Abstract
Autophagy er en sentral prosess i regulering av celleoverlevelse, celledød og spredning, og spiller en viktig rolle i kreftutvikling, inkludert thyroideakarsinom. Genetisk variasjon i Autophagy komponenter har blitt demonstrert å påvirke evnen til å utføre autofagi og er forbundet med sykdoms mottakelighet, progresjon og utfall. I denne studien, vurderte vi om genetisk variasjon i autofagi gener bidrar til mottakelighet for å utvikle thyroideakarsinom, sykdomsutvikling og /eller pasientens utfall. Resultatene tyder på at pasienter som bærer
ATG5
enkeltnukleotidpolymorfi rs2245214 har en høyere sannsynlighet for å utvikle thyroideakarsinom (OR 1,85 (95% CI 1.4 til 3.23), P = 0,042). I kontrast, kan ingen signifikante forskjeller observeres for de andre genetiske varianter studert i form av skjoldbruskkjertelen carcinoma mottakelighet. Videre har ingen av de valgte genetiske varianter var assosiert med kliniske parametre for sykdomsprogresjon og utfall. I konklusjonen, genetisk variasjon i
ATG5
, en sentral aktør i autofagi prosessen, er funnet å være assosiert med økt mottakelighet for thyroideakarsinom, noe som indikerer en rolle for autofagi i skjoldbruskkjertelen kreftutvikling.
Citation : Plan TS, van de Vosse E, Huijbers A, Netea MG, Joosten LAB, Smit JWA, et al. (2014) Rolle av genetiske varianter av autofagi Gener i følsomhet for Non-Medullary skjoldbruskkjertelen og pasienter Outcome. PLoS ONE 9 (4): e94086. doi: 10,1371 /journal.pone.0094086
Editor: David L. Boone, University of Chicago, USA
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 10 mars 2014; Publisert: 16 april 2014
Copyright: © 2014 Plan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. TSP var støttet av en Veni bevilgning på den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO). MGN ble støttet av en Vici bevilgning på den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitelcellelinje avledet ikke-medullær thyroid kreft (NMTC) er den vanligste hormon malignitet med en økende forekomst i løpet av de siste tiårene som papillær thyroideakarsinom (PTC) og follikulær thyroideakarsinom (FTC) representerer de aller fleste av tilfellene [1] – [3]. Selv om noen tumor innledende hendelser og resistens faktorer har blitt identifisert (stråling, flere genetiske faktorer som genetiske rearrarangements eller mutasjoner i
RET
,
PTEN Hotell og
APC
) [4], er patogenesen av NMTC ikke helt forstått. En bedre forståelse av de underliggende molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen av NMTC kan gi diagnostiske og prognostiske verktøy og kan være en potensiell kilde til nye molekylære mål for terapi.
Økende bevis tyder på at autofagi spiller en viktig rolle i patofysiologien av ondartet prosessen. Autophagy er en kompleks prosess av auto-fordøyelse under forhold med cellulært stress, hypoksi eller energimangel. Ved aktivering blir en autophagosome dannes som omslutter cellulære komponenter så som organeller, ribosomer og proteinaggregater, som deretter nedbrytes ved fusjon av autophagosome med en lysosomet. Disse nedbrytningsprodukter kan gjenbrukes for å bygge makromolekyler og for cellulær energimetabolismen [5] – [7]. I tillegg har autophagy en viktig rolle i reguleringen av celledød, celledifferensiering, induksjon av cellesyklus-stans, og modulering av inflammasjon [8]. Autophagy kan ha både forebyggende og salgsfremmende effekter på tumordannelse, som sannsynligvis er avhengig av typen av autophagy initiering, tumorcelletype og den fasen av tumorutvikling [9], [10]. Derfor er det viktig å identifisere de mekanismene som regulerer autophagy i maligne transformerte celler.
Essensielle komponenter i autophagy fremgangsmåten er den evolusjonære høyt konserverte ATG-proteiner, hvorav mer enn 30 er nå blitt identifisert i gjær [11 ], [12]. Vanlige germline genetiske varianter innenfor gener som koder for Autophagy komponenter ble nylig vist å være assosiert med human sykdom, som strekker seg fra inflammatorisk tarmsykdom [13] – [15] til nevrodegenerasjon [16], infeksjonssykdommer [17], [18] og allergi [ ,,,0],19]. Men til tross for sin sentrale rolle i kreft initiering og progresjon, rollen til felles kimcellelinje genetisk variasjon innen autofagi system for kreft mottakelighet, spesielt NMTC, er stort sett uutforsket. Nylig, beskrev vi at en genetisk variant i autofagi genet
ATG16L1
har en viktig innvirkning på følsomheten for NMTC [20]. I denne studien utvidet vi sikte på vår undersøkelse for å vurdere potensialet sammenslutning av et mye bredere spekter av genetiske varianter i autofagi gener med mottakelighet for NMTC, progresjon og resultat.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etisk komité Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Nederland. Alle fag ga skriftlig informert samtykke. Studien er utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Thyroid karsinom pasienter
Alle pasienter med histologisk bekreftet ikke-medullær epitelcelledifferensiering avledet NMTC som besøkte poliklinikken ved Divisjon for endokrinologi ved Institutt for indremedisin, Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Nederland, ble bedt om å delta i genetisk testing. Rekrutteringen av pasientene fant sted mellom november 2009 og juni 2010. Primær behandling av pasientene bestod av total eller nesten total tyreoidektomi i alle pasientene, og modifisert radikal lymfeknute disseksjoner i pasienter med bekreftet nodal metastaser. Dette ble etterfulgt av ablasjon med radioaktivt jod (I
131, RAI) av rest tyroideavev 4-6 uker etter operasjonen. Om nødvendig, ble pasientene behandlet flere ganger med RAI å nå remisjon. Initial kur ble definert som ikke-detekterbar Thyroid hormon stimulert tyreoglobulin (Tg) i fravær av anti-Tg antistoffer og ingen tegn på lokoregionalt sykdom eller fjernmetastaser på hele kroppen jod skanner (WBS) og /eller nakke ultralyd undersøkelser på seks til ni måneder etter RAI ablasjon. Tumorresidiv ble definert som nye bevis av lokoregionalt sykdom eller fjernmetastaser etter vellykket primærbehandling. Nåværende sykdomsstatus ble definert som «i remisjon» i tilfelle undetectable Tg i fravær av anti-Tg antistoffer og ingen tegn på lokoregionalt sykdom eller fjernmetastaser i siste oppfølgingsbesøk. Vedvarende sykdom status ble definert som påviselig Tg og /eller bevis for lokoregionalt sykdom eller fjernmetastaser.
Demografiske og kliniske kjennetegn (tumorhistologi og TNM staging), behandling (antall RAI terapitimer, kumulativ RAI dose ), oppfølging tid, antall reoperasjoner og ekstern stråle strålebehandling, eventuelt ble hentet fra pasientens journal (tabell 1). Den nederlandske befolkningen basert kontrollgruppen bestod av 189 friske kontroller (48% kvinner, gjennomsnittsalder 61 ± 10 (SD) år) som ikke har noen bevis for skjoldbrusk kreft eller andre kreftformer.
Genotyping
vene~~POS=TRUNC ble trukket fra cubital vene av alle deltakerne i 10 ml EDTA-rør (Monoject). DNA ble isolert fra fullblod ved hjelp av isolasjonskit Puregene (Gentra sytems, MN, USA) i henhold til produsentens protokoll. Koding som ikke er synonyme enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) og noen SNP’er i utranslaterte regioner av de analyserte genene ble valgt på grunnlag av tidligere publiserte forbindelser med humane sykdommer og /eller kjente funksjonelle virkninger på proteinfunksjon eller genekspresjon. Totalt 10 SNPs i
ATG2B
,
ATG5
,
ATG10
,
IRGM
,
LAMP1
,
LAMP3
og
WIPI1
ble genotypet (tabell 2) ved bruk av en masse-spektrometri genotyping plattform. Alle SNP’er er i Hardy-Weinberg likevekt i både pasient og kontrollgrupper. Kvalitetskontroll ble utført ved å duplisere prøvene innenfor og på tvers av platene og ved innlemmelse av positive og negative kontrollprøver.
Statistisk analyse
Forskjellen i genotypefrekvensene mellom pasienter og kontroll gruppe ble analysert i en dominerende, genet dosering og recessive modell ved hjelp av logistisk regresjon. Effekten av genotyper på epitel avledet NMTC følsomhet ble estimert ved å beregne odds ratio (ORS) og deres 95% konfidensintervall (95% KI) ved hjelp av de samme statistiske metoder. Vi utførte også χ
2 analyse, og eventuelt logistisk regresjon, for å avgjøre om tumor størrelse, kumulativ RAI dose, antall RAI behandlinger, sykdomsstatus etter tyreoidektomi pluss radio-ablasjon (hvis aktuelt) og nåværende sykdomsstatus var assosiert med genotypen av de analyserte autophagy gener. De følgende parametre ble analysert: 1) tumorstørrelsen på diagnosetidspunktet ble klassifisert i henhold til den 6
th utgave av UICC TNM klassifiseringen [21]; 2) antall RAI behandlinger (inkludert RAI ablasjon) som 0-1 behandlinger (f.eks ingen RAI ablasjon eller utelukkende ablasjon av tyreoidearester etter (nær) total tyreoidektomi) eller ≥2 behandlinger; 3) den kumulative RAI dosering som 0-3.7 GBq (0-100 MCI), 3.8-7.4 GBq (101-200 MCI) eller 7,4 GBq ( 200 MCI); 4) sykdomsstatus etter ablasjon som remisjon eller vedvarende og 5) den aktuelle sykdomsstatus som remisjon, vedvarende eller tilbakevendende (etter tidligere dokumentert remisjon).
For å teste for forskjeller mellom de tre ulike genotypgruppene (homozygot vill -type (gammel), heterozygot, homozygot variant (avledet)) i gjennomsnittsalder ved diagnose, kjønnsfordeling eller tumorhistologi (potensielle confounders), ble brukt enveis ANOVA og Pearson χ
2-analyse når det passer. Alle statistiske analyser ble utført med SPSS programvarepakken (versjon 20.0). Overall, statistiske tester var tosidig og en p-verdi under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Genetisk mottakelighet analyse
Fra alle pasienter med NMTC som besøkte poliklinikken av Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Nederland mellom november 2009 og juni 2010, 139 pasienter (104 kvinner, gjennomsnittsalder 38,9 ± 12,8 (SD) år på tidspunktet for blodprøvetaking) enige om å delta i studien. De kliniske og demografiske karakteristikker av NMTC pasientene er oppsummert i tabell 1. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom pasientene med forskjellig autofagi genetisk variant genotyper med hensyn til gjennomsnittsalder ved diagnose, kjønn eller tumorhistologi (data ikke vist).
statistisk analyse av autofagi genetiske varianter for NMTC mottakelighet viste en statistisk signifikant ASSOCATION med
ATG5
rs2245214 enkeltnukleotidpolymorfi. Analyse ved å anvende en dominerende modellen viste en økt risiko for CG /GG genotype for diagnostisering av NMTC sammenlignet med CC genotypen (OR = 1,85, p = 0,042), mens ingen statistisk signifikans ble oppnådd med enten en recessiv modell eller et gen dosering modell (data ikke vist). For de andre autofagi genetiske varianter undersøkt, ingen ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller vedrørende mottakelighet for å utvikle NMTC med noen av foreningen modeller ble testet, dvs. recessivt gen dosering og dominerende modeller (tabell 3 og data ikke vist).
genotype – fenotype assosiasjoner
Innenfor NMTC pasient kohort, assosiasjoner mellom genotype og tumorstørrelse (T scenen), antall i
131 behandlinger, kumulativ jeg
131 dose, sykdomsstatus etter ablasjon og nåværende sykdomsstatus ble vurdert ved hjelp av Pearson χ
2 analyse. For
ATG5
rs2245214 enkeltnukleotidpolymorfi resultatene er vist i tabell 4. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom pasientene i de ulike genotypgruppene med hensyn til TNM staging, antall RAI behandlinger, kumulativ RAI dose og værende sykdomsstatus (tabell 4). Videre ble ingen assosiasjoner observert for noen av de andre undersøkte autofagi genetiske varianter med disse kliniske parametre (data ikke vist).
Diskusjoner
Denne studien ble utført for å undersøke om felles genetiske varianter i menneske autofagi genene er assosiert med NMTC mottakelighet, alvorlighetsgrad og /eller klinisk utfall. Vi fant ut at en av de utvalgte genetiske varianter,
ATG5
rs2245214 enkeltnukleotidpolymorfi er signifikant assosiert med NMTC mottakelighet, men ikke med NMTC alvorlighetsgrad eller utfallet. Videre er ingen av de andre valgte Autophagy SNP’er assosiert med enten mottakelighet for NMTC, alvorligheten av sykdommen eller klinisk resultat.
Alle de undersøkte proteiner er involvert i autophagy maskineri, noen i den tidlige fasen av autophagosome dannelse (ATG2B, ATG5, ATG10, IRGM og WIPI1), de andre i sen fase av autophagosome-lysosome fusjon (LAMP1 og LAMP3) [22], [23]. I prosessen med autophagosome formasjon, blir ATG5 rekruttert til å ta del i et stort proteinkompleks sammen med ATG12 og ATG16L1 for å sette sammen den doble membranen som omgir autophagic lasten [24], [25]. Autophagy er aktiv på basale nivåer i alle celletyper, hvor det antas å spille en housekeeping rolle i resirkulering intracellulære komponenter.
Når det gjelder kreftutvikling, er rollen til autofagi kompleks og avhenger av type kreft og stadium av sykdommen. Defekter i autofagi kan formidle kreftutvikling gjennom opphopning av protein aggregater og ødelagte organeller. På den annen side, i apoptotiske-kompetente celler autophagy er cytobeskyttende, da disse cellene avhengige av autofagi for å dekke deres økt energiforbruk [9]. Til tross for den viktige rollen autofagi for patogenesen av kreft, er overraskende lite kjent om den genetiske variasjonen i autofagi gener og dens innflytelse på kreftutvikling. I denne studien, vurderte vi effekten av et bredt spekter av genetiske varianter i autofagi gener for mottakelighet for og behandling utfallet av differensiert epitelceller avledet NMTC.
Den nåværende genetiske forening studien viste at G allel av
ATG5
rs2245214 SNP er assosiert med økt mottakelighet for å utvikle NMTC. I kontrast til dette
ATG5
SNP var ikke assosiert med NMTC alvorlighetsgrad og utfall som reflekteres av TNM staging, kumulativ RAI dose og sykdom utholdenhet. Det faktum at de genetiske varianter i de andre utvalgte autofagi gener ikke er forbundet med NMTC mottakelighet og alvorlighetsgraden i vår kohort av NMTC pasienter kan tyde på at enten disse proteinene har ingen fremtredende rolle i NMTC kreftutvikling eller konsekvensene av de genetiske varianter for funksjonen de respektive proteinene er relativt begrenset. Imidlertid bør replikering studier i andre NMTC kohorter utføres til fast demonstrere manglende sammenslutning av disse genetiske varianter med NMTC mottakelighet og alvorlighetsgrad.
Genetisk variasjon i
ATG5
har tidligere vært knyttet til systemisk lupus erythematosus (samme SNP) [26], [27], astma [19] og neurodegenerativ sykdom [28], noe som indikerer den viktige rollen ATG5 i menneskers helse og sykdom. Imidlertid konsekvensene av disse genetiske varianter av
ATG5
for funksjonen av proteinet er fortsatt ukjent og berettige ytterligere undersøkelse som skal også omfatte tidligere rapporterte ikke-autophagic funksjoner av ATG5 [29], [30].
Vår forrige rapport av den genetiske sammenslutning av
ATG16L1
T300A polymorfisme (rs2241880) med NMTC mottakelighet og alvorlighetsgrad [20] er nå utvidet med demonstrert foreningen av
ATG5
rs2245214 polymorfisme med NMTC følsomhet i denne studien, bekrefter rolle autophagy i NMTC patogenesen. Av notatet, ingen additive effekten av de to SNPs i
ATG5 Hotell og
ATG16L1
ble observert, noe som indikerer at de to SNPs handle selvstendig. Interessant nok er begge rolle autophagy i NMTC og det terapeutiske potensialet for målretting autofagi for NMTC behandling bekreftes av andre studier [10], [31] -. [33]
Flere studier har vist den viktige rollen autophagy i NMTC patogenesen, som representerer en av de mest fremtredende nedstrøms veiene for de ofte avvikende regulerte RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /Akt /mTOR baner i NMTC, som fører til inaktivering av autophagy maskineri [34], [35]. I tråd med disse studiene, reaktivering av autofagi ved hemming av mTOR kinase resultater i resensibilisering av NMTC til kjemo- og stråleterapi [33]. I kontrast, har også motsatt effekt av signalering gjennom disse onkogener blitt beskrevet som aktiverer basal autofagi, indikerer de komplekse og kontekstavhengige effekter av disse banene på autofagi [36] – [38]. Genetiske varianter av autofagi gener som fører til enten mindre eller mer funksjonell autofagi maskiner kan senere føre til avskaffet terapi følsomhet og økt kreftutvikling, og gir en mulig mekanisme bak de observerte genetiske foreninger. Ytterligere studier er garantert å dissekere rolle autophagy i enten fremme eller hemme kreftutvikling og terapi følsomhet i sammenheng med NMTC subtyper å identifisere de mest effektive målrettet terapi.
er et viktig poeng å bli vurdert som korreksjon for multippel testing i denne studien. Det må tas hensyn til at ved søknad korreksjon for multippel testing, er statistisk signifikans av
ATG5
rs2245214 SNP tilknytning NMTC mottakelighet tapt. En annen begrensning som må tas i betraktning er de manglende datapunkter for klinisk vurdering av TNM stageing, noe som har redusert statistisk styrke til å påvise signifikante forskjeller. Resultatene oppnådd i denne studien funnene må derfor bekreftes i større prospektive kohorter for å trekke bastante konklusjoner om den definitive rolle genetiske polymorfismer som er beskrevet her. Til tross for dette, er det likevel viktig å observere at den tidligere sammenhengen mellom
ATG16L1 Hotell og NMTC gir indirekte støtte til funnene i denne studien.
I konklusjonen, vi har identifisert
ATG5
rs2245214 genetisk variant som en genetisk mottakelighet faktor i skjoldbruskkjertelen kreftutvikling. Disse funn understreker det terapeutiske potensialet for modulering av ATG5 og ATG16L1, sannsynligvis som en del av autophagy maskineri, som en ny behandlingsstrategi for NMTC pasienter.
