Abstract
Antiangiogen terapi er viktig for behandling av gynekologisk kreft. Imidlertid er den terapeutiske fordelen ved disse behandlingene forbigående, hovedsakelig på grunn av den selektive aktivering av kompenserende proangiogenic veier som fører til hurtig utvikling av resistens. Vi forsøkte å identifisere og målrette potensielt alternativ til aliserte anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) terapi, med sikte på å utvikle en kombinasjon av anti-angiogene midler for å tilveiebringe utvidede terapeutiske fordeler. Vi utviklet et preklinisk
in vivo
fenotypisk resistens modell for eggstokkreft motstandsdyktig mot antiangiogen terapi. Vi målte dynamiske endringer i utskilte kjemokiner og angiogen signalering i tumorer og plasma i respons til anti-VEGF-behandling, som tumorer utviklet seg fra den første responsive fase til progressiv sykdom. I svulster som progrediert etter sorafenib behandling, gen- og protein uttrykk nivåer av proangiogenic CXC kjemokiner og deres reseptorer var betydelig forhøyet sammenlignet med responsive svulster. Kjemokinet (C-X-C-motiv) ligand 8 (CXCL8), også kjent som interleukin-8 (IL-8) vekst var tidsavhengig og falt sammen med dynamikken i tumorprogresjon. Vi brukte SB225002, en farmakologisk inhibitor av kjemokin (CXC motiv) reseptor 2 (CXCR2), for å forstyrre CXC kjemokin-formidlede funksjoner i eggstokkkreftceller i
in vitro
analyser av hemming av cellevekst, sfæroide formasjon, og celle migrasjon. Kombinasjonen av CXCR2-inhibitor med sorafenib førte til en synergistisk inhibering av cellevekst
in vitro
, og ytterligere stabilisert tumorprogresjon følgende sorafenib
in vivo
. Våre resultater tyder på at CXCR2-mediert chemokiner kan representere et viktig kompenserende sti som fremmer motstand mot antiangiogen terapi i eggstokkreft. Dermed samtidig blokkering av denne proangiogenic cytokin pathway bruker CXCR2 hemmere og VEGF reseptor (VEGFR) pathway kan forbedre resultatene av antiangiogen terapi
Citation. Devapatla B, Sharma A, Woo S (2015) CXCR2 Hemming Kombinert med Sorafenib Forbedret Antitumor og Antiangiogen Response i prekliniske modeller for eggstokkreft. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10,1371 /journal.pone.0139237
Redaktør: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, ITALIA
mottatt: 10 juni 2015; Godkjent: 10 september 2015; Publisert: 28.09.2015
Copyright: © 2015 Devapatla et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institutes of General Medical Sciences av National Institutes of Health i henhold Award Number P20GM103639. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft i USA Når behandlet med dagens standard-of-care kjemoterapi, fem-års overlevelse av avansert sykdom fortsatt lav. Ovarietumorer er rikt vaskularisert; en korrelasjon mellom mikrovaskulær telling og biologiske aggressivitet [1, 2]. Angiogenese spiller en sentral rolle i både normal eggstokkfunksjon og utvikling og progresjon av kreft i eggstokkene [3]. Tumorangiogenese er kritisk for utvikling av ascites og eggstokk-kreft metastase inn i det peritoneale plass [4]. Som angiogenese er et kritisk trinn i forplantning av malign tumorvekst og metastase [5], er angiogenese et gyldig mål ved behandling av eggstokkreft [6]. Flere proangiogenic faktorer fremmer prosessen med dannelsen med VEGF fartøy som en sentral aktør i tumor mediert angiogenese [5]. En rekke anti-angiogene midler, innbefattet den terapeutiske antistoff mot VEGF bevacizumab og multi-målrettede kinase inhibitorer av VEGF-reseptorer (VEGFR), har vært aktivt undersøkt, eller er under utvikling som behandlinger for avansert sykdom. Behandling med bevacizumab gitt en progresjonsfri overlevelse (PFS) fordel i avansert eggstokkreft når det gis i kombinasjon med kjemoterapi [7, 8]. Flere VEGFR målretting multi-kinase hemmere som nintedanib, trebananib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, cediranib har blitt testet i ulike faser av eggstokkreft kliniske studier [9]. Noen av disse legemidlene, inkludert pazopanib, nintedanib, cediranib, og trebananib har blitt evaluert i randomiserte kliniske fase III studier, og alle har vist en progresjonsfri overlevelse (PFS) nytte [10]. Imidlertid er den terapeutiske nytte av anti-VEGF-terapi kortvarig. Tumorprogresjon er slutt gjenopprettet etter en innledende respons, noe som indikerer voksende motstand. Forstå mekanismene for svulst flukt fra anti-VEGF terapi er avgjørende for å finne strategier for å omgå motstand. Mange mekanismer som er involvert i ervervet resistens mot anti-VEGF-terapi, inkludert aktivering av alternative reaksjonsveier for å omgå VEGF hemning, for derved å gjenoppta tumor angiogenese og tumorvekst [11]. Således kan kombinere forskjellige anti-angiogene terapier være en strategi for å gi varige terapeutiske fordeler.
Mange vekstfaktorer som er involvert i kreft i eggstokkene invasjon er også fremtredende i sin angiogenese [4]. Inflammatoriske kjemokiner spiller en viktig rolle i angiogenese og progresjon av kreft i eggstokkene. Vekselvirkningen mellom kjemokiner produsert av eggstokkreft celler og kjemokin reseptorer uttrykt av endotelceller og svulsten mikromiljøet fremme tumorvekst ved å stimulere angiogenese og økende migrasjon, invasjon, og celleproliferasjon [12-14]. Blant de kjemokin undergrupper, CXC kjemokiner med 3-aminosyre (Glu-Leu-Arg /ELR) motiv (ELR
+), inkludert CXCL1, 2, og 3 (GRO-α, β og γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, og CXCL8 (IL-8), er potente regulatorer av angiogenese og formidle deres angiogene aktivitet gjennom kjemokin reseptor CXCR2 [14]. Overekspresjon av proangiogenic kjemokiner og CXCR2 ble korrelert med dårlig prognose hos pasienter med eggstokkreft [12, 15-17]. Dermed beltestrammere Forse
+ CXC proangiogenic chemokin trasé er et potensielt alternativ til å fremme angiogenese i ovarietumorer.
For å identifisere effektive strategier for å omgå den mekanismen som eggstokkreft omgår anti-VEGF terapi, genererte vi en xenograft modell av antiangiogene terapi motstand som etterligner klinisk resistens mot eggstokkreft. Vi identifiserte endringer i cytokin og angiogenic pathways i tumorer som er resistente mot anti-angiogene terapier, som tumorer utviklet seg fra den første responsive fasen til den ildfaste fase. Vår
in vitro Hotell og
in vivo
resultatene indikerte at samtidig rettet mot CXCR2 proangiogenic cytokin aksen med anti-VEGF hemming er en effektiv strategi for å tilby utvidede terapeutiske fordeler i prekliniske modeller for eggstokkreft kreft.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
Skov-3 eggstokkreft cellelinjen ble innhentet fra American Type Culture Collection. A2780 og OVCAR429 eggstokkreft celler ble vennlig levert av Dr. Danny Dhanasekharan (Stephenson Cancer Center, OUHSC). A2780 ovarian cancer-cellelinje ble opprinnelig erholdt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). OVCAR429 er eggstokkreft celler som tidligere har blitt publisert [18, 19]. A2780 og OVCAR429 celler ble holdt i RPMI-medium (Invitrogen). SKOV-3-celler ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Invitrogen). Media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) og endotelcelle media ble kjøpt fra Cell Applications (San Diego, California). Sorafenib ble oppnådd fra LC laboratorier (Woburn, MA). SB225002 (
N
– (2-hydroksy-4-nitrofenyl) –
N
«- (2-bromfenyl) urea) er en potent og selektiv ikke-peptid hemmer av CXCR2 (IL- 8R) chemokine reseptoren. SB225002 ble anskaffet fra Tocris Biovitenskap (Bristol, UK). Narkotika forberedelsene til sorafenib og SB225002 ble utført i henhold til metodene som er beskrevet andre steder [20, 21].
Dyr og medikamentell behandling
Seks uker gamle kvinnelige atymiske
nu /nu
nakne mus ble kjøpt fra Charles River Laboratories, Inc., gjennom NCI (Frederick, MD). Alle prosedyrer som involverer mus ble utført i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), og protokollen ble godkjent av University of Oklahoma Health Sciences Senter (OUHSC) Institutional Animal Care og bruk Committee (Protokoll nummer: 12-154-H). Mus ble gitt subkutane injeksjoner av 5 x 10
6 SKOV-3-celler i den høyre flanke. Tumorstørrelse ble målt to ganger ukentlig ved hjelp av digitale calipers (Mitutoyo) med en nøyaktighet på ± 0,02 mm. Tumorvolumet ble beregnet som 4/3 π lengde x bredde x høyde. Mus ble behandlet med saltløsning eller sorafenib når tumorer nådde omtrent 80 mm
3 i volum, 32 dager etter tumorcelle implantasjon. Sorafenib ble administrert daglig ved oral tvangsforing i en dose på 30 mg /kg. Behandlingen fortsatte inntil tumorene vokste til 20 mm (den maksimale tillatte veksten av IACUC), ved hvilket punkt ble musene avlivet. Xenografttumorer som økte mindre enn 50% av den opprinnelige tumorvolum ved begynnelsen av behandlingen ble ansett behandling følsomme, da dette viste en langvarig trend mot tumor stase [22]. Svulster som progrediert med en langsiktig trend mot fortsatt vekst etter en innledende respons på behandlingen ble ansett for å vise nye fenotypiske behandling-motstand. På forskjellige tidspunkter, anvendte vi retro-orbital punktering for å samle ca 30 ul blod i EDTA-holdige rør for å bestemme tidsprofilene for sirkulerende cytokiner og angiogene faktorer. Dyrene ble bedøvet før den retro-orbital blodprøvetaking ved anvendelse av 2% isofluran i en inhaleringskammeret reguleres med en kalibrert fordamper. Musene ble overvåket daglig og avlivet så snart det var noe bevis at musen var vondt fra tumor eller narkotika eller hvis tumorbelastning nådde 20 mm. De tidlige eutanasiendepunkter inkluderer moderat eller alvorlig toksisitet, herunder hurtig vekttap på mer enn 10% av kroppsvekten, gradvis vekttap på mer enn 15%, svakhet, ikke-responsivitet, respiratoriske problemer, alvorlige unormale nevrologiske tegn, blødning, traume eller manglende evne til å spise eller drikke. Etter åtte uker med behandling, ble alle musene avlivet ved hjelp av CO
2 kvelning og obdusert. Blod og tumorvev ble samlet for analysene som er beskrevet nedenfor. Plasma ble isolert og lagret ved -80 ° C inntil analyse.
in vivo
kombinasjonsstudie, SKOV-3-xenotransplantater ble behandlet med 30 mg /kg /dag sorafenib til fremveksten av fenotypisk resistens som definert ovenfor. Sorafenib bestandig dyr ble randomisert i tre grupper for å motta sorafenib, SB225002, eller kombinasjon av sorafenib og SB225002. SB225002 ble administrert en gang daglig ved intraperitoneal (IP) injeksjon i en dose på 10 mg /kg. Kombinasjonsbehandling gruppe daglig fikk en oral dose på 30 mg /kg sorafenib pluss 10 mg /kg SB225002 (IP) til slutten av studien.
cytokin og angiogen vekstfaktor multiplex analyse
gjennomføres en multipleks-analyse for å identifisere endringer i sirkulerende nivåer av angiogene vekstfaktorer i behandlings-sensitive og resistente-dyr. Plasmakonsentrasjoner av tumor- og stroma /verts som kommer angiogene vekst proteiner ble separat bestemt ved bruk av menneskelige (Millipore, katt # HAGP1MAG-12K) og mus (Millipore, katt # MAGPMAG-24K) angiogenese /vekstfaktor magnetisk perle paneler, henholdsvis. Totalt 17 mennesker og 24 mus løselige angiogene faktorer ble kvantifisert. En liste over kvantifiserte analytter er gitt i støttemetoder (S1 File). De oppløselige nivåer av CXC kjemokiner CXCL1, 2, 5 og 6 i mus plasmaprøvene ble bestemt ved hjelp av et multipleks-analyse (Bio-Rad, cat # 171- AK99MR2).
veksthemmende analyse
In vitro
hemming av cellevekst ble målt via MTS analyse (Promega). Kort beskrevet ble 5 x 10
3 HUVEC eller SKOV-3-celler ble sådd på 96-brønners plater og inkubert over natten. Vi tilsatte forskjellige konsentrasjoner i området fra 0,01 til 100 uM av sorafenib eller SB225002 til 100 ul friskt medium, og inkuberte cellene i den angitte tid. Vi tilsatte 20 ul av CellTiter 96 Aqueous One løsning reagens og inkuberte cellene i 1 time. Absorbans ble målt ved 450 nm. Cellelevedyktigheten ble beregnet i forhold til kontroller (celler behandlet med bærer alene). Gjennomsnitt av tre replikater per prøve ble brukt for analyse.
Den kombinerte effekten av sorafenib og SB225002 ble bestemt ved hjelp av ulike eggstokkreft celler og HUVECs. IC
50 verdier ble bestemt for begge legemidler med hver cellelinje. Toppen Konsentrasjonen av kombinasjonen ble fremstilt ved å blande sorafenib og SB225002 ved 1: 2-forhold av deres IC
50 for eggstokkreft celler og 1: 1-forhold for HUVECs basert på deres IC
50 verdier. Serie fortynning (3x) ble utført fra toppen konsentrasjon for å få totalt 5 fortynninger (
n
= 3 replikat). De celler (5000 celler /brønn) ble deretter inkubert ved 37 ° C i 48 timer. Celleoverlevelse ble studert ved bruk av MTS-analyse som beskrevet ovenfor. Naturen av kombinatoriske effekten av de to stoffene ble bestemt ved å beregne kombinasjonen indeks (CI) verdier, som karakteriserer for synergi (CI 1), additivity (CI = 1), eller antagonisme (CI 1), ved hjelp av CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).
Angiogenese rør dannelsesbestemmelsen
vekst~~POS=TRUNC faktor~~POS=HEADCOMP-redusert Matrigel matrise (Corning) ble tint ved 4 ° C over natten og deretter bunn belagt i en 96-brønners plate (50 ul per brønn) ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter ble 100 ul medium inneholdende HUVECs (10000 celler), med eller uten sorafenib, og SB225002 tilsatt til hver brønn på toppen av størknet Matrigel matrisen og inkubert ved 37 ° C i 16 timer. Brønnene ble fiksert i 4% paraformaldehyde og nettverk ble avbildes med et fasekontrastmikroskop. For kvantifisering av nettverkene, ble WimTube programvare som brukes (Wimasis).
Transwell migrasjonsanalysen
cellemigrering analyser ble utført ved anvendelse av 8-um porer Transwell innsatser (Corning) som tidligere beskrevet [23 ]. Til hjertekamrene, ble 500 mL av endotelial vekstmedier til. Porsjoner av 2 x 10
4 HUVECs i 200 ul av endoteliale basalmedium ble podet inn i de øvre kamrene. Både øvre og nedre kammer inneholdt sorafenib eller SB225002 på de angitte konsentrasjoner. Etter analysen løp i 24 timer ved 37 ° C, ble ikke-migrerte celler fjernes fra den øvre overflaten av filteret ved hjelp av bomullspinner. Celler på den nedre overflate av membranen ble fiksert med iskald metanol og farget med krystallfiolett. Cellene ble telt under en optisk mikroskop (× 40).
spheroid analysen
Skov-3 celleklumper ble dyrket ved hjelp av flytende overlegg metoden [24]. Celler ble platet ut i agarose-belagte 96-brønners plater inneholdende 200 ul medium (2000 celler /brønn). Celler ble inkubert i 72 timer inntil kulene dannet. Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av sorafenib eller SB225002. Annenhver dag, vi erstattet 100 ul gamle medium med frisk medium og narkotika. Spheroids ble overvåket i opp til 10 dager. Størrelsen på kulene ble målt ved hjelp ImageJ programvare (https://imagej.nih.gov/ij/).
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry (IHC) data kvantifisering er beskrevet i støttemetoder ( S1 File). Vi brukte antistoffer spesifikke for CD-31 (Abcam, katt ab28364 #) og Ki-67 (Abcam, katt # ab16667) for å bestemme microvessel tetthet og tumor celleproliferasjon, henholdsvis. Totalt CXCR2 uttrykk i tumor og stromaceller ble bestemt i muse xenografttumorer hjelp av anti-CXCR2 antistoff (Abcam, katt # ab14935).
Gene uttrykk for ELR
+ CXC kjemokiner
transkriptomet sekvensering ble utført ved hjelp av Illumina MiSeq sequencer og Illumina TruSeq RNA v2 prøveopparbeidelse kit og protokoller (Illumina, Inc.). Prøveopparbeidelse og bibliotek konstruksjon er beskrevet i støttemetoder (S1 File).
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med gjennomsnitt ± standardavvik (SD) verdier ved hjelp av t-test, med mindre annet er angitt. Statistisk signifikans ble satt til
P
0,05. Legemiddelkombinasjonen data ble analysert ved Calcusyn programvaren ved hjelp av median-effekt metoden Chou og Talalay [25]. Immunhistokjemi data ble analysert ved hjelp ImageJ programvare. Kort metoder er gitt i de underliggende data. Vi brukte GeneSifter programvare (Geospiza, Inc.) for å analysere data fra våre studier av genekspresjon i xenografttumorer.
Resultater
In vivo
fenotypisk svulst motstand mot antiangiogen behandling
Vi observerte tumorvekstinhibitering for opptil tre ukers behandling med sorafenib (fig 1A). Etter denne første responsive periode, noen svulster begynte utvikler seg, noe som gjenspeiles av økt tumorstørrelse til tross for fortsatt behandling. I løpet av de to-måneders behandlingsperiode, 10 av 19 (53%) xenograft mus viste tumorprogresjon og gjenvekst. Ingen av musene ble syke eller døde før den eksperimentelle endepunktet. Data fra IHC-farging avslørte den typiske antiangiogene bestandige signatur i tumorvev (figur 1B). Tumor fartøy tetthet (CD-31), og celleproliferasjon (Ki-67) var signifikant høyere (2-4 ganger,
P
0,05) i svulster som gått fra behandling enn i responsive svulster (Fig 1C), noe som tyder på at de progressive svulster var i stand til å gjenoppta angiogenese og derved tumorveksten.
A) Skov-3 xenotransplantater ble behandlet i åtte uker med 30 mg /kg sorafenib via daglig oral sonde. Kontroller ble behandlet med behandlingsmidlet alene. Tumorvolumene ble målt to ganger i uken og er representert som mm
3 ± SEM. Ut av 19 mus, 10 utviklet resistens mot de sorafenib behandling. Svart, rød og grønne linjer angir gjennomsnitts tumor volum progresjoner av kontroll, SR, og SS mus, henholdsvis. En vesentlig forskjell i tumorvolum (*
P
0,05) ble observert mellom behandlingsresistente og-følsomme grupper, som starter i uke fem av behandlingen. SS = sorafenib følsomme; og SR = sorafenib bestandig. B) Representant farging for CD-31 (øverste rad), og Ki-67 (nederste rad) i kontroll, sorafenib følsomme (SS), og sorafenib bestandig (ER) svulster. C) Fartøy tetthet (CD-31) og spredning indeks (Ki-67) ble signifikant økt i sorafenib-resistente svulster sammenlignet med sorafenib følsomme svulster.
Dynamiske endringer av sirkulerende angiogene faktorer som svar til anti-VEGF behandling
for å identifisere endringene i utskilt angiogen og cytokin signalering, sammenlignet vi sirkulerende angiogene faktor konsentrasjoner i plasmaprøver hentet fra behandlings følsom og-resistente mus. Prøver ble tatt i løpet av de reagerende (2-3 uker etter behandling) og ildfaste faser (6-8 uker etter behandling). Fordi tumor blodkar i xenografter er dannet av mus endothelial stamceller, brukte vi multiplex angiogene paneler for både mus og mennesker, å skille opprinnelse.
I løpet av de tre første ukene av behandlingen, var det ingen signifikante forskjeller mellom konsentrasjoner av angiogene proteiner i noen grupper (figur 2A). Når fenotypisk resistens dukket opp 6-8 uker etter behandling, angiogene faktor forskjellene var tydelig mellom gruppene. Forskjellige mus-stammer angiogene faktorer, inkludert fibroblast vekstfaktor (FGF) -2, hepatocytt-vekstfaktor (HGF), KC, og prolaktin, ble oppregulert i den sorafenib-resistente gruppe, men ikke i den sorafenib følsomme gruppen (2A) . I det ildfaste fase, tumor-utskilt CXCL8 (IL-8) nivåer øket 4 folder (
P
0,05). I sorafenib-resistente svulster
A) Brett endringer i sirkulerende angiogenic faktorer mellom behandlingsresistent og følsomme grupper under responsive (2-3 uker) og resistente (6-8 uker) faser hos mus behandlet med sorafenib. Både mus (stroma) og human (tumorceller) løselige angiogene faktorer ble kvantifisert ved multipleks-analyse. Bare angiogene faktorer som ble oppdaget fra både mus og menneske arrays er representert som Logg
2 fold endringer av behandlingsresistent versus behandlingssensitive xenografter. Signifikant (
P
0,05) endringer mellom reagerende og resistente faser er angitt med stjerne (*). B) Tidsavhengig sammenligning av plasma IL-8 konsentrasjon (pg /ml ± S.D.) mellom behandlingsresistent (SR) og små bokstaver (SS) grupper av mus behandlet med sorafenib. Tid profiler av plasma IL-8 var i samsvar med tumor progresjon av fenotypiske bestandige og følsomme svulster. I løpet av behandlingen, ble plasma oppsamlet ukentlig etter forskjøvet prøvetakingsmetoden, og IL-8-nivåer ble målt ved hjelp av multipleks-analyse. C) Illumina sekvensering analyse av menneskelig og mus ELR
+
CXC
chemokin genuttrykk. Menneskelig ELR
+
CXC
chemokin genuttrykk analyse viste at
CXCL6
uttrykk var signifikant høyere i motstandsdyktig gruppen (2,5 ganger høyere,
P
0,05) enn i den sensitive gruppen. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom sorafenib-sensitive og resistente-grupper for CXCL1, 2, 3, 4, 5, og 7 ekspresjonsnivåer. Mus ELR
+
CXC
chemokin genuttrykk analyse viste at alle angitte cytokiner, med unntak av
Cxcl2
, var betydelig høyere i resistente grupper ( 2 folder,
P
0,05) enn de følsomme grupper. SS = sorafenib følsomme; og SR = sorafenib bestandig. D) CXC kjemokin-plasmakonsentrasjoner (pg /ml) i SKOV-3-xenograft mus. CXCL1, CXCL2, og CXCL6 nivåene var signifikant (
P
0,05). Høyere i sorafenib bestandig grupper enn i sorafenib-sensitive grupper
Vi har også kvantifiseres IL-8 nivåer ukentlig i opptil åtte uker med sorafenib behandling. For inntil 4 uker med sorafenib administrasjon, fant vi ingen signifikante forskjeller i IL-8 nivå mellom behandlingssensitive og-motstandsdyktig grupper (figur 2B). Starter på uke fem, betydelig forhøyet (
P
0,05) nivåer av IL-8 ble registrert i sorafenib-resistente svulster. Disse resultatene indikerer at IL-8 nivåer dynamisk endret seg over tid, samtidig med tidsprofilen for tumorprogresjon. I tillegg til IL-8, data fra vår genuttrykk studie (figur 2C) og cytokin multiplex analysen (figur 2D) viste at uttrykket av andre ELR
+ CXC chemokiner (f.eks CXCL1, -2, -5, og – 6) var høy ved behandlingsresistent svulster, sammenlignet med sine kolleger.
CXCR2 uttrykk i ovarietumorer
Vi utførte CXCR2 flekker i xenografttumorer sorafenib behandlinger for å sammenligne sitt uttrykk (fig 3A) i følsomme og resistente grupper. CXCR2 uttrykk ble forhøyet i resistente svulster sammenlignet med sensitive og kontroll svulster. Vi observerte en tredobling i resistente svulster sammenlignet med sensitive svulster (
P
0,05, figur 3B). I sorafenib behandlingsgruppen
A) Representant farging for CXCR2 i kontroll, sorafenib- sensitive (SS), og sorafenib bestandig (ER) svulster. B) CXCR2 uttrykk ble forhøyet i sorafenib-resistente svulster (
P
. 0,05) sammenlignet med sorafenib følsomme svulster
In vitro
synergieffekter av sorafenib og SB225002
Basert på ovennevnte funn av oppregulering av CXCR2 uttrykk og flere ELR
+ CXC proangiogenic cytokiner som medierer sine angiogene effekter via CXCR2 reseptor, undersøkte vi CXCR2-mediert cytokin effekter ved hjelp SB225002, en lite molekyl inhibitor av kjemokinreseptor CXCR2 (IL-8R), i kombinasjon med sorafenib
in vitro
. Vi valgte CXCR2-reseptor-inhibitorer enn anti-CXC kjemokin-antistoffer for å unngå overflødig funksjon av ELR
+ CXC kjemokin signalering. Kombinasjonen av sorafenib og SB225002 produsert betydelig høyere veksthemming (
P
0,005) i tumorceller og HUVECs enn gjorde hver behandling alene (fig 4A og 4B). CI verdier ved ulike konsentrasjonsforholdene i Skov-3 (0,32 til 0,61) og HUVECs (0,87 til 1,1) indikerte synergien eller additivity mellom SB225002 og sorafenib. IC
50 verdier av sorafenib og SB225002 i de testede eggstokk-kreft-cellelinjer og HUVECs er anordnet i støttedata (S1 Table). Konsentrasjon-effektkurver for kombinasjonsbehandling sammenlignet med sorafenib alene er vist i S1 Fig.
SB225002 betydelig forbedret veksthemmende effekter av sorafenib på SKOV-3 (A) og (B) HUVEC-celler. A) En blanding av 10 uM sorafenib og 4 uM SB225002 synergistisk hemmet veksten av SKOV-3-celler, sammenlignet med hvert legemiddel alene (
P
0,005). B) En blanding av 4 uM sorafenib og 2 uM SB225002 synergistisk hemmet veksten av HUVEC-celler, sammenlignet med hvert legemiddel alene (
P
0,01). C) Representative bilder av rør-analysen av HUVECs behandlet med eller uten 1 mM SB225002 eller 2 uM sorafenib. Tube formasjonen ble analysert ved hjelp av Wimtube analyse programvare og rørlengde er presentert i piksler. Tilsetting av SB225002 å sorafenib behandling induserte en statistisk signifikant reduksjon i HUVECs tube formasjonen (
P
0,005). Data er vist som midlere rørlengde i piksler ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. D) Representative bilder av HUVECs migrasjon analysen ved hjelp av transwell kammeret. For å kvantifisere trekkende celler, ble tre uavhengige felt av trekkende celler per brønn fotografert under fasekontrastmikroskop. Antall celler per felt ble tellet og beregnet. Celletall er uttrykt som relative antall celler migrert til nedre side av transwell kammer med resultatene fra kontrollcellene gis som 1. Den hemmende effekten av sorafenib (2 uM) på migrering ble betydelig forbedret ved en uM SB225002 (
P
0,01). E) Spheroidal veksten er svekket av CXCR2 hemming i Skov-3 celler. Spheroid områder ble målt ved hjelp ImageJ programvare. De representerte på y-aksen verdiene er piksler ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
endotel tube dannelse og migrasjon er viktige kjennetegn ved tumor angiogenese. Vi utførte Transwell kammermigrasjons analyser og matrigel baserte rør formasjons analyser ved anvendelse av HUVECs å evaluere den antiangiogene potensialet i sorafenib og SB225002 i kombinasjon. Som vist på figur 4C, den sorafenib (2 uM) og SB225002 (1 uM) kombinasjonsbehandling nesten fullstendig undertrykt HUVEC rør formasjon. Kombinasjonen av sorafenib og SB225002 betydelig hemmet endothelial tube lengde sammenlignet med sorafenib (≥ 2 ganger,
P
0,005) eller SB225002 (≥ 3 ganger,
P
0,005) alene. I tillegg resultater fra transwell migrasjon analysen viste at SB225002 betydelig forsterket sorafenib hemming av endothelial migrasjon (fig 4D). Denne kombinasjonen førte til en tilnærmet dobling nedgang av HUVECs migrasjon sammenlignet med sorafenib og SB225002 behandlinger alene (
P
0,01). Til sammen disse resultatene tyder på at kombinasjonsbehandling av sorafenib og SB225002 kunne gi en betydelig forringe angiogene potensialet HUVECs
in vitro
.
Siden IL-8 spiller en rolle i tumorceller aggregering, vi utført en spheroid analyse for å studere effekter av sorafenib og SB225002 på spheroid vekst. SB225002 forstyrret dannelsen av Skov-3 kuler på en 2 mM konsentrasjon: sorafenib ikke (figur 4E). En kombinasjon av sorafenib og SB225002 redusert vekst av kuler (Fig 4E).
SB225002 og sorafenib kombinasjonsbehandling i sorafenib bestandig xenograft mus
Vi har evaluert effekten av kombinert behandling i sorafenib- videre resistente tumorxenotransplantater
in vivo
. Vi behandlet mus med sorafenib inntil xenografttumorer utviklet resistens. Etter 46 dager med sorafenib behandling, mus med sorafenib bestandig svulster mottatt sorafenib, SB225002, eller en kombinasjon av de to stoffene. Svulster som behandles med sorafenib alene kommet, men gjorde det saktere enn kontroll tumorer (fig 5). Tumorprogresjon ble betydelig undertrykt når SB225002 ble lagt til sorafenib (fig 5). Ved slutten av behandlingen, tumorer fra mus som fikk kombinasjonsbehandlingen var 42% mindre i volum enn tumorer fra mus som mottok sorafenib alene. Interessant, behandling med SB225002 alene ikke hemme tumorvekst som utviklet seg fra sorafenib behandling, noe som tyder på behovet for fortsatt blokkering av VEGF signalveien. Våre resultater viser at den kombinerte CXCR2 inhibering med sorafenib effektivt lindret tumorprogresjon og tilgjengelig forlenget terapeutisk effekt.
SKOV-3-xenotransplantater ble behandlet med en daglig dose på 30 mg /kg sorafenib inntil tumorene utviklet fenotypisk resistens til behandlings (~ 46 dager). Mus med resistente svulster ble deretter randomisert i grupper for å få en av følgende: 30 mg /kg sorafenib alene (
n
= 6), 10 mg /kg SB225002 alene (
n
= 6 ), eller sorafenib pluss SB225002 (
n
= 6). Pilen indikerer starten av behandlingen på dag 46. Tumorvolumet ble målt ved de angitte tider og er presentert som gjennomsnitt ± S.D. Den sorafenib og SB225002 kombinasjonen førte til 42% reduksjon i tumorvekst sammenlignet med sorafenib alene (
P
0,05).
Diskusjoner
Angiogenese spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft i eggstokkene. Ovarietumorer er rikt vaskularisert, og en høy grad av tumor angiogenese i ovarietumorer spår dårlig klinisk utfall [1, 2, 26]. Ovarian tumorer som over proangiogenic faktorer, inkludert VEGFs, FGF, Angiopoietin, plate avledet vekstfaktorer (PDGFs), og flere pro-angiogene cytokiner [10]. Hittil har oppmuntrende resultater er oppnådd med eggstokkreft studier som omfatter VEGF-pathway hemmere, terapeutisk antistoff bevacizumab og små molekyl reseptor tyrosin kinase hemmere (TKI) [27]. Legge bevacizumab til kjemoterapi reduserte risikoen for forverring av sykdommen og /eller død med 62% sammenlignet med kjemoterapi alene [8, 28]. Dette funnet førte til den siste FDA-godkjenning av bevacizumab i kombinasjon med kjemoterapi i tilbakevendende sykdom.
