Abstract
Bakgrunn
pinnsvin (Hh) veien har vært innblandet i patogenesen av kreft inkludert pancreatic ductal adenokarsinom (PDAC). Nylige studier har antydet at det onkogene funksjon av Hh i PDAC innbefatter signalisering i de stromale celler i stedet for celleautonome effekter på tumorceller. Imidlertid opprinnelse og natur av stromal celletype (r) som reagerer på Hh signale forble ukjent. Siden Hh signalering spiller en avgjørende rolle under embryonal og barsel vaskulogenese, spekulerte vi at Hh ligand kan handle på tumorvaskulatur spesielt fokus på benmarg (BM) avledede celler.
Metodikk /hovedfunnene
Cyclopamine ble benyttet for å hemme Hh reaksjonsveien i humane PDAC cellelinjer og deres xenografter. BM transplantasjoner, ko-kultur systemer av tumorceller og BM-avledede pro-angiogene celler (BMPCs) ble anvendt for å vurdere rollen til tumor-avledede Hh i regulering av BM rommet, og bidraget fra BM-avledede celler til angiogenese i PDAC. Cyclopamine administrering dempes Hh signalisering i stroma i stedet for i kreftcellene som reflekteres av redusert ekspresjon av full lengde Gli2 protein og Gli1 mRNA spesifikt i kammeret. Cyclopamine hemmet veksten av xenografter PDAC i forbindelse med regresjon av tumor vaskulaturen og redusert homing av BM-avledede celler til tumoren. Host-avledet Ang-1 og IGF-1 mRNA nivåer ble nedregulert av cyclopamine i tumorxenotransplantater.
In vitro
co-kultur og Matrigel plug-analyser viste at PDAC celle-avledet Shh indusert Ang-1 og IGF-1 produksjon i BMPCs, noe som resulterer i deres forbedret migrasjon og kapillær morphogenesis aktivitet.
konklusjoner /Betydning
Vi identifiserte BMPCs som alternative stromal mål av Hh-ligand i PDAC tyder på at svulsten blodkar er en attraktiv terapeutisk mål av Hh blokade. Våre data er i samsvar med den nye konsept som BM-avledet celler gi viktige bidrag til epitelial tumorigenesis
Citation. Nakamura K, Sasajima J, Mizukami Y, Sugiyama Y, Yamazaki M, Fujii R, et al. (2010) Hedgehog Fremmer neovascularization i bukspyttkjertel kreft ved å regulere Ang-1 og IGF-1 Expression i benmarg Avledet Pro-angiogene Cells. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10,1371 /journal.pone.0008824
Redaktør: Sudha Agarwal, Ohio State University, USA
mottatt: 11 oktober 2009; Godkjent: 01.01.2010; Publisert: 21 januar 2010
Copyright: © 2010 Nakamura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning til YM fra New Energy and Industrial Technology Development Organization of Japan (07A05010a). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA og femte i Japan, og dens samlede fem års overlevelse er bare 5,0 til 9,7% [1], [ ,,,0],2]. Gemcitabin-basert kjemoterapi for lokalt avansert eller metastatisk PDAC har bare beskjeden aktivitet med en liten overlevelsesgevinst [3]. Identifisering av nye molekylære mål for PDAC for å overvinne den dystre prognosen er derfor nødvendig. Så langt, et utvalg av målrettet terapi mot EGFR [4], Ras /MEK [5] og VEGF [6] har ikke klart å forbedre overlevelse betydelig i kliniske studier.
Aberrant aktivering av pinnsvin (Hh) veien har mer nylig blitt anerkjent som en av de mediatorer av PDAC utvikling og anses derfor å være et lovende mål for terapi [7], [8]. Hh er en morfogen nødvendig for riktig mønster formasjon under embryogenese. Forhøyet uttrykk for Hh-relaterte proteiner, Sonic pinnsvin (Shh) eller indisk pinnsvin (Ihh), hemmer bukspyttkjertelen morphogenesis med økning i mesenchyme og avtar i epiteliale rommet [9], noe som indikerer at stram regulering av det generelle nivået av Hh aktivitet er avgjørende for normal bukspyttkjertelen utvikling. Siden Shh er feilekspriraert ikke bare i PDAC men også i forstadier bukspyttkjertelen intraepitelial svulst (Panin) [8] og intraductal papillær mucinkjertler neoplasi [10], feilregulering av denne veien kan spille en rolle i tidlige stadier av tumorigenesis. En rekke Hh-målgener, for eksempel BMP [11], FOXM1 [12], og PMP22 [13], er overuttrykt i PDAC, og det er krysstale mellom onkogene trasé inkludert MAPK /ERK, PI3K /Akt [14 ], Wnt [15], TGFfi /BMP [16] og Hh signalering. Blant de molekylene som deltar i Hh signalering, har glattet (Smo) blitt anerkjent som en viktig formidler av signal; Det er en av de reseptor-komponenter for Hh ligand og konverterer Gli2 inn i en transkripsjonen aktivator [17]. Således er Smo et spesielt lovende mål for anti-cancerterapi [18]. Cyclopamine, en naturlig steroid alkaloid, har sterke inhiberende virkninger mot Smo [18] og behandling med cyclopamine i den eksperimentelle omgivelser hemmer veksten av mange kreftformer [19], [20], [21]. Cyclopamine derivater med ulike strukturelle motiver har blitt generert og lovende for mulig klinisk bruk [22].
Spesielt har flere studier vist betydelig vekst hemming av PDAC
in vivo
av Hh vei blokade [ ,,,0],7], [23]. Den tumorvekst-inhiberende mekanisme har vært antatt å være i hovedsak mediert gjennom blokkerer en autokrin løkke som kan være nødvendig for proliferasjon [7], overlevelse [8] og motilitet [21] av kreftceller. Imidlertid ikke Smo delesjon i bukspyttkjertelen epitelet ikke svekker tumorgenese i en musemodell av PDAC [24], og Hh ligander fremkaller ikke transkripsjon reportere av veien i PDAC linjer. Videre transgen uttrykk for en aktivert Smo allel i bukspyttkjertelen epitel ikke klarer å indusere SMO sti målgener eller å indusere neoplastisk endring [25]. Følgelig har det vært spekulert i at Hh signalering kan spille en rolle i parakrin svulsten mikromiljøet, i epiteliale kreftformer som mangler mutasjoner i HH signalkomponenter. Faktisk har studier utført av oss og andre definerte avgjørende roller av kreftcelle avledet Hh på celletyper innen stromale tumor avdelinger [26], [27], [28]. Til tross for disse funnene, de nøyaktige mekanismer som enkelte kreftceller er ufølsomme for Hh inhibering og det stromale celletype (r) som reagerer på Hh signale forble ukjent. Vi har derfor foretatt undersøkelser for å belyse disse mekanismene.
Metoder
Cell Culture, Protein analyse og RNA analyse
Menneskelig PDAC cellelinjer ble oppnådd fra ATCC, helsefaglig forskning Resources Bank (Osaka, Japan) og Cell Ressurssenter for biokjemisk forskning (Sendai, Japan). BMMNC isolasjon, spredningsanalyser, co-kultur, migrasjon analyser, immunoblotting, og qPCR er beskrevet i Methods S1. Primer sekvenser er oppsummert i tabell S1.
Dyr, benmargstransplantasjon (BMT) og Immunohistochemistry
Medisinske studier med cyclopamine ble utført med nakne mus xenografter som beskrevet [7]. BMT prosedyrer er gitt i Methods S1. Protokoller for dyreforsøk ble godkjent av Asahikawa Medical Collage Institutional Animal Care og bruk komité.
Vev ble behandlet som rapportert tidligere [26]. Antistoffer og betingelser for immunhistokjemi er presentert i Methods S1.
Cellular, Molecular, og Statistiske analyser
Detaljerte beskrivelser av prosedyrer er gitt i Methods S1.
Resultater
in vivo
Effekter av Cyclopamine på KP-1N xenografter
for å belyse de mekanismer som Hh signale kan støtte tumorprogresjon i en svulst celle non-autonome mote, vi evaluert rollen som Hh signalering på vekst av PDAC
in vivo
. Vi valgte en cellelinje, KP-1N, som viste høy uttrykk for Shh men var ufølsom for veksthemming av cyclopamine
in vitro plakater (Figur S1, S2 og tabell S2). Behandling av KP-1 N-xenografter med cyclopamine daglig i 7 dager førte til en 46-prosent reduksjon i tumorvekt sammenlignet med vehikkel-kontroll-behandlede tumorer (figur 1A). Histopatologisk analyse viste at cyclopamine behandlede tumorer hadde tallrike områder av nekrose som resulterer i en 59% reduksjon i levedyktige tumorvekt. I tråd med disse funnene, farging for Ki-67 og TUNEL vist at cyclopamine behandling redusert spredning med 14% og økt celledød med 9%
in vivo plakater (figur 1B); i kontrast, var det ingen signifikant effekt av cyclopamine på spredning /celledød kinetikk
in vitro plakater (Figur S2).
(A) CD-en naken mus med KP-1N xenotransplantater ble behandlet med eller uten cyclopamine (50 mg /kg /dag; sc) daglig i 7 dager (10 xenoimplantater for hver gruppe). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM tumorvekt (mg). H-E stainings for xenograft seksjoner er vist og% nekrotisk område (N) ble målt. Skala barer; 200 um. (B) xenograft vev ble farget med anti-Ki-67 (Scale barer, 200 nm) og TUNEL assay (Scale barer, 500 nm) ble utført. Kvantifisering av prolifererende /apoptotisk er vist som prosent positive celler i 5 levedyktige felt fra 10 seksjoner. (C) RNA ble ekstrahert fra xenograft vev og mRNA nivåer for Ptch1 og Gli1 ble kvantifisert ved TaqMan qPCR.
For å finne ut hvilke celler ble påvirket av cyclopamine behandling, målte vi uttrykk for Ptch1 og Gli1 mRNA, transkripsjonelle målene for Hh signalering, både i xenopodet humane tumorceller så vel som mus stromal rommet. For å gjøre dette, har vi gjort bruk av artsspesifikke prober. Vi observerte at menneskelig Ptch1 og Gli1 i xenograft vev ble bare beskjedent redusert med cyclopamine behandling (figur 1C). ble observert sammenlignbare, mindre reduksjon i uttrykket
in vitro plakater (Figur S3). Til sammenligning, mus Ptch1 og Gli1 mRNA-nivåer viste en markert mer uttalt nedregulering, noe som indikerer at stromale celler som er viktige mål for Hh blokade. Sammen er disse resultatene indikerer at anti-tumor effekt av cyclopamine på xenograft vekst er først og fremst formidlet gjennom en nedregulering av Hh signalisering i tumor-assosiert stroma.
Effekter av Cyclopamine på tumorvaskulatur
blant de stromale komponenter i PDAC xenotransplantater, var vi spesielt å vite tumorvaskulatur, siden vi har demonstrert at BM-avledet pro-angiogene (precursor) celler reagerer på Hh ligand i løpet av neovaskularisering [26], [29]. Derfor, undersøkte vi effekten av cyclopamine på tumorvaskulatur i KP-1N xenografter. Farging for endotel-cellemarkør CD31 avslørte at mikrovaskulær tetthet var signifikant redusert (42,6%) når musene ble behandlet med cyclopamine (figur 2A). Den resulterende tumorvaskulatur ble smalere og fragmentert, og reduksjon i gjennomsnittlig kar området var dramatisk (64,8%). Hemming av angiogenese ved cyclopamine ble også observert i Suit-2 transplantater (figur S4).
(A) KP-1N xenografter behandlet med eller uten cyclopamine ble farget med CD31. Skala barer; 500 um. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM MVD og bety fartøy område. (B) Double immunfluorescens farging med α-glatt muskulatur aktin (SMA) med CD31 eller NG2 med CD31. Skala barer; 200 um. Antallet CD31
+ microvessels dekket med α-SMA eller NG2 positive pericytes vises.
Våre resultater antydet at blokaden av Hh signale «destabiliserer» svulsten fartøy. Vi ønsket å bekrefte denne hypotesen ved immunhistokjemisk farging for α-glatt muskel aktin (SMA), NG2, og CD31. SMA og NG2 uttrykkes ved pericytes, som er celler som tett forbinder med CD31-positive endotelceller for å stabilisere blodkarene [30], [31]. Vi observerte 50,0% eller 62,1% færre CD31
+ microvessels dekket med SMA
+ eller NG2
+ pericytes i cyclopamine behandlet tumorer (figur 2B). Dermed er Hh signale viktig for modning og /eller stabilisering av svulsten blodkar.
Tumor-avledet Hh Fremmer Innlemmelse av BM-avledede celler inn i neovaskulaturen
Benmargs (BM) avledede -celler antas å spille en rolle i tumorutvikling [32], [33]. For eksempel, har forskjellige typer av BM-avledet hematopoetiske celler er observert å nøye assosiere med tumor neovaskulatur [34], [35], og faktisk et lite antall BM-avledede stamceller som ble vist å innlemme inn i lumen av en vokser vaskulatur hvor de differensierer til endotelceller i en musemodell lungekreft [36]. Forskjellige faktorer i svulsten mikromiljøet kan modulere rekrutteringen av BM-avledede celler i løpet av utviklingen av tumorvaskulatur [37]. Derfor søkte vi å finne ut om Hh signalering bidrar til denne prosessen i PDAC. For å spore BM-avledet celler, implantert vi KP-1N transplantater i kimære mus med GFP-merket BM (GFP-benmargstransplantasjon modell, se Methods). Cyclopamine betydelig redusert rekruttering av BM-avledede celler i de xenotransplantater med 60% sammenlignet med kontrolltumorer (figur 3A).
(AD) GFP-BMT-kimære mus med KP-1N xenotransplantater ble behandlet med eller uten cyclopamine. Rekruttering av BM-avledede celler i tumoren ble sporet ved farging med anti-GFP (A). Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM av antallet av GFP
+ -celler. Scale barer; 100 um. KP-1N xenograft vev ble immunostained med Gli2 (B), CD31, VE-cadherin eller NG2 (C), i kombinasjon med GFP. Scale barer; 100 um. Vist er gjennomsnitt ± SEM av GFP
+ celler rekrutteres til CD31
+ kreft fartøy (
øvre panel
) og antall GFP
+ celler samlokalisert med CD31, VE-cadherin
+, og NG2 (
nedre panel
).
Blant Gli familie av transkripsjonsfaktorer, kontroll av nedbrytning av Gli2 og behandling i sitt repressor skjema definere Hh signale respons [38]. Gli2 proteinet blir prosessert og nedbrutt i fravær av Hh ligand, mens tilstedeværelse av Hh ligand fremmer Smo anrikning i primær cilia [39], noe som resulterer i nukleær translokasjon av full lengde, transkripsjonelt kompetent Gli2 protein [40]. Vi evaluerte derfor effekten av cyclopamine på Gli2 protein via immunofluorescensanalyse anvendelse av et antistoff mot hele lengden av formen Gli2 [41] (fig S5a). BM-avledede celler som uttrykker full lengde Gli2 protein og cyclopamine redusert både det absolutte antallet og den relative andel av Gli2 positive BM-avledede celler (figur 3B), noe som indikerer at Hh signalisering er aktivert i BM-avledede celler i en cyclopamine-sensitive (Smo -avhengig) måte. Ptch1 protein ble også observert i BM-avledede celler så vel som i kreftceller og cyclopamine redusert Ptch1 ekspresjon i stromal rommet (figur S5b). Vi klarte å demonstrere sterk Gli1 protein uttrykk i xenograft vev (data ikke vist).
I kontroll svulster, GFP-positive BM-avledet celler er nært forbundet med CD31
+ kreft fartøy, men de er ikke innlemmet i lumen av vasculatures (Figur 3C). På den annen side, en undergruppe av BM-avledede celler co-uttrykte VE-cadherin demonstrerer at BM-avledede celler som ikke bare er rekruttert til peri-vaskulære området, men også gir opphav direkte til tumoren endotel. Den NG2 proteoglycan er uttrykt ved begynnende pericytes i løpet av de tidlige stadier av angiogenese, og en undergruppe av BM-avledede celler i xenografttumorer co-uttrykt NG2. Disse resultatene indikerer at BM-avledede celler som bidrar til utvikling av tumorvaskulatur ikke bare ved å gi opphav til bestemt type celler, men også ved å assosiere på forskjellige måter. Av notatet, cyclopamine behandling betydelig redusert integrering av GFP
+ BM-avledet pro-angiogenic celler (BMPCs) til CD31
+, VE-cadherin
+, eller NG2
+ kreft vasculatures. Vi har bekreftet at BMPCs var mottakelig for Hh siden
in vitro
ko-kulturer med KP-1N tumorceller resulterte i en cyclopamine-sensitive induksjon av Gli1 /Ptch1 mRNA i BMPCs, men ikke i den modne endotel-cellelinjen MS -1 (figur S6 og data ikke vist). Tatt sammen indikerer disse resultatene at Hh veien spiller en rolle ved neovaskularisering ved å modulere inkorporering av BM-avledet pro-angiogene (forløper) celler inn i tumorkarene.
tumor-avledet Hh fremmer migrering av BM- avledet Pro-angiogene Cells
In vitro Hotell og
In Vivo
Vi spekulert at redusert antall BM-deriverte celler i cyclopamine behandlet svulster kan være et resultat av dempet mobilisering av celler fra BM. Imidlertid er antallet av sirkulerende BMPCs, som målt ved merking dyrkede perifere blod MNCer med acLDL /isolectin B4 [42], ble ikke signifikant redusert i nærvær av cyclopamine (figur S6). Dette funnet antyder at Hh kan direkte regulere rekruttering, differensiering, eller migrasjon av forløpere for BMPCs i svulsten mikromiljøet i stedet for å påvirke mobilisering av forløperne fra margen.
Siden hemming av Hh signalering ikke påvirker mobilisering av BMPCs, søkte vi å undersøke mekanismer som Hh signale kan forbedre deres innlemmelse i tumor blodkar. For å gjøre dette, undersøkte vi effekten av Hh signalering på migrasjon av forløperne. Vandringen av BMPCs gjennom en transwell membran
in vitro
ble målt i nærvær av KP-1N i den nedre brønnen. Helstøpt BMMNCs uttrykker c-Kit, CD11b og VE-cadherin ble benyttet som forløpere for BMPCs (figur S6). Nummeret til den BMPCs migrere til den nedre side av membranen ble signifikant øket når ko-dyrket med KP-1N sammenlignet med de pro-angiogene celler uten KP-1N, noe som tyder på at utskilling av faktorer fra de PDAC cellene kan øke migreringen av forløpere (figur 4A). I samsvar med en rolle for Hh-Smo vei, prekondisjonering den BMPCs med cyclopamine dramatisk redusert sin evne til å migrere på en doseavhengig måte (figur 4A). For å direkte ta rollen som Smo avhengig signale i BM-avledet pro-angiogenic celler, brukte vi BM celler infisert med en shRNA lentivirus målretting Smo (figur 4B). Undertrykkelse av Smo betydelig svekket deres migrasjon til KP-1N tumorceller. Rollen av tumor-avledede Shh i migrering av forløperne ble også bekreftet ved hjelp av en Shh nøytraliserende antistoff (figur 4C).
(A-B) Migrering av BM-avledede pre-angiogene celler (BMPCs) ble vurdert. BMMNCs dyrket i EGM2-MV medium i 4 dager og festede celler ble sådd ut på transwell (5 um pore) belagt med 0,1% gelatin, og KP-1N-celler ble sådd ut i den nedre brønnen. Antallet migrerte celler i den nedre side av membranen ble kvantifisert ved DAPI farging etter 18 timers inkubering. De BMPCs ble forbehandlet med Cyclopamine (A), shRNA lentivirus for Smo (B), og anti-Shh og /eller anti-VEGF-nøytraliserende antistoff (C) når sådd ut på brønnen. For en positiv kontroll, ble human VEGF (50 ng /ml) tilsatt til den nedre brønnen, og de BMPCs ble dyrket alene som en negativ kontroll.
For å belyse virkningen av Smo pathway modulasjon om migrasjon av BMPCs
in vivo
, utførte vi Matrigel plug analyser. Når konsentrert supernatant fra KP-1N-celler blandet med matrigel ble implantert subkutant i nakne mus, ble antallet av vertsceller som migrerer inn i matrigel betydelig økt, og cellene dannet en snor-lignende struktur, etterligne kapillær morfogenese
in vivo
(figur 5A). For å skille BM-avledede celler fra andre stromale celler, ble forsøket gjentatt ved å benytte andre kimære mus som gjennomgikk BMT. Siden vi observerte signifikant Tie2-mRNA-ekspresjon i BM-avledede pro-angiogene celler benyttes i
in vitro assays
(data ikke vist), Tie2 /LacZ-mus ble anvendt som donor for det BMT [42]. En stor andel av cellene i matrigel stammer fra BM som reflekteres av positiv farging for β-gal (figur 5B). Vandringen av vertsceller i matrigel plugger ble svekket betydelig når cyclopamine ble tilsatt til matrigel. Et lignende resultat ble også oppnådd ved anvendelse av et anti-Shh antistoff (data ikke vist).
Matrigel plugg-analysen benytter Tie2 /LacZ-BMT kimære nakne mus. Vekstfaktor redusert matrigel blandet med konsentrert kondisjonert medium fra KP-1N (CM
KP-1N) ble transplantert inn i kimære mus. I eksperimentelle grupper, matrigel var også blandet med cyclopamine. (A) Capillary morfogenese i matrigel ble kvantifisert med antall forgreningspunkter på H-E seksjoner. (B) Matrigel ble immunostained med β-gal. Vist er gjennomsnitt ± SEM av β-gal-positive celler.
Samlet våre resultater viser at inhibering av tumor-avledede Hh signalisering fører til hemning av tumor angiogenese og destabilisering av blodkar med en samtidig reduksjon i rekruttering av BMPCs inn i svulsten stroma.
Regulering av Pro- og antiangiogen Faktorer av Hh Signa
å identifisere molekylære grunnlaget for vaskulære forstyrrelser av Hh blokade, vi kvantifisert mRNA uttrykk nivåer av pro- og anti-angiogene faktorer i PDAC xenografter ved hjelp av artsspesifikke primer /probe sett for qPCR. Spesielt var vi glad i å vite nivåene av VEGF og SDF-1, som er ansett pro-angiogene faktorer på grunn av deres demonstrert effekt på rekruttering og oppbevaring av de pro-angiogene forloperceller tumor dannelse [34], [ ,,,0],43].
Vi har funnet at menneskelig VEGF og SDF-1 mRNA ekspresjon ble redusert med 31% og 33%, henholdsvis i cyclopamine-behandlede tumorer (figur S7). Disse resultater er i motsetning til den beskjedne nedregulering av VEGF og SDF-1 mRNA i cyclopamine-behandlede KP-1N-celler
in vitro
, enten i normoksisk eller hypoksiske betingelser (figur S8). Likeledes HIF-1α stabilitet ble ikke påvirket i henhold hypoksiske betingelser
in vitro
. Videre blokkerer Shh av nøytraliserende antistoff ikke føre til en reduksjon i VEGF mRNA i KP-1N celler, noe som tyder på at autokrint Shh signale ikke formidle en angiogen fenotype direkte på KP-1N (figur S8). I stedet disse kollektive resultatene tyder på at Hh signalering støter mot den stroma og at stromal-avledet faktorer kan bidra til ekspresjonen av VEGF og SDF-1 i tumorcellene
in vivo
.
Det er blitt vist at kreft forbundet fibroblaster utskiller SDF-1 for å rekruttere benmarg-avledede endoteliale forløperceller inn i tumoren stroma for å formidle angiogenese [44]. Derfor vi neste kvantifisert uttrykk for disse pro- /anti-angiogene faktorer ved murine tumor stroma. Mus VEGF og SDF-1-nivå ble ikke påvirket av cyclopamine
in vivo plakater (Figur 6A), noe som indikerer at Hh ikke er involvert i modulering av disse pro-angiogene faktorer ved tumor stroma.
(A) mRNA-uttrykk for muse-pro- /anti-angiogene faktorer i xenotransplantater ble kvantifisert ved qPCR. (B, C) Co-kultur-analyse, under anvendelse av trenswell. BM-avledet pro-angiogenic celler (BMPCs) ble infisert med et lentivirus uttrykker kontroll shRNA eller Smo shRNA og co-kultur med KP-1N celler seeded på transwell (0,4 mikrometer). RNA ble høstet fra BMPCs 12 timer etter for qPCR (normalisert til cellene uten KP-1 N). (D) undergrunnsformasjons Assayet ble utført ved dyrking av MS-en på matrigel i nærvær eller fravær av GFP-merket BMPCs. Capillary morfogenese ble observert etter 8 timers inkubering med eller uten anti-IGF-1-nøytraliserende antistoff. Scale bar, 500 mikrometer. Antall avdelings poeng og inkorporering av BMPCs i røret ble kvantifisert.
Vi neste undersøkt uttrykk for faktorer som modulerer vaskulær stabilitet. I de tumorer cyclopamine-behandlede mus, er angitt vi en markert reduksjon i murine Ang-1, IGF-1 og PDGF-B mRNA, faktorer som er kjent for å stabilisere neovaskulatur. Ang-1 spiller en avgjørende rolle i angiogenese for å stabilisere neovessels [30], og dens beslektede Tie2-reseptor uttrykkes i ECS, pro-angiogene monocytter, så vel som forløpere for pericyte mesenchymal opprinnelse [45]. Reduksjonen av Ang-1 ble kombinert med 86,3% oppregulering av Ang-2, en naturlig antagonist for Tie2, som fører til dissosiasjon av vegg cellen belegg for å sette i gang angiogenese [46] (fig S9). I et forsøk på å forstå reguleringen av disse faktorene av Hh signalering, vi sammenlignet deres mRNA nivåer i BMPCs som var co-kultivert med KP-1N celler. Ang-1 og IGF-1, men ikke PEDF-B mRNA ble oppregulert ved mer enn to ganger i en cyclopamine-sensitiv måte (figur 6B), og samtidig nedregulering av Ang-2-mRNA i forløperne ble observert. Den endrede uttrykk for Ang-en og Ang-2 ble avbrutt av cyclopamine, og effekten på Ang-1 /Ang-2-forholdet var dramatisk (54,3% reduksjon; Figur S9). Konsistente resultater ble observert når vi målrettet Smo i BM-avledet forløpere av lentiviral shRNA, bekrefter at endring av Ang-en genekspresjon av cyclopamine skyldes blokade av Smo-avhengige veien (figur 6C). Dermed Hh-avhengig Ang-1 /Tie2 signale ser ut til å være en av de potensielle mekanismer som BMPCs stabiliserer neovessels.
IGF-1 er et mål av Hh Signa i BM-avledet Pro-angiogene Cells
Reduksjon i IGF-1 mRNA som vi observerte i cyclopamine behandlet xenografter (figur 6A) ble også rekapitulert i co-kultur analyser; det vil si, ble sterk induksjon av IGF-1 i BMPCs ved KP-1N-avledede faktorer blokkert betydelig enten ved cyclopamine eller shRNA mot Smo (figur 6B, C). For å bekrefte rollen som IGF-1 i løpet av neovaskularisering, ble en tube-analysen utføres ved hjelp av MS-1 (mus moden EC linje) med GFP-merket BM-avledet pro-angiogene forløpere (Figur 6D). Kapillær morfogenese av MS-en ble indusert ved BMPCs, og effekten ble forbedret når de ble forbehandlet i nærvær av KP-1N celler. Påfallende, effekten på kapillære dannelsen ble signifikant redusert etter behandling med et anti-IGF-1-nøytraliserende antistoff. Dermed IGF-1 er et viktig mål for Hh signalisering i BM-deriverte celler, og nedregulering av IGF-1 i tumorxenotransplantater av cyclopamine behandling kan bidra til avbrudd av angiogenese.
Diskusjoner
i denne studien har vi identifisert de BM-avledet pro-angiogenic celler (BMPCs) som en av de parakrine målene for Hh, som spiller en avgjørende rolle for å fremme tumor angiogenese og tumorprogresjon. Den destabilisert tumorvaskulatur at vi observert på cyclopamine behandling først føre oss å spekulere i at vi kan observere en reduksjon i stromal Ang-1 og IGF-1, faktorer som er kjent for å være regulert av Hh vei [47], [48].
Ang-en utvikler og stabiliserer primitive blodkar i henhold Hh signalisering i lunge forgrening morphogenesis [49] og Shh økte mRNA nivåer av Ang-1 i fibroblaster, men redusert Ang-2 [47], [50]. Våre co-kulturen eksperiment demonstrerte Ang-1 mRNA i BMPCs ble oppregulert etter løselige faktorer fra KP-1N i en Smo avhengig måte, hvilket antyder en rolle av forløperne som reservoar av Ang-1 i tumoren mikromiljøet for å stabilisere Tie2-uttrykk ECS samt undergrupper av pro-angiogene celler. Faktisk en viss brøkdel av BM-avledet celler også uttrykker Tie-2 reseptor [51], som støtter en alternativ autokrin eller parakrint effekt på deres angiogen aktivitet av omkringliggende stroma via Ang-en ligand.
Det er en rekke cellulære kilder av IGF-1 i tumoren stroma, og reduksjonen i stroma-avledet IGF-1 som vi observerte kan forklare vekstinhibering av PDAC celler
in vivo
da Hh signale ble blokkert [27]. IGF-1 kan også øke aktiviteten av BM-avledede celler for å fremme neovaskularisering gjennom PI3K /Akt signalering [52]. I denne studien ble forbedring av kapillær morphogenesis av MS-1 celler ved de BMPCs stimulert med PDAC celler klart svekket av anti-IGF-1 (figur 5D). Således synes IGF-1 må være en av de viktige målene for Hh signalering i BMPCs og medierer dens virkning på neovaskularisering. Det var en betydelig reduksjon i PDGF-B uttrykk i svulsten stroma
in vivo
samt i BMPCs
in vitro
; Men vår ko-kultur analysen av BMPCs med KP-1N ikke demonstrere oppregulering av PDGF-B mRNA, noe som antyder at kreft-avledet Hh ligand er usannsynlig å spille en vesentlig rolle i induksjon av PDGF-B. Men nedregulering av PDGF-B av cyclopamine kan delvis forklare den reduserte rekrutteringen av pericytes i nydannede vaskulære nettverket i xenografter.
De molekylære mekanismene som vi avdekket her viser tydelig at Hh signale spiller en parakrint rolle i tumorprogresjon. Det ble nylig rapportert at transkripsjonen induksjon av Gli kan opprettholdes uavhengig av Smo [24], og den ikke-kanonisk regulering av Gli-målgener medieres delvis gjennom TGF-β og Kras signalering. Faktisk har de fleste PDAC celler, innbefattende KP-1N, uttrykker onkogene Kras og det har blitt vist at TGF-β-Smad veien aktiveres i KP-1N-celler [53]. Disse banene kan forklare den beskjedne reduksjon av Gli1 transkripsjon av cyclopamine at vi har observert. Det er også mulig at
in vivo
veksthemming av Hh blokaden som vi har observert kan være formidlet gjennom en effekt på selvfornyelse tilhører sjeldne PDAC initiere celler [54]. Imidlertid var signifikant endring i spredning /død-kinetikk som vi har observert i en stor andel av kreftceller i xenotransplantater ble behandlet med cyclopaminewas klart ledsaget av en hemming av angiogenese.
Cyclopamine dempes ikke bare rekrutteringen av BM-avledet celler til tumoren, men også deres innlemmelse i tumorvaskulaturen, som støtter en involvering av Hh i den tumor-assosiert angiogenese. Våre data støtter ikke tanken om at autokrint signalisering av Hh i kreftceller bidrar til tumor angiogenese, og heller foreslå at Hh fungerer utelukkende på stroma. Shh er blitt vist å direkte kontrollere aktiviteten av BMPCs celler ved å stimulere deres proliferasjon, migrering og indusering av angiogene faktorer for å fremme vaskulær remodellering [26], [29], [55]. Vi demonstrerte at faktorer utskilt av PDAC celler kan øke migreringen av forløpercellene i det minste delvis i en Smo avhengig måte. Det var en ekstra effekt av Hh signale på EC forsamlingen gjennom en aktivering av BMPCs sammen med spirende moden egenkapitalbevis. Vi har tidligere vist at Shh kan øke aktiviteten av forløperne for å fremme kapillær morfogenese av HUVEC [26].
