuskulatur av tumor-implanterte mus. Men disse øker ikke hindre eller reversere muskelsvinn hos mus skjuler svulster. I tillegg ble tumorstørrelse øket i muskel PGC-1α overuttrykkende mus. Vi fant tilsvarende nivåer av sirkulerende inflammatoriske cytokiner i tumor implantert dyr, som ikke ble berørt av økt muskel uttrykk for PGC-1α. Våre data indikerte at økt mitokondrie biogenesis i skjelettmuskulatur er ikke tilstrekkelig til å redde tumor-assosiert, akutt muskel tap, og kan fremme tumorvekst, eventuelt gjennom utgivelsen av myokines
Citation. Wang X, Pickrell AM, Zimmers TA, Moraes CT (2012) økning i muskel mitokondrie biogenesis hindrer ikke muskel tap, men Økt tumorstørrelse i en musemodell for Akutt Cancer-Induced kakeksi. PLoS ONE 7 (3): e33426. doi: 10,1371 /journal.pone.0033426
Redaktør: Antoni L. Andreu, Hospital Vall d’Hebron, Spania
mottatt: 28 november 2011; Godkjent: 12 februar 2012; Publisert: 12 mars 2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institute Helse- og muskeldystrofi Association. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Klinisk, kakeksi er definert som «en kompleks metabolsk syndrom forbundet med en underliggende sykdom, og kjennetegnes ved tap av muskel med eller uten tap av fettmasse» [1]. Det har blitt funnet i mange kroniske eller sluttstadiet av sykdommer som AIDS, tuberkulose, og kreft [2]. Opp til 50% av ubehandlede kreftpasienter opplever progressivt tap av fett og mager kroppsmasse uten sult, en kompleks syndrom referert til som kreft-indusert kakeksi [3]. Tilstedeværelsen av avmagring er vanligvis forbundet med intoleranse overfor behandling, dårlig livskvalitet og høy dødelighet hos pasienter [4].
Selv om omfattende studier har blitt utført i løpet av det siste tiåret, de underliggende mekanismene som forårsaker kreft kakeksi er fremdeles ikke fullt ut forstått. En av de ledende teoriene er at tumor-avledede faktorer er ansvarlig for nedbrytningen av kroppsmassen, inkludert muskel [2]. Det er allment akseptert at proinflammatoriske cytokiner spiller en viktig rolle i alle veier som fører til hyper katabolisme og vekttap assosiert med kreft kakeksi [5]. Tilstedeværelsen av systemisk inflammasjon er vanligvis knyttet til dårligere prognose hos pasienter [6].
Kreft kakeksi fører til systemendringer i pasientenes metabolsk profil for å støtte kreftutvikling. Det har blitt rapportert at mitokondriell dysfunksjon i muskel-skjelettlidelser, inkludert redusert oksidativ fosforylering (OXPHOS) kapasitet og forstyrret mitokondrielle dynamikk, er involvert med systemisk inflammasjon og skjelettmuskel sløse [7]. Den peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptorer (PPAR) transkripsjonsfaktorer familie og deres modulator PPAR-gamma co-aktivator-1α (PGC-1α) er master regulatorer av mitokondrie biogenesis og energiomsetning [8]. Mitokondrie frakoblings proteiner (UCPs) 1, 2 og 3 er oppregulert i atrophying muskel; og metabolsk abnormalitet med øket proteolyse i muskelen er blitt antydet i kakektiske pasienter [9], [10]. Aktivering av pro-inflammatoriske cytokin TNFa-indusert NF-kB ble vist å redusere promoter transaktivering og transkripsjonelle aktivitet av regulatorer av mitokondriell biogenese (PGC-1α, PPARa, og TFAM) og påvirke nedstrøms oksydative markører (sitrat-syntetase, og cytokrom
c
oksidase) [11]
Kliniske intervensjoner har blitt utviklet for generell symptom forvaltning av denne ødeleggende tilstanden.; Men disse tiltakene er kun palliativ uten spesifikt rettet mot årsaken faktor av kakeksi og resultatene er ikke tilfredsstillende [12].
I denne studien undersøkte vi potensialet terapeutiske effekten av å øke mitokondrie biogenesis av overekspresjon PGC-1α i skjelettmuskulatur i en transgen musemodell av cancer cachexia. Våre resultater tyder på at øket mitokondrie biogenese i muskelen var ikke tilstrekkelig til å endre nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner og hindre muskel tap assosiert med tumor-implantasjon. Videre kan økningen i muskel PGC-1α også ha bivirkning av å fremme tumorvekst.
Resultater
Tumor-inokulert transgene MCK-PGC-1a mus opprettholde økt mitokondriell biogenesis i gastrocnemius og quadriceps
Transgene MCK-PGC-1α mus over-express PGC-1α i skjelettmuskulatur, drevet av muskel kreatin kinase (MCK) promoter [13]. Vi observerte en økning på
Ppargc1a
mRNA nivåer av 13-fold i gastrocnemius, en muskel som består av tilsvarende nivåer av Type I (oksidativ) og Type II (glykolytiske) fibre og 19 ganger i quadriceps, en muskel består hovedsakelig av type II fibre, i fire måneder gamle tumor-free transgene MCK-PGC-1α mus (figur 1A). En lignende økning ble observert i tumorbærende mus (figur 1A). Når vi fast bestemt på steady state nivåer av PGC-1α protein i gastrocnemius og quadriceps homogenates, observerte vi en markant økning i transgene mus sammenlignet med kontroller, med eller uten svulster. Resultatene for gastrocnemious og quadriceps var i hovedsak identisk for begge genotyper (figur 1B, C og ikke vist).
A
. mRNA nivåer (ΔΔCt) av
Ppargc1a
i gastrocnemius og quadriceps normalisert til
GAPDH
ved 4 måneder-of-age i MCK-PGC-1α og kontroller uten og med svulst implantasjon (n = 4 /gruppe).
B, C
. Venstre panel: Representant Western blotting-analyse av stabile nivåer av PGC-1α og mitokondrielle proteiner (kompleks II subenhet SDHA, kompleks III subenhet UQCRC1 og komplekse jeg subenhet NDUFB8) ved 4 måneder-of-age fra muskel homogenates av MCK-PGC- 1α og kontroller. Høyre panel: Optisk tetthet (OD) kvantifisering av proteiner av interesse normalisert toα tubulin (n = 3 /gruppe i
B
, n = 4 /gruppe i
C
). Feilfelt er gjennomsnitt ± SEM.
PGC-1α er en transkripsjons coactivator som oppregulerer transkripsjon av atom kodet mitokondrielle proteiner, stimulere mitokondrie biogenesis [14], [15], [16]. Vi kvantifisert nivåene av mitokondrie proteiner i fire måneder gamle MCK-PGC-1αmice og funnet betydelig høyere nivåer av flere mitokondrielle markører i mus uten eller med svulster (Figur 1B og 1C). Nivåene av mtDNA i både gastrocnemius og quadriceps ble forhøyet i PGC-1α uttrykker mus (Figur 2A). I samsvar med tegn til økt mitokondrie biogenesis, observerte vi betydelige økninger i citratsyntaseaktivitet (CS) og cytokrom
c
oksidase (COX) aktiviteter både i gastrocnemius og quadriceps (figur 2B, C).
A.
mtDNA kopi antall gastrocnemius og quadriceps på 4 måneder gammel MCK-PGC-1a og villtype mus, uten og med tumor implantasjon (n = 5 /gruppe).
B-C.
COX og CS enzymatisk aktivitet av gastrocnemius (
B
) og quadriceps (
C
) muskel homogenates normalisert til protein fra tumor MCK-PGC-1α og alder-matchet kontroller (n = 5 /gruppe).
D-E mRNA nivåer.
(ΔΔCt) av
Ppara
,
Pparg
,
Ppard
, og
Ppargc1b
i gastrocnemius (
D
) og quadriceps (
E
) normalisert til
GAPDH
4 måneder gammel svulst MCK-PGC1-α og alderen-matchet kontroller (n = 4 /gruppe). Feilfelt er gjennomsnitt ± SEM.
Interessant, vi la merke til en differensial regulering av et annet medlem av PGC-1 familien, PGC-1β i gastrocnemius og quadriceps i tumor vaksinert dyr. Mens det forble uendret i gastrocnemius vev,
Ppargc1b
mRNA nivåer ble betydelig redusert i quadriceps vev av tumorbærende MCK-PGC-1αmice (figur 2D, E). Følgelig uttrykket nivåer av transkripsjonsfaktorer
Ppara Hotell og
Pparg
ble betydelig økt i gastrocnemius, men ikke i quadriceps muskel (figur 2D, E).
Over-uttrykk MCK-PGC-1αdoes ikke beskytte mot kreft-indusert muskel tap
Tidligere vårt laboratorium viste at over-uttrykk for PGC-1αin skjelettmuskulatur beskyttet og bremset utviklingen av mitokondrie myopatier og alder-indusert sarcopenia [17 ], [18]. Vi antok at med økt mitokondriefunksjon, ville våre MCK-PGC-1a mus være mer motstandsdyktig mot muskelsvinn ved å reversere de metabolske endringer som bidrar til kakeksi.
Etter å ha bekreftet dette robust forbedring i mitokondrie biogenesis, undersøkte vi om løpet uttrykking av PGC-1α kan gi beskyttelse mot muskel tap i vår tumorigent modell. Vi fulgte vekten av de MCK-PGC-1a og villtype-mus, med eller uten tumor, som en indikator av generell helse etter inokulering av tumorceller. Vi observerte ingen signifikant forskjell mellom gruppene inntil etter injeksjon dag-12 og -13, hvor MCK-PGC-1a tumor mus hadde en signifikant økning i prosentvis kroppsvekt sammenlignet med alle andre grupper av 3 mus (figur 3A).
A.
Prosent kroppsvekt i løpet av to uker etter tumorcelle eller saltvann injeksjon for MCK-PGC-1α eller kontroller ved 4 måneder-of-age, antall dyr som er merket.
B.
Andel svulst frie kroppsvekt på 2 uker etter tumor inokulering av MCK-PGC-1α og alder-matchet kontroller, antall dyr som i panelet
A
.
C.
Vekt av tumor (gram) hentet fra injeksjonsstedet 2 uker etter tumorinokulasjon (n = 5 for villtype, n = 7 for MCK-PGC-1α).
D.
Lineær regresjon modellering forholdet mellom endringer i prosent kroppsvekt og vekten av svulst MCK-PGC-1α og alderstilpassede tumorbærende kontroller, antall dyr som i panelet
C
.
E.
Vekt av gastrocnemius og quadriceps (gram) av saltvann-injisert og tumor-inokulert grupper av MCK-PGC-1α eller alderstilpassede villtype mus, antall dyr som i panelet
A
.
F.
Konsentrasjoner av serum IL-6 i kontroll og tumor-bærende villtype og MCK-PGC-1α mus (n = 5 /gruppe). Feilfelt er gjennomsnitt ± SEM.
For å forstå hvor denne økningen i kroppsvekt for MCK-PGC-1a tumor mus kom fra, vi undersøkte kroppsvekt og hentet svulst vekt. Vi fant at tumor-frie kroppsvekt ble signifikant redusert i tumorbærende mus av begge genotyper, og ingen store forskjeller mellom den transgene og villtype-mus (figur 3B). Imidlertid tumorene ekstrahert fra MCK- PGC-1a mus var tilnærmet 50% større enn kontrollene (figur 3C). Når plotte endringer av kroppsvekt mot tumorstørrelse, bemerket vi en positiv korrelasjon i villtype mus, som ble forstyrret i MCK-PGC-1a tumor mus (Figur 3D). Med dette bevis, konkluderte vi at den totale kroppsvekt for tumorbærende MCK-PGC-1α mus var forårsaket av økningen i tumormassen og ikke en gevinst i muskelvekt. Men til tross for å ha større svulster, MCK-PGC-1α mus ikke miste mer vekt enn tumorbærende kontroller.
Vekten av både gastrocnemius og quadriceps var mildt, men betydelig redusert i villtype tumor mus, noe som indikerer vår modell indusert muskel tap (Figur 3E). Imidlertid var det ingen forskjell i noen muskelgruppe, sammenlignet mellom tumor-inokulerte transgene og villtype-mus (figur 3E). Vi har også kvantifisert konsentrasjonen av pro-inflammatoriske cytokin IL-6 i serum. Som forventet ble IL-6 nivåer dramatisk økning i tumorbærende mus av begge genotyper i forhold til kreftfrie mus, men vi fant ikke signifikante forskjeller mellom de to genotypene (figur 3F). Dermed MCK-PGC-1α ikke synes å beskytte mot muskel tap eller for å redusere systemiske IL-6 nivåer på dette endepunktet.
Diskusjoner
I denne studien benyttet vi MCK-PGC- 1α musemodell for å studere effekten av økt mitokondriell biogenese på kreft-indusert muskel tap. Vi fant økt mitokondriell biogenesis i muskel av MCK-PGC-1a tumor mus sammenlignet med WT tumor mus. Overraskende, fant vi at økt uttrykk av PGC-1α i muskel ikke forhindre muskeltap. Dette var et uventet resultat, som muskel PGC-1α ble vist av vår gruppe og andre til å gi bred beskyttelse til ulike forhold knyttet til muskel degenerasjon [17], [19].
Selv om årsakene til kakeksi er fortsatt dårlig forstått, økt nedbrytning og redusert syntese av muskelproteiner ved proteasomet systemet synes å spille en viktig rolle [20]. Systemisk inflammasjon synes å formidle denne mekanismen i kreft-indusert kakeksi [5]. Rosenberg og kolleger foreslo at høye serumnivåer av TNFa og IL-1β var årsakene til vekttap ved revmatoid kakeksi [21]. Systemisk cytokin-drevet betennelsesreaksjon hos AIDS-pasienter med samtidige aktive infeksjoner har også vært assosiert med kakeksi [22]. Modellen av subkutan tumorimplantering viser også en økning i sirkulerende IL-6-nivåer forbundet med muskel og total kropps vekttap. I våre eksperimenter de IL-6-nivåer var ikke forskjellig mellom villtype og MCK-PGC-1α mus (figur 3F). Derfor spekulerer vi at selv om PGC-1α kan beskytte mot muskel tap forbundet med iboende metabolske dysfunksjoner [17], [19], er det mindre effektivt i å utelukke muskel tap forårsaket av ytre inflammatoriske signaler.
MCK- PGC-1α musemodell har blitt grundig studert av vår gruppe og andre i ulike myopatier. Foruten den transgene strategi, kan PGC-1α også være forårsaket av utholdenhetstrening [23], [24]. Både økt muskel PGC-1α ekspresjon og mosjon har vist seg å lindre systemisk inflammasjon [9], [19], [25]. Som en del av combinatory terapi, mosjon konkordant med pasientens fysiske forholdene er vanligvis foreslått under klinisk intervensjon [26]. I vår modell av kreft-indusert kreftkakeksi forsøksdyr dø innen 2 uker etter tumorinokulasjon. Musene utviklet mild muskel tap innenfor en 13-dagers tidsramme med svulsten vises så tidlig som dag 5 etter vaksinasjonen. Selv PGC-1α overekspresjon ikke lindre mild muskel tap i vår akutt tumorigent modell, tror vi senere eksperimenter bør undersøke potensialet terapeutiske effekten av økt mitokondriell biogenesis i mer alvorlige eller kroniske modeller av kreft-indusert muskelsvinn.
Selv om årsaken til dette negativt resultat ikke er kjent, har vi også funnet at tumorene var ca. 50% større i mus som overuttrykker muskel PGC-1α. En mulig forklaring på denne observasjonen er at skjelettmuskel kan utskille myokines, slik som IL-6, som kan ha vekststimulerende aktivitet [27]. Dette var en forventet observasjon som garanterer videre utforskning med forskjellige krefttyper og modeller.
I sammendraget, vårt arbeid vist at å stimulere mitokondrie biogenesis var ikke tilstrekkelig til å hindre eller reversere muskel tap under akutt kreft-indusert muskelsvinn. Videre fant vi bevis for at PGC-1α uttrykk i muskel kan føre til utvikling av større svulster.
Metoder
Dyr
Den generasjonen av MCK-PGC-1α transgen musene ble tidligere beskrevet [13]. Hunndyr for analyse var ren C57BL /6J MCK-PGC-1α mus med alderstilpassede kullbror kontroller. Alle mus prosedyrer ble utført i henhold til en protokoll godkjent av University of Miami: Institutional Animal Care og bruk Committee (# 10-071). Mus ble plassert i en virus-antigen fritt anlegg ved University of Miami: Division of Veterinary Resources under en 12 timers lys /mørke syklus ved romtemperatur og matet
ad libitum
med standard gnager kosthold. Den endepunktet i studien var satt når den fysiske tilstanden for mer enn 50% av gjenværende tumorbærende mus ble vurdert som kritisk og avlives innen 24 timer.
tumorinokulasjon
Dame villtype mus og MCK-PGC-1α transgene kullsøsken (n = 8 /gruppe) ved 4 måneders alder ble injisert subkutant med 10
6 Lewis lunge carcinoma celler i 100 ul steril bærer, fosfat-bufret saltvann (PBS), mellom skulder blad. Kontroller ble injisert på samme måte og sted med PBS (n = 7 til villtype-mus, n = 5 for MCK-PGC-1α mus). Vekten av dyrene ble registrert og deres generelle helse ble overvåket daglig etter tumor-inokulering. Enkeltpersoner anses i dårlig forfatning i stand til å overleve fram til endepunktet for studien ble avlivet og ekskludert fra videre analyse.
spektrofotometer Analyser
OXPHOS analysene ble utført som tidligere beskrevet [28]. I korte trekk, ble homogenates fra quadriceps og gastrocnemius utarbeidet med en vev homogenisator (Omni) i PBS pluss proteasehemmer cocktail (Roche) på is. Prøvene ble sentrifugert ved 800 g i 5 minutter, og supernatanten av homogenat ble tilsatt til en buffer inneholdende 10 mM KH
2PO4, 1 mg /ml BSA, 120 mM lauryl maltosid, og 2 mM cytokrom
c
redusert med natriumhydrosulfitt i. blandingene ble fulgt ved 550 nm med absorpsjonen avlesning tatt hvert 11. sekund i 2 minutter ved 37 ° C. 240 uM kaliumcyanid ble anvendt for å hemme reaksjonen til å sikre skråningen var spesifikk for cytokrom
c
oksidase (COX). Bakkene ble normalisert ved proteinkonsentrasjon bestemt ved Bradford-analysen.
For citratsyntaseaktivitet (CS) aktivitetsanalyse, ble supernatantene tilsettes til en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM acetyl CoA, 10 mM 5, 5′-dithiobis- (2-nitrobenzosyre), og 0,1% triton X-100. Analysen ble utført ved 30 ° C med 50 mM oksaloacetat (OXA) for å starte reaksjonen. Avlesninger ble oppnådd hvert 11. sekund i 3 minutter. Bakkene er tatt før du legger OXA ble hentet fra skråningen med OXA. Normalisering var som ovenfor.
mRNA Isolasjon og revers transkriptase PCR
dissekert quadriceps og gastrocnemius muskel vev ble neddykket i TRIzol® (Sigma /Invitrogen). Vev ble homogenisert med en håndholdt rotor homogenisator (VWR), og RNA ble ekstrahert ved kloroform faseseparasjon. Vi brukte en mikrogram av RNA for revers-transkripsjon reaksjon med iScript cDNA syntese kit i henhold til produsentens protokoll (BioRad).
Real-time PCR
Maxima SYBR Grønn /ROX qPCR mester mix (Fermentas) ble brukt i henhold til produsentens anvisninger for å utføre real-time PCR. Primere som brukes til cDNA kvantifisering var:
Ppargc1a plakater (5’CTGCGGGATGATGGAGACA, 5’AGCAGCGAAAGCGTCACA),
Ppargc1b plakater (5’TGGCCCAGATACACTGACTATG, 5’TGGGCCTCTTTCAGTAAGCT),
Ppara product: (5’TTCCCTGTTTGTGGCTGCTAT, 5’CCCTCCTGCAACTTCTCAATGTAG),
Pparg plakater (5’CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTA, 5’GCGGTCTCCACTGAGAATAATGAC),
Ppard plakater (5’ACCGCAACAAGTGTCAGTAC, 5′ CTCCGGCATCCGTCCAAAG), og
GAPDH plakater (5’TGCACCACCAACTGCTTAG, 5’GGATGCAGGGATGATGTTC)
følgende primerpar ble brukt for kvantifisering av mtDNA kopiere nummer totalt DNA (ekstrahert med fenol.: kloroform faseseparasjon):
ND1 plakater (5’CAGCCTGACCCATAGCCATA, 5’ATTCTCCTTCTGTCAGGTCGAA),
ACTB plakater (5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA, 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG). Sammen Ct metoden ble benyttet for å bestemme den relative overflod av gener av interesse eller mtDNA [29].
Western blotting analyse
Protein ekstrakter ble fremstilt fra quadriceps og gastrocnemius muskler som ble homogenisert med en håndholdt rotor (VWR) i PBS som inneholdt protease-inhibitor cocktail (Roche). Prøvene ble deretter hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret i -80 ° C inntil anvendelse. Ved bruk, ble homogenatene fortynnet 1:10 med RIPA-buffer (62,5 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% SDS, 1 mM EDTA, proteasehemmere og fosfatase-inhibitorer tilsatt ferskt) og lydbehandlet kort. Homogenater ble deretter sentrifugert ved 15 000 x g, og supernatanten ble oppsamlet. Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-analysen. Lik mengde protein ble applisert på en 4-20% SDS-polyacrylamid-gradientgel (BioRad). Gelen ble blottet på polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (BioRad).
Membranene ble blokkert i Odyssey blokkeringsløsning (LI-COR Biosciences) fortynnet 1:01 med PBS i en time ved romtemperatur. Primære antistoffer som ble brukt var OXPHOS gnager cocktail (Mitosciences), α-tubulin (Sigma), PGC1-α (Santa Cruz), SDHA (Mitosciences), β-aktin (Sigma), cytokrom
c plakater (Mitosciences), Porin (Mitosciences), og UQCRC1 (Mitosciences). Primært antistoff ble inkubert over natten ved 4 ° C. Sekundære antistoffer som ble brukt var enten infrarød konjugerte antistoffer anti-kanin-700 eller anti-mus-800 (Rockland) på produsent foreslo konsentrasjoner. Sekundære antistoffer ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Blot med infrarøde sekundære antistoffer ble visualisert med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap). Målingene optisk tetthet ble tatt ved hjelp av Gel-Pro Analyzer programvare.
Tredemølle
Endurance ble evaluert med en seks kjørefelt tredemølle med motivasjon rutenett beregnet for gnagere (Columbus Instruments). Dyrene ble gitt en treningsdag til å tilpasse seg utstyr og motivasjon rutenett. På testdagen, ble musene som kreves for å kjøre med en hastighet på 8 m /min i 5 minutter og antall fall på motivasjonen nettet ble registrert for hver mus.
Serum IL-6 Kvantifiseringen
blod ble tatt fra venstre ventrikkel dypt bedøvet mus før avlives. Blodet ble tillatt å koagulere på is, og serum ble isolert ved 1000 x g i en benketopp-sentrifuge (5424 Eppendorf) i 15 minutter ved 4 ° C. En ytterligere sentrifugeringstrinn av serumet ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C ble utført for fullstendig blodplate-fjerning. Serum ble brukt i BD cytometri perle rekke mus betennelse cytokin kit i henhold til produsentens instruksjoner (BD Biosciences). Prøvene ble analysert på en BD LSRFortessa celle analysator (BD Biosciences).
Statistical Analysis
Alle resultater ble uttrykt som betyr ± STDEV. Signifikans av forskjellene ble evaluert ved to-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni post-test for eksperimenter med mer enn 2 grupper eller ved uparet Student t-test mellom 2 grupper. Forskjeller ble betraktet som signifikant når p 0,05 (*), 0,001 p 0,01 (**), p. 0,001 (***)
Takk
Vi takker Dr. Bruce M. Spiegelman for å tilveiebringe transgene MCK-PGC-1α mus anvendt i denne studien.
