Abstract
Karakteriseringen av kreft stamcelle (CSC) undergruppe, gjennom sammenligning av genekspresjon signatur i forhold til de native kreftceller, er særlig viktig for identifisering av nye og mer effektive anticancer strategier . Men CSC har særegne egenskaper i form av vedheft, vekst og metabolisme som muligens innebærer en annen modulering av uttrykket av de mest brukte housekeeping gener (OSL), som b-aktin (ACTB). Selv om det er viktig å identifisere hvilke som er de mest stabile HKG gener å normalisere data fra kvantitative Real-Time PCR-analyse for å oppnå robuste og konsistente resultater, mangler fortsatt en uttømmende validering av referansegener i CSC. Her, isolerte vi CSC kuler fra forskjellige muskel- og sarkomer og karsinomer som en modell for å undersøke på stabiliteten av mRNA-ekspresjon av 15 vanlig brukte HKG, i forhold til de opprinnelige cellene. De utvalgte gener ble analysert for variasjonskoeffisient og sammenlignet med populære algoritmer NormFinder og geNorm å vurdere stabiliteten klassifisering. Som et resultat, har vi funnet at: 1) Tata bindende protein (TBP), Tyrosin 3-monooksygenase /tryptofan 5-monooksygenase aktiveringsprotein zeta polypeptid (YWHAZ), Peptidylprolyl isomerase A (PPIA), og Hydroxymethylbilane syntase (HMBS) er de mest stabil HKG for sammenligningen mellom CSC og innfødte celler; 2) minst fire referansegener bør vurderes for robuste resultater; 3) bruk av ACTB ikke bør anbefales, 4) som er spesifikke HKG bør vurderes for studier som har fokusert bare på en bestemt tumortype, som sarkom eller karsinom. Våre resultater bør tas i betraktning for alle studier av genuttrykk analyse av CSC, og vil vesentlig bidra for fremtidige undersøkelser rettet til å identifisere romanen kreftbehandling basert på CSC målretting
Citation. Lemma S, Avnet S, Salerno M, Chano T, Baldini N (2016) Identifisering og validering av Housekeeping Gener for Gene Expression Analysis of Cancer stamceller. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10,1371 /journal.pone.0149481
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 20 oktober 2015; Godkjent: 01.02.2016; Publisert: 19 februar 2016
Copyright: © 2016 Lemma et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet (FIRB RBAP10447J til NB) fra den italienske utdanningsdepartementet, universitet og forskningsdepartementet, av den italienske foreningen for Cancer Research ( AIRC IG11426 til NB), og av den italienske Ministry of Health, økonomisk støtte for Scientific Research «5 promille 2012» (NB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ulike populasjoner av celler danner ondartede svulster. Innenfor gitte normalt vev, bor en undergruppe av stamceller med evnene til selvfornyelse og differensiering i spesialiserte celler. På lignende måte er en svulst som består av en heterogen populasjon av maligne celler, med distinkte graden av differensiering, proliferasjon og karsinogent potensial. Blant slike heterogene maligne celler, er kreft stamceller (CSC) som er nevnt som en liten, men distinkt populasjon av elementet i tumormasse som er primært involvert i trinnene med initiering, transformasjon og påfølgende progresjon av tumoren [1]. CSC modell hevder at, som stamceller fra normale vev, tumorceller følge hierarkiske organisasjoner hvori CSC som ligger ved apex holde kapasiteten for tumorigenesis [2], metastase fremming [3-5], og motstand mot kjemoterapi eller radioterapi [6 -8]. Denne tumor-initiere cellepopulasjon ble isolert og karakterisert for første gang i human myeloid leukemi [9,10], og deretter også i andre solide tumorer [11-13]. Den mest brukte assay for isolering av CSC er sfæren dannende analyse, og er basert på evnen til CSC til å vokse i forankringsuavhengig betingelser og til å danne flytende kolonier [12], den såkalte «kuler». Tidligere isolert vi CSC kuler fra menneskelige muskel- sarkomer [14-16], og i denne studien har vi også isolert CSC fra ulike karsinom. Mens Kreftsvulster er vanlige voksne maligniteter som viser høy metastatisk indeksen ved diagnose og omfattende sykelighet [7, 12], muskel- og sarkomer er heterogene, relativt sjeldne, og svært aggressive maligniteter av bein og bløtvev som ofte forekommer hos barn og unge voksne [17] . Den høye frekvensen av tilbakefall typisk for disse svulster påvirker dramatisk klinisk resultat og, til tross for kirurgi kan være helbredende, svulst prognose fortsatt dårlig. Derfor er dagens terapeutiske tilnærminger er ikke tilstrekkelig til å forbedre det kliniske resultatet, og ytterligere forbedringer kan stamme fra bare en bedre forståelse av molekylære mekanismer for disse sykdommene, og fra identifisering av spesifikke markører som definitivt skiller CSC fra andre tumorceller. Dermed under denne sammenheng,
in vitro
isolering av kuler gir et uvurderlig verktøy.
Kvantitativ Real-Time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) er den mest sensitive og nøyaktig metode for å kvantifisere mRNA ekspresjon av et enkelt gen i forskjellige eksperimentelle betingelser, og krever normalisering av data mot en referanse-genet, som typisk må ha en meget stabil ekspresjon under de forskjellige betraktes eksperimentelle prosedyrer [18]. Identifisering av spesifikke husholdningsgener (HKG) er en dreibar forutsetning for å studere den relative endringen i mRNA-ekspresjon av et målgen. Den valgte HKG bør ikke være co-regulert med målet genet eller påvirket av den eksperimentelle prosedyren. Det bør også uttrykkes i overflod og har minimal variasjon. Den vanligste metoden for å normal genuttrykk nivåer er å sammenligne mRNA nivåer av genet av interesse for den endogene kontroll genet. Normalisering av QRT-PCR-data mot tilfeldig HKG kan resultere i feilaktig beregning av normaliseringsfaktor anvendt for å sammenligne forsøksbetingelsene, og derfor skjule biologiske forskjeller mellom prøvene [19]. Blant forskjellige referansegener, beta-aktin, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase, eller beta-Tubulin er de mest brukte, da de er sterkt uttrykt, er nødvendig for overlevelse, ikke-regulert av signalveier, og blir syntetisert i alle kjerneholdige celletyper . Men nyere funn viste at selv beta-Actin, en av de mest brukte HKG, kan være en uegnet internkontroll [20,21].
QRT-PCR analyser av CSC allerede er utført, men for vi kjenner til, er ingen begrunnelse for valg av HKG fortsatt tilgjengelig. I denne studien valgt vi 15 av de mest brukte HKG for å evaluere deres stabilitet i både CSC og adherente tilpassede celler isolert fra human rhabdomyosarcoma (RS), osteosarkom (OS), Ewings sarkom (ES), brystkarsinom (BC) og renal karsinom (RC). Gjennom sammenligning av koeffisienten variasjon og bruken av geNorm [22] og NormFinder [23] programvare vi utført en gyldig, reproduserbar, og komparativ analyse av stabiliteten til den valgte HKG.
Materialer og Metoder
Native tumorcellelinjer og CSC kulturer
RS-cellelinje (RD), OS-cellelinjer (MG-63, HOS, Saos-2), ES-cellelinje (A-673), BC celle linje (MDA-MB-231) og RC-cellelinje (ACHN), ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM, Gibco), pluss 20 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) (komplett IMDM) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. En human primær ES kultur (ES4540) ble også anvendt, og ble oppnådd fra en frisk biopsi av humane ES, og karakterisert som tidligere beskrevet [16]. Den ES4540 Prøven ble samlet etter en signert informert samtykke og etter godkjenning av Istituto Ortopedico Rizzoli etisk komité (0033626, 09.11.2011), i henhold til Helsinkideklarasjonen. Kort sagt ble vevsprøver utsettes for mekanisk hakking, etterfulgt av enzymatisk nedbrytning, for å oppnå enkeltceller som ble sådd ut i fullstendig IMDM inntil dannelsen av et monolag.
CSC-celler ble oppnådd som tidligere beskrevet [16]. Kort sagt ble alle opprinnelig tumorcellekulturer holdes i forankringsuavhengig tilstander i DMEM: F12-medium med progesteron (20 nM), putrescin (10 mg /ml), natriumselenitt (30 nM), apo-transferrin (100 ug /ml) og insulin (25 ug /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i lav-feste kolber (Nunc, Penfield, New York) (sfære dannende analyse). Vi fikk CSC kulturen ved å opprettholde spheroid i forankringsuavhengig forhold i bestemt celle media, og legger til vekstfaktorene EGF og bFGF hver 3-4 dager (to ganger i uke). Frisk human EGF (20 ng /ml) og bFGF (10 ng /ml) (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ble tilsatt to ganger i uken inntil cellene begynte å vokse som flytende aggregater (kuler). Sfæroide kulturer ble amplifisert ved å behandle den primære CSC kultur med trypsin, etterfulgt av mild mekanisk dissosiasjon, og ved re-utplating enkeltcellesuspensjon for å oppnå den andre sfæroide kulturen. Levedyktighet ble verifisert av erythrosine farging. Andelen av døde celler var lav (10-15% av døde celler). Bare de kulturene som var i stand til å danne kuler og som uttrykte stamcellerelaterte markører ble vurdert.
Illumina genom analysator sekvensering og dataanalyse
En dyp sekvensering analyse av MG-63, HOS, og Saos-2 OS cellemodeller ble utført for å sammenligne den globale transkripsjonen ekspresjon av CSC til de respektive opprinnelige cellene, for å velge et panel av stabil HKG for QRT-PCR-analyse. I korthet, ble total RNA samlet fra cellelysatet i syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform [24]. Den totale RNA ble kvantifisert ved Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) etter produsentens anvisninger. RIN (RNA Integrity Number) og A260 /A280-forhold på den fremstilte totalt RNA var 10, og over 1,8, respektivt. Biblioteket i templatmolekyler for høy gjennomstrømming DNA-sekvensering ble konvertert fra total RNA ved hjelp TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA), etter produsentens protokoll. Biblioteket ble også kvantifisert med Bioanalyzer (Agilent), etter produsentens anvisninger. Biblioteket (19:00) ble utsatt for klase forsterkning på ett Les Flow Cell v4 med en klynge generasjon instrument (Illumina). Sekvensering ble utført på en Genome Analyzer GAIIx for 70 sykluser ved hjelp Cycle Sequencing v4 regenter (Illumina). Menneskelige genom build 19 (hg19) ble lastet ned fra University of California, Santa Cruz genom nettleser (https://genome.ucsc.edu/). Bildeanalyse og basen kall ble utført ved hjelp av off-line Basecaller Software 1.6 (Illumina). Leser ble justert ved hjelp ELAND v2 av casava Software 1.7 med sekvens datasett. Transkriptet dekning for hvert gen locus ble beregnet fra det totale antall som passerer filteret lesninger som kartlegges, ved ELAND-RNA, til eksoner. Disse analysene ble utført ved anvendelse av standardparameterne. Dataene ble sett ved hjelp av Genome Studio programvare (Illumina). Den avanserte analyser for kvantifisering med quantile normalisering algoritmen ble utført ved hjelp Avadis NGS programvare (version1.5, Strand Scientific Intelligence Inc., San Francisco, California).
RNA isolering og cDNA syntese
Total RNA ble ekstrahert fra CSC og innfødte celler fra alle de forskjellige histotypes inkludert i studien ved hjelp av NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland). On-kolonne DNase fordøyelsen ble utført etter produsentens anvisninger. Den totale RNA renhet ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Nanodrop Technologies). Total RNA (0,5 pg) ble revers-transkribert til cDNA i 20 ul sluttvolum, ved hjelp av MuLV revers transkriptase, og RNase inhibitor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Første cDNA ble syntetisert ved hjelp av tilfeldige heksamer. For hver prøve ble 3 biologiske replikater behandlet.
QRT-PCR
QRT-PCR ble utført ved hjelp av en lys sykler instrument og Universal Probe Bibliotek system (Roche Applied Science, Monza ). Probe og primere ble valgt ved hjelp av en web-basert analysen design software (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), og ble ytterligere kontrolleres ved hjelp Oligo Primer Analysis Software. Bare primere som spenner over et ekson-exon krysset og produsere en PCR amplificate med lengde mellom 70 og 150 basepar ble valgt. Alle primere designet ble analysert ved BLAST å bekrefte sin spesifisitet (National Center for Biotechnology Information). Alt cDNA ble fortynnet 1:10, og 10 ul ble anvendt som templat og som inngår i en 20 pl totalt volum på QRT-PCR-reaksjonen. Protokollen for forsterkning var: 95 ° C i 10 min; 95 ° C i 10 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 1 s i 45 sykluser; 40 ° C i 30 sek. Hver analyse inkluderte en blank. Tabell 1 gir en oppsummering av alle HKG, primer sekvenser og prober som er inkludert i denne studien. For evalueringen av ekspresjon av c-Myc (NM_002467.4), KLF4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) og OCT3 /4 (NM_002701.4), de følgende primere anvendt: c-Myc-F 5′-gctgcttagacgctggattt-3 «, c-Myc-R 5′-taacgttgaggggcatcg-3′, sonden 66; KLF4-F 5»-ccatctttctccacgttcg-3 «, KLF4-R 5′-agtcgcttcatgtgggagag-3′, probe 7 ;. Nanog-F 5»-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 «, Nanog-R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3, sonden 69; OCT3 /4-F 5»-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 «, OCT3 /4-R 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3», probe 60. For formålet med normalisering, er den relative ekspresjon av KLF4, c-Myc, Nanog og OCT3 /4 ble normalisert ved referansen genet ACTB eller for den geometriske gjennomsnittet av YWHAZ og GAPDH for CSC og innfødte celler fra MG-63, eller for den geometriske gjennomsnittet av PPIA og HMBS for CSC og innfødte celler fra ACHN og MDA-MB-231. Den relative uttrykk for stamcellemarkører ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt modell [25].
NormFinder analyse
NormFinder programmet er et VBA-applet [23] ut fra avvik estimering tilnærming , som rangerer kandidaten HKG basert på deres stabilitet evaluering, og tildeler en stabilitet verdi til hver kandidat gen ved hjelp av en modellbasert tilnærming. Etter avtale med NormFinder krav ble Ct verdier forvandlet i relative mengden ved å bruke laveste Ct verdi som kalibrator. Ifølge analysen, ble den laveste stabilitet verdien topp rangert. Vi gruppert alle data i 3 forskjellige grupper: 1) alle data fra CSC forskjellige svulster; 2) alle data fra innfødte celler av ulike svulster; 3) alle data fra forskjellige svulster med CSC og innfødte celler samles sammen. For den tredje gruppen av data, i tillegg til CSC og innfødte celler hentet fra alle svulster sammenslåtte sammen, vi også vurdert CSC og innfødte celler hentet fra den eneste tumor type, fra sarkom eller fra carcinoma. Alle resultater ble oppnådd fra 3 sett med gjentak
GeNorm analyse
GeNorm v 3.0 [22] tilgjengelig i qbase + [26] (Biogazelle, Ghent University, Belgia, http:.. //Www .qbaseplus.com) ble anvendt for å vurdere stabiliteten av kandidaten HKG. GeNorm beregner alle mulige gjennomsnittlige parvis variasjon mellom de kandidatgener og tilveiebringer et mål av uttrykket stabilitet (M) av hvert gen. En M-verdi under 1,5 indikerer stabil HKG. Kandidaten referansen genet med lavest M verdi ble ansett for å ha den mest stabile uttrykk. GeNorm rangerer kandidatreferansegener på grunnlag av deres stabilitet av ekspresjon, og utføre trinnvis utelukkelse av genet med høyest M-verdien (den minst stabile uttrykte genet), og beregner M-verdier for de gjenværende gener. Vi bruker også GeNorm å kontrollere om en enkelt HKG er tilstrekkelig for en tilstrekkelig normalisering. Faktisk gir GeNorm det optimale antall referanse gener som er nødvendige for nøyaktig normalisering. V verdier under cut-off-verdi 0,15 indikert det optimale antall gener som kreves for data normalisering. I likhet med analysen utført med NormFinder, gruppert vi alle dataene og resultatene i 3 ulike klynger. Alle resultater ble oppnådd fra 3 sett av replikater.
variasjonskoeffisient analyse
Genekspresjon stabilitet evaluert ved variasjonskoeffisienten (CV) ble beregnet ved å dividere den standardavvik (SD) av terskel sykluser (Ct) ved den midlere Ct-verdien. Som i analysen utført med NormFinder og GeNorm, gruppert vi alle data i 3 forskjellige grupper, og resultatene ble oppnådd fra 3 sett med replikater.
Rank aggregering
Analysene utført av tre beskrevne metoder viste noen forskjeller i stabilitet rang av HKG. Derfor har vi identifisert de mest stabile gener ved å vurdere den laveste verdien av matematisk gjennomsnitt av NormFinder, geNorm og CV metode rangerer for hvert enkelt gen.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med Statview ™ 5.0.1 programvare (SAS Institute Inc., Cary, NC). For karakterisering av CSC og tilpassede celler fra MG-63, MDA-MB-231 og ACHN, ble data ansett som normalt ikke er fordelt, og parametriske Mann-Whitney U-test ble anvendt. Resultatene ble rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Standardavvik (SD) av delta Cycle terskel (ΔCt) verdier ble beregnet som samlet standardavvik (SDpooled). HKG uttrykk variasjon i CSC og innfødte celler ble evaluert med sammenkoblede Wilcoxon signed-rank test. For alle analysene, ble forskjeller betraktet som signifikant med en
p-
verdier ≤ 0,05.
Resultater
RNA kvalitetskontroll og karakterisering av CSC
etablert sfære kulturer fra kommersielt tilgjengelige cellelinjer fra 3 forskjellige sarkom og 2 karsinom histotypes (MG-63 for OS, RD for RS, A-673 for ES, MDA-MB-23 for BC, og ACHN for RC), og fra en fersk ES biopsi (ES4540). Den spektrofotometrisk analyse bekreftet renheten av prøvene, med en A
260 /
280-forhold på 2,08 ± 0,06, hvilket indikerer proteinfritt ren RNA, og en A
260/230-forhold på 1,98 ± 0,21, indikerer at det totale RNA ble fenol og etanol fri.
stemness-lignende funksjoner for alle CSC kulturene inkludert i denne studien tidligere ble karakterisert [16,27], med unntak av cscMG-63, cscMDA- MB-231, og cscACHN som evnen til vekst som flytende aggregater (figur 1), og mRNA-ekspresjon for KLF4, c-Myc, Nanog, og OCT3 /4 stemness markører [28] ble her bekreftet.
Representative bilder av heft innfødte celler og CSC flytende kuler observert av invertert optisk mikroskop for de ulike cellelinjer (skala bar 100 mikrometer, venstre panel), og genekspresjon av stamcellemarkører ved QRT-PCR (høyre panel). Normalisering til ACTB. For cscMG-63, c-myc ** p = 0,0019, KLF4 p = ns, Nanog ** p = 0,0010, OCT3 /4 * p = 0,0265. For cscMDA-MB-231, c-myc ** p = 0,0011, KLF4 * p = 0,0130, Nanog ** p = 0,0011, OCT3 /4 * p = 0,0325. For cscACHN, c-myc p = ns, KLF4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. For tilhenger ACHN, OCT3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12)
Spesielt i cscMG-63 fant vi en trend med økt uttrykk av KLF4. (Fig 1, n = 12, p = ns), og en betydelig høyere ekspresjon av c-Myc (** p = 0,0019), Nanog (** p = 0,0010), og OCT3 /4 (* p = 0,0265). CSC fra MDA-MB-231 svært uttrykke alle stamness markører enn heft kultur (figur 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; c-myc ** p = 0,0011; Nanog ** p = 0,0011; OCT3 /4 * p = 0,0325), mens sfære kulturer fra ACHN uttrykt konsekvent nivåer av mRNA for KLF4 og Nanog (figur 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; Nanog * p = 0,0130), og ikke annerledes uttrykk for c-myc . I cscACHN, er det uttrykk for OCT3 /4 markør lavere enn den heft innfødtes kultur (fig 1; * p = 0,0130). De stemness gener ble normalisert ved ACTB, en av de mest brukte HKG.
Expression profilen til kandidaten HKG gener
Femten kandidat referanse gener (tabell 1) ble valgt ut gjennom analyse av litteratur undersøkelse om studier på normale stamceller og kreftceller med QRT-PCR-analyse.
Vi har valgt de genene som tilhører ulike funksjonelle klasser eller veier for å redusere sannsynligheten for å inkludere i analysen co-regulert gener. Utskriften profilering av utvalgte gener ble foreløpig analysert av Illumina Genome Analyzer sekvensering. Den dype sekvensanalyse viste at de antatte referanse gener ble stabilt uttrykt, med unntak av G6PD (tabell 2, figur 2A).
(A) Varme kart som viser den relative ekspresjon av utvalgte gener i native celler og CSC fra MG-63, HOS, og SAOS-2. (B). Transcriptional profilen til Cycle terskel (CT) verdier av kandidat HKG gener i CSC og innfødte cellelinjer. Bokser representerer nedre og øvre kvartil av syklusen terskel utvalg med medianen angitt, loddrette streker representerer 10
th og 90
th persentiler. I både CSC og tilhenger cellelinjer, 18S rRNA var den mest høyt uttrykt gen (lavere Ct-verdi), mens G6PD var den minst uttrykte genet (høyeste Ct-verdi).
Vi brukte bare MG-63 som er representativt for den OS histotype for den følgende QRT-PCR-analyse for å bekrefte dataene som oppnås ved dyp-sekvensering. For å sammenligne ulike mRNA transkripsjon nivåer vi brukte terskel sykluser (CT) verdier. Ct-verdien er skjæringspunktet mellom en kurve forsterkning og en terskel linje, og er inverst korrelert med mengden av target-genet til stede i PCR-reaksjonen [29]. De 15 kandidat referanse gener utstilt et bredt spekter av uttrykk nivå. Fordelingen av median Ct-verdier og persentil for hvert gen er vist i Blox plottet på fig 2B. Referanse gener ble mindre uttrykt i CSC i forhold til innfødte celler. De minste forskjeller i genekspresjon mellom CSC og innfødte cellelinjer, uttrykt som ΔCt, ble påvist for B2M, TBP og SDHA, mens den høyeste ΔCt ble beregnet for ACTB, tubb og PGK1 (tabell 3). Ved å utføre den sammenkoblede Wilcoxon signed-rank test for hvert gen å vurdere forskjellen mellom CSC og innfødte celler hentet fra de samme cellene opprinnelse, fant vi en signifikant forskjell i HKG uttrykk mellom CSC og innfødte celler for rundt halvparten av HKG undersøkt ( Tabell 3).
Fastsettelse av housekeeping genekspresjon stabilitet
HKG uttrykk stabilitet ble evaluert ved hjelp NormFinder VBA applet, den GeNorm programvare, og ved å beregne og sammenligne variasjonskoeffisienten ( CV) i tre forskjellige grupper: i (1) CSC eller (2) innfødte celler, med sikte på å identifisere de mest stabile gener innen en bestemt celle undergrupper, og (3) i de samlede CSC og innfødte celler, med sikte på å identifisere de mest stabile genene for å bli betraktet som referanse gener for sammenligning av genekspresjon mellom CSC og naturlige celler.
stabilitets~~POS=TRUNC verdiene~~POS=HEADCOMP for NormFinder og M verdier for GeNorm er parametere av stabilitet som er inverst korrelert til uttrykket stabiliteten i HKG. Alle de 15 kandidat referanse gener hadde en M verdi lavere enn grenseverdien på 1,5 (tabell 4), som indikerte at alt kan betraktes som akseptabelt når det gjelder stabilitet [22].
1) den mest stabile HKG i CSC. Bruke NormFinder VBA Applet, de tre mest stabile HKG resulterte GAPDH, PGK1 og HMBS (fra første til tredje stabil), mens mindre stabil var RPL13a, B2M og GUSB. Bruke GeNorm programvare, identifiserte vi YWHAZ, GAPDH og TBP som den mest stabile HKG, mens de mindre stabile genene var ACTB, GUSB og B2M. CV-metoden også understrekes at bruken av ACTB bør unngås, mens, som for GeNorm og NormFinder analyser, bruk av PGK1 og YWHAZ anbefales. En sammenligning av rangeringen som produseres ved de tre metoder viste forskjell avhengig av typen av algoritmen anvendt. Den minimale antall referanse gener som kreves for normalisering ble bestemt ved GeNorm beregning av parvise variasjon (variasjonskoeffisient, V) mellom et gitt antall gener og inkluderingen av et ytterligere gen, og det optimale antall referanse-genet ble beregnet som 3 (V3 /4 0,114, figur 3A). I konklusjonen, for genuttrykket analyser av mRNA isolert fra CSC, den optimale normaliseringsfaktor skal beregnes som det geometriske gjennomsnittet av referansemålene YWHAZ, GAPDH og PGK1.
minimalt antall gener som kreves for data normalisering ble evaluert ved parvis variasjon (Vn /n-1) i (A) CSC, (B) naturlige celler, (C) i den CSC og tilpassede cellelinjer fra alle tumorer, (D) fra sarkom og (C) fra karsinomer. En variant koeffisient (V) under 0,15 angir det optimale antall gener som kreves for data normalisering. V2 /3 0,15 indikerer at 2 gener er nødvendig for data normalisering
2) Den mest stabile HKG i native heftende celler.. NormFinder analyse viste at 18S rRNA, TBP og PPIA var de tre beste HKG, mens RPL13a, G6PD, og ACTB var verre i uttrykket stabilitet. Tilsvarende GeNorm identifisert PPIA og 18S rRNA som de to mest stabile HKG, etterfulgt av GAPDH, mens de mindre stabile genene, i rekkefølge fra den siste rangert, ble G6PD, RPL13a, og ACTB. CV-metoden foreslått HMBS, TBP og YWHAZ som de tre mest stabile gener. Den GeNorm beregning av variasjonskoeffisient V antydet at den optimale antall referansegener var 2 (V2 /3 0,146, fig 3B), og tilsetningen av en tredje referanse-genet som resulterte i en liten effekt på normalisering (under cut-off-verdien på 0,15). I konklusjonen, for den innfødte cellen, ifølge analysene, den optimale normaliseringsfaktor skal beregnes som geometrisk gjennomsnitt av PPIA og TBP.
3) Til slutt utførte vi analyse av CSC og innfødte sammenslåtte celler i alt svulster (A), i sarkom (B) og karsinom (C).
(3A) i CSC og innfødte celler fra alle svulster, NormFinder identifisert GAPDH, TBP, og PPIA som de tre mest stabile HKG, mens ACTB, RPL13a og GUSB var mindre stabil. PPIA og GAPDH ble også bekreftet ved GeNorm analyse, sammen med 18S rRNA. Igjen, ACTB var den siste genet i stabilitet for GeNorm analyse, sammen med B2M og G6PD. CV evaluering foreslått TBP, B2M, og SDHA (tabell 4), mens ACTB, Tubb og 18S rRNA var mindre stabil. GeNorm anbefales bruk av 4 HKG for nøyaktig analyse av genuttrykk (V 0,15 når man sammenligner en normaliseringsfaktor basert på de 4 eller 5 mest stabile mål, Fig 3C). Derfor bør normaliseringsfaktoren beregnes som geometrisk gjennomsnitt av TBP, PPIA, HMBS, og YWHAZ eller GAPDH.
(3B) I CSC og innfødte celler fra sarkom, den NormFinder programvare identifisert GAPDH, YWHAZ og 18S rRNA som de mest stabile gener, i stedet G6PD, RPL13a og B2M var den mindre stabile. GAPDH og YWHAZ ble identifisert som den beste HKG også ved GeNorm analyse, mens ACTB og RPL13a var blant de siste rangert gener. CV-metoden viste at HMBS, TBP, og SDHA hadde den beste mulige posisjon (tabell 5). Det optimale antall referanse mål er 2 (V2 /3 0,143, figur 3D). I konklusjonen, kan den optimale normaliseringsfaktor beregnes som geometrisk gjennomsnitt av referanse mål YWHAZ og GAPDH.
(3C) Analyse av HKG stabilitet i carcinoma avdekket at PPIA, HMBS og RPL13a var mest stabile HKG for NormFinder. GeNorm også bekreftet PPIA og RPL13a som mest stabile mål ved GeNorm, etterfulgt av 18S rRNA, mens CV metoden foreslått B2M, TBP og G6PD (tabell 5). Den GeNorm beregning av koeffisienten V antydet at to HKG er tilstrekkelig for normalisering (V2 /3 0,084, figur 3E). I konklusjonen, bør den optimale normaliseringsfaktor i dette tilfellet beregnes som geometrisk gjennomsnitt av to av følgende gener, PPIA, HMBS eller RPL13a, som har det samme generelle rang verdi.
Validering av identifiserte HKG i CSC modell
i genuttrykk evaluering, kan bruk av suboptimal HKG generere feilaktige resultater eller kan skjule en forskjell i genekspresjon. Dette er spesielt viktig for gener som litt veksle mellom to populasjoner av celler, som CSC og innfødte celler.
Vi analyserte uttrykk for stemness gener c-myc, KLF4, Nanog, og OCT3 /4 som tidligere var normalisert til ACTB (fig 1), med de identifiserte topp-ranking HKG for CSC og innfødte celler, i sarkom og karsinom, henholdsvis (GAPDH og YWHAZ for sarkom, og PPIA og HMBS for karsinom). Noen av stammerelaterte gener anses viste en forbedret robusthet av statistisk analyse utført med normalisering med den mest stabile HKG, i respekt med ACTB. Spesielt, som vist i figur 4, har vi funnet at normaliseringen av Nanog til det geometriske gjennomsnittet av de mest stabile HKG resulterte i *** p = 0,0007 for cscMG-63 og ** p = 0,0043 for cscACHN, mens med ACTB normalisering vi fått ** p = 0,0011 og * p = henholdsvis 0,0130,. I cscMG-63, for cMyc vi oppnådd *** p = 0,0003 med den nye analysen, i stedet for ** p = 0,0019 ved normalisering til ACTB.
Virkningen av genekspresjon normalisering med optimal HKG var undersøkt på CSC og innfødte celler fra MG-63 og ACHN. (A) For osteosarkomcellelinje, ble uttrykket av stamcellemarkører Nanog og cMyc evaluert og normalisert til geometrisk gjennomsnitt av GAPDH og YWHAZ. *** P = 0,0007 for Nanog, *** p = 0,0003 for c-Myc. (B) For ranal karsinom cellelinje, ble uttrykket av Nanog og cMyc normalisert til det geometriske gjennomsnittet av PPIA og HMBS. ** P = 0,0043 for Nanog. (N = 6).
Diskusjoner
Den utvikler konseptet med CSC har tiltrukket seg mye oppmerksomhet, og karakterisering av CSC har ledet an i romanen potensielle for anti-kreft terapi. CSC er en minoritet undergruppe av tumor initiere celler involvert i ulike faser av pro-tumorigen prosessen, fra startfasen [30], for å chemoresistance [31] og tilbakefall [32]. CSC kan isoleres fra cellelinjer og vev prøven med tjeneste-systemet metoden [12], basert på evnen til CSC til å vokse som sfæriske flytende kolonier i forankringsuavhengig betingelser. Til dags dato, er dette ansett som et uvurderlig metode for å få CSC-beriket kulturer. Nylig, isolert vi CSC fra muskel- og skjelett sarkomer, både fra cellelinje og frisk biopsi [16,27].
