Abstract
Deksametason (Dex) behandlet alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus var tidligere beskrevet som å utvikle fordøyelses adenokarsinom etter massiv infeksjon med
Cryptosporidium parvum
så snart som 45 dager etter infeksjon (PI). Vi forsøkte å bestemme det minimale antall av oocyster i stand til å fremkalle infeksjon og derved gastrointestinale svulster i denne modellen. Mus ble utfordret med kalibrerte oocyst-suspensjoner innehold ment doser på: 1, 10, 100 eller 10
5 oocyster av
C. parvum
Iowa belastning. Alle administrerte doser var infeksiøs for dyr, men økte oocyst utfordring fører til en økning i mus infektivitet (P = 0,01). Oocyste Shedding ble oppdaget på 7 dager P.I. etter inokulering med mer enn 10 oocyster, og etter 15 dager hos mus utfordret med en oocyst. I grupper utfordret med lavere inokula, parasitt vekstfase var signifikant høyere (p = 0,005) sammenlignet med mus inokulert med høyere doser. Etter 45 dager P.I. alle grupper av mus hadde et gjennomsnitt på oocyste shedding overlegne i forhold til 10 000 oocyst /g avføring. Det mest imponerende observasjon av denne studien var demonstrasjonen at
C. parvum
indusert fordøyelses adenokarsinom kan være forårsaket av infeksjon med lave doser av
Cryptosporidium
, selv med bare én oocyste: i mus inokulert med lave doser, ble neoplastiske lesjoner oppdages så tidlig som 45 dager P.I. både i magen og i blindtarmen ileo-region, og disse lesjonene kan utvikle seg i en invasiv adenokarsinom. Disse funnene viser en stor forsterkning effekt av parasitter i mus vev etter utfordring med lave doser som bekreftes av kvantitativ PCR. Evnen til
C. parvum
for å infisere mus med en oocyst og for å utvikle fordøyelses adenokarsinom antyder at andre pattedyrarter inkludert mennesker kan også være utsatt for denne prosessen, spesielt når de er sterkt redusert immunforsvar
relasjon:. Benamrouz S, Guyot K , Gazzola S, Mouray A, Chassat T, Delaire B, et al. (2012)
Cryptosporidium parvum
Infeksjon i SCID-mus infisert med Only One oocyste: qPCR Vurdering av Parasite Replication i vev og utvikling av Digestive kreft. PLoS ONE 7 (12): e51232. doi: 10,1371 /journal.pone.0051232
Redaktør: Gordon Langsley, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE – Institut Cochin, Frankrike
mottatt: 16 september 2012; Godkjent: 31 oktober 2012; Publisert: 13.12.2012
Copyright: © 2012 Benamrouz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Spesifikk støtte ble gitt av katolske Institute of Lille (ICL) inkludert tilskudd til Sadia Benamrouz. Dette arbeidet ble støttet av departementet for forskning, Frankrike (EA3609 /4547 Université de Lille 2), Føderale institutt for forskning 142 (Institut Pasteur de Lille), og den franske National Research Agency (gir No. ANR-09-ALIA-009 og ANR-10-ALIA-004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cryptosporidium
arter over hele verden spredd apicomplexan parasittiske protister som infiserer hovedsakelig mage-tarmkanalen av fisk, amfibier, krypdyr, fugler og mer enn 150 arter av pattedyr, inkludert mennesker [1]. Infeksjonen resultatene fra inntak av
Cryptosporidium
oocyster gjennom forbruk av fecally forurenset mat eller vann eller gjennom direkte person
–
til person eller dyr-til-person kontakt [2]. Alvorlighetsgraden av sykdommen hos pasienter variere fra asymptomatisk til dødelig cryptosporidiosis, avhengig av infiserer art, deres område for infeksjon, alder og immunstatus til verten. Infiserte immunkompetente individer ofte utvikle akutt gastroenteritt mens immunsupprimerte individer blir kronisk, og noen ganger dødelig rammet [2].
I dag er mer enn 20
Cryptosporidium
arter regnes som gyldig [3], og to store arter,
Cryptosporidium parvum Hotell og
C. hominis
, er ansvarlig for de fleste menneskelige tilfeller av cryptosporidiosis [4]. En høy smittende effekt av
Cryptosporidium
isolater fra human eller animalsk opprinnelse ble rapportert [5]. Dermed hos friske frivillige uten serologisk bevis på tidligere infeksjon med
Cryptosporidium
, en oral dose på 30
C. parvum
oocyster forårsaket infeksjoner [5]. Den samme gruppen rapporterte at
Cryptosporidium hominis
ID50 var 10 oocyster [4]. I tillegg ble det også rapportert at et enkelt oocyste av
C. meleagridis
kan produsere et patent infeksjon i steroid-behandlede C57BL /6 mus [6].
For å undersøke de biologiske og patologiske avvik mellom
Cryptosporidium
arter eller belastninger og å bidra til forståelsen av dynamikken i infeksjonen, Certad og medarbeidere utviklet en reproduserbar dyremodell av kronisk cryptosporidiosis ved hjelp av Dex-behandlede voksne SCID-mus [7]. Dyrene ble inokulert enten med
C. parvum
som parasitises tarmkanalen, eller med
C. Muris
som har en tropisme for magen hos mus. Uventet, fant de ved hjelp av denne modellen som et inokulum av 10
5 oocyster av
C. parvum
men ikke
C. Muris
var i stand til å indusere utvikling av invasiv fordøyelses adenokarsinom [7]. Imidlertid, som er minimun antall oocyster stand til å produsere både infeksjon og fordøyelses neoplasi i denne modellen? Spørsmålet er viktig så langt som denne modellen kan brukes til å utforske de fenotypiske egenskaper
Cryptosporidium
prøver isolert fra menneske avføring eller miljø (hovedsakelig vann og mat), der oocyste mengder kan ofte være svært lav. For bedre å beskrive vår dyremodell, utforsket vi den potensielle evne til nylig isolerte
Cryptosporidium
oocyster å indusere både patent infeksjon og gastrointestinale neoplastiske forandringer når de administreres ved svært lav dose.
Materialer og Metoder
Cryptosporidium parvum
oocyster
C. parvum
IOWA oocyster ble kjøpt fra Waterbo
RNE ™, Inc. plakater (New Orleans, Louisiana). Den stamløsning av oocyster ble lagret i skips medium (fosfat-buffret saltvann eller PBS med penicillin, streptomycin, gentamycin, amfotericin B og 0,01% Tween 20) ved 4 ° C inntil bruk. Fravær av bakterier og sopp ble forsikret ved å teste oocyste suspensjoner på Plate Count Agar (37 ° C, 1 uke) og på Sabouraud plater (37 ° C, 1 uke).
Animal kilde
CB17-SCID 6-7 uker gamle hunnmus ble oppnådd fra en koloni avlet og regelmessig kontrollert for å vurdere infeksjoner (inkludert
Helicobacter
spp.) ved Pasteur Institute of Lille (Frankrike). Dyrene ble holdt under aseptiske betingelser i en isolator under hele eksperimentering som tidligere beskrevet [7], [8], [9], [10]. Dyreforsøk ble utført i dyret innretningen av Pasteur Institute of Lille (forskning akkrediteringsnummer, A59107). Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av den franske regional etisk komité (godkjenningsnummer CEEA 112011). Evaluering av aspekter av dyrets tilstand ble utført regelmessig for å oppdage lidelse. Kliniske tegn som kan utgjøre et endepunkt inkluderte, men var ikke begrenset til: rask eller progressive vekttap, svekkende diaré, grov pels, krum holdning, apati eller hvilken som helst tilstand forstyrrer daglige aktiviteter (f.eks å spise eller drikke, bevegelse og, eller eliminering) .
Eksperimentell design
SCID mus ble administrert med 4 mg /l deksametasonnatriumfosfat (Dex) (Merck, Lyon, Frankrike) via drikkevann [7], [11]. Deksametason administrasjon startet to uker før oral inokulering med
Cryptosporidium
oocyster (se nedenfor) og ble opprettholdt under hele eksperimentering. Dex-tilsatt vann ble erstattet tre ganger i uken.
Oocyster ble inokulert i mus ved oral-gastrisk sonde bruker 18-20 måler fôring rør. Hver mus ble inokulert med 200 ul PBS inneholdende forskjellig mengde av oocyster: 1, 10, 100 eller 10
5. For hver dose 4 til 8 mus ble inokulert (gruppe 1 gruppe 4). Negative kontroll mus ble inokulert med PBS (n = 4) eller med et inokulum på 10
5 varmeinaktivert oocyster (90 ° C, 15 min) (n = 4). Etter sonde mus ble plassert i sterile avkortet bur. Infiserte mus ble individuelt for å unngå fysisk kontakt og minimere risikoen for smitte ved å kryss-kontaminering og negative kontrollmusene ble gruppert. Musene ble fulgt opp til 100 dager P.I. for evaluering av smittsomhet og neoplastiske lesjoner utvikling.
Utarbeidelse av kalibrerte oocyste suspensjoner
oocyste konsentrasjonen av
C. parvum
Iowa stamoppløsning ble bekreftet ved å måle in triplo 10 ul-aliquoter. Samplet fraksjoner ble anbragt på en multi-brønn lysbilde, fikk tørke og fiksert med metanol. En direkte immunfluorescens analyse (DFA) med en FITC konjugert anti
Cryptosporidium
monoklonalt antistoff (Cellabs Pty. Ldt., Croissy-Beaubourg, Frankrike) ble gjort. Brønner ble undersøkt ved en forstørrelse på x 400, og de som fluorescerer oocyster ble tellet i 10 tilfeldig valgte mikroskopiske felt. Før inokulering, ble oocyst levedyktighet av stamløsningen estimert ved en trypsin-taurocholat excystation test [12]. Basert på den excystation sats (50%), ble seriefortynninger utført for å fremstille alle doser. Dosene av ≤ 100 oocyster ble fremstilt i 6 porsjoner av 200 ul: 5 aliquoter ble verifisert for å vurdere mulige avvik med den tiltenkte inokulum og den siste prøve ble inokulert i mus. Verifisering av mengden av oocyster i hver prøve ble utført ved filtrering av prøver gjennom en 0,4 um 25 mm sort polykarbonat filter. Deretter ble en DFA utført på filteret, som tidligere beskrevet. Hele Filteret ble deretter montert på et objektglass med Citifluor monteringsmedium (Biovalley). Oocyster som er tilstede på hele overflaten av filteret ble talt (ved en forstørrelse på 400) ved manuell skanning på en epifluorescens mikroskop (Axioplan 2, Zeiss). Gjennomsnittet av smitte oocyster telles etter verifisering av porsjoner er representert i tabell 1.
oocyste Shedding vurdering
For å evaluere oocyste Shedding i løpet av
Cryptosporidium
infeksjon, fersk utskilles ekskrementpelletene ble samlet tre ganger i uken. Hver mus ble overført til et rent bur i løpet av 30-60 min. Feces ble plassert i en microtube og veiet før tilsetning og homogenisering i sterilt MilliQ vann. Påvisning og kvantifisering av oocyste garnet røyter ble gjort av immuno-magnetisk separasjon (IMS) med Dynabeads anti-
Cryptosporidium
kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike) i henhold til leverandørens anbefaling og som tidligere beskrevet [8] , [10]. Den oocyste suspensjon var å legge ned på immunofluorescence lysbilder, og merket med en FITC konjugert anti
Cryptosporidium
monoklonalt antistoff (Cellabs Pty.Ldt., Croissy-Beaubourg, Frankrike). Opplisting av oocyster ble utført på hele overflaten av hver brønn ved en forstørrelse på x 400 og antallet parasitter ble uttrykt pr gram avføring. Smittsomhet ble uttrykt som andel av dyrene som ble smittet ved hver dose.
Histologisk analyse og immunhistokjemi
Med jevne mellomrom eller når tegn på snarlige død dukket opp, ble musene avlivet av CO
2 innånding . Mage og ileo-blindtarmen regioner ble fjernet fra hver mus, fiksert i 10% nøytral formalin og innstøpt i parafin. Deler av fem mikrometer tykk ble farget av hematoxylin-eosin (Leica Autostainer-XL, Rueil-Malmaison, Frankrike) eller brukes til immunhistokjemi.
Skader på forskjellige steder ble scoret i henhold til «Nomenklatur for histologiske Vurdering av Intestinal svulster i gnager «, og sammenlignet med» Vienna klassifiseringen «av epitel neoplasi i mage-tarmkanalen for mennesker», som tidligere med små modifikasjoner [8], [10]. Kort: 0, ingen lesjon; 1, betennelse og /eller regenerative forandringer; 2, lavgradig intraepitelial neoplasi (LGIEN); 3, høy klasse intraepitelial neoplasi (HGIEN), carcinoma in situ (begrenset til epitelet) eller intramucosal adenokarsinom (invasjonen i lamina propria gjennom basalmembran av kjertler). 4, submucosal adenokarsinom når kjertler trenge gjennom muscularis slimhinne; 5, invasiv adenokarsinom med invasjonen gjennom muskularis inn i subserosa.
Følgende histochemical og immunhistokjemiske analyser ble utført ved hjelp av referanse XT fargingsmodulen (Ventana medisinsk system, Meylan, Frankrike).
den Volgens-Gomori flekk (retikulin) [13] ble benyttet for vurdering av basalmembran integritet. Et monoklonalt antistoff fra mus til cytokeratin (ufortynnet) (AM071-5 M; Biogenex, Nederland) ble brukt til å markere epitelceller. Muskelfibrene ble farget ved hjelp av en anti-alfa glatt muskel aktin monoklonalt antistoff (fortynning 1:100) (M0851, Dako, Danmark). Seksjonene ble undersøkt ved hjelp av en Leica DMRB mikroskop utstyrt med en Leica digital kamera koblet til en Imaging Research MCID analysesystem (MAnrID programvare, Cambridge, Storbritannia).
Kvantifisering av parasitter i mus vev
DNA-ekstraksjon fra formalinfiksert parafin-embedded vevsprøver.
parafin embeded vev fra ileo-blindtarmen regionen fra 17 mus var tilgjengelige for molekylær analyse. DNA ble ekstrahert fra en blanding av 2 deler av 25 pm av hvert vev blokk. Histologiske snitt ble bearbeidet ved hjelp av xylen og etanol i parafinfjerning og ble deretter rehydratisert. Å forstyrre den oocyster, ble prøvene frosset (-80 ° C, 5 min) og tint (99 ° C, 4 minutter) seks ganger, og ble til slutt behandlet med ultralyd i løpet av 1 min. DNA ble deretter ekstrahert med NucleoSpin vev (Machery Nagel, Düren, Tyskland) etter produsentens instruksjoner, bortsett fra at det proteinase K fordøyelsen ble utført over natten.
Sanntids kvantitative PCR (qPCR) analyser.
To TAQMAN systemer ble utviklet:
Cryptosporidium
Taqman assay og in-house mus Taqman assay. Den primere og TaqMan probe brukes til
Cryptosporidium
qPCR assay ble de rapportert av Fontaine og Guillot (2002) [14] som plasseres inne i en bestemt 452 bp sekvens (GenBank tiltredelse antall AF188110) til stede i ett eksemplar i genomet. Forover- og revers primere forsterket et 138 bp fragment. Den fluorescerende TaqMan probe ble merket ved 5 «enden med 6-karboksy-fluorescine (FAM) reporter fargestoff og ved 3′ ende med det sorte hullet drikk en fargestoff (BHQ-1). For musen Taqman-analyse, målet var beta-aktin-gen (GenBank deponeringsnummer AC144818), et enkelt-kopi-antall husholdningsgenet. Den fremre (5»-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3 «) og bakover (5′-CTGAGAAGCTGGCCAAAGAGA-3′) primere ble konstruert for å amplifisere en 68-pb-fragment. Det fluorescerende TaqMan probe (5»-CCCAGGTCAGTATCCCGGGTAACCC-3 «) ble merket i 5′-ende med Hexachloro-6-karboksy-fluorescein (HEX) reporter fargestoff og ved 3»-enden med den BHQ-en quencher fargestoff.
hver amplifikasjon ble utført i en 25-ul reaksjonsblanding som inneholdt 1 x iQ ™ Supermix (Bio-Rad, Frankrike), 400 nM av hver
Cryptosporidium
primer eller 200 nM av hver primer aktin, 100 nM av
Cryptosporidium
sonde eller 50 nM av beta-aktin sonde og 5 mL av DNA-prøve. QPCR reaksjoner ble utført på en Rotor-Gene 6000 instrument (Corbett Research, Qiagen, Frankrike) og inkludert en innledende denaturering ved 95 ° C i 15 minutter, fulgt av 49 sykluser med denaturering ved 95 ° C i løpet av 15 s og gløding /forlengelse ved 60 ° C i løpet av 1 min. Fluorescenstilgangen ble gjort umiddelbart etter hver gløde /forlengelsestrinn.
Alle prøver ble målt in triplo i hver analyse og negative kontroller uten templat ble inkludert i hver PCR-kjøring. For å omgå effekten av PCR-inhibitorer, ble hver DNA-ekstrakt testet i ren eller fortynnet 10 og 100 ganger. Forsterkning og dataanalyse ble utført med Rotor-Gene 6000 Software.
Kvantifisering standarder og normalisering av parasitter i vev.
Spesifikke eksterne standarder ble konstruert for begge målgener av interesse ved å klone fragmentet i et plasmid.
Cryptosporidium Kjøpe og vev standardkurver ble deretter generert fra seks serielle fortynninger av plasmid DNA med kjente mengder av inngangskopiantall i hver reaksjon. Lineær regresjon av de standarder fortynningsserier og beregning av den tilsvarende R «sup> 2-verdiene ble utført ved anvendelse av rotor-genet programvare. Nøyaktighet av absolutt kvantifisering bygger på antagelsen om at DNA forsterkning effektivitet er lik mellom standard og de testede prøvene. For å teste en mulig påvirkning av plasmid DNA i genomisk DNA kvantifisering, linearitet og effektivitet i begge qPCR analyser ble også evaluert med både genomisk
Cryptosporidium Hotell og muse DNA. Antallet
Cryptosporidium
genom og murine beta-aktin genkopier i amplifikasjonsreaksjoner ble automatisk beregnet ved hjelp av programvare under henvisning til de ytre plasmidic standardkurver. For nøyaktig sammenligning av parasitt infeksjon i vevsprøver ble mengden av total vert-DNA i hver prøve normalisert ved TaqMan qPCR av det murine beta-aktin-genet. Kvantitativ parasittbelastning data ble derfor uttrykt som forholdet mellom den
Cryptosporidium
genom nummer over musegenomet tall for hver prøve. Men for enkleste sammenligning mellom prøvene, variasjoner i prøvelast ble korrigert ved normalisering av
Cryptosporidium
genom eksemplarer til 10
6 beta-aktin kopier.
Statistisk analyse
Fishers eksakte test (tosidige) ble brukt til å analysere smittsomhet (sammenligne gruppene smittet med doser dårligere til 10 eller bedre enn 10 oocyster) eller parasitt belastninger i vev. En analyse av varians (ANOVA) ble gjennomført for å redegjøre for virkningene av relevante faktorer (podestoffer, dagen etter injeksjon) og deres interaksjoner på daglig oocystekskresjon. Dataanalyse ble utført med den statistiske programvaren Graphpad. Signifikans ble definert som P 0,05
Resultatene
For å evaluere den infeksjon mottakelighet hos mus utfordret med kalibrerte suspensjoner inneholdende forskjellige påtenkte doser, ble mengden av oocyst i feces beregnet periodisk.. Alle administrerte doser inneholdende forskjellige mengder av oocyster avslørt å være infeksiøs for Dex-behandlede SCID-mus, men øker oocyst doser føre til en økning i nivået av smittsomhet (P = 0,01). To av 7 mus (28,5%) inokulert med en beregnet dose av en oocyst, 6/8 mus (75%) som mottar en beregnet dose på 10 oocyster, og alle mus inokulert med tiltenkte doser på 10
2 og 10
5 levedyktige oocyster utviklet kronisk infeksjon til aktiv dødshjelp (45-100 dager PI). Ingen av de negative kontrollmusene utladet oocyster etter oral inokulering med enten PBS eller 10
5 varmeinaktiverte oocyster (Tabell 1).
Mønsteret for oocyst shedding av de forskjellige gruppene er vist i fig. 1. Ved dag 7 P.I. oocyst shedding ble detektert i mus fra gruppe 2, 3 og 4 (utfordret med 10, 100 og 10
5 oocyster), men ikke hos dyr fra gruppe 1 (utfordret med en oocyst). Parasite Shedding av dyr fra denne siste gruppen ble påvist for første gang etter 15 dager P.I. ANOVA-analyse av hele datasettet viste at dagen P.I. og inokulum størrelse i betydelig grad å påvirke den geometriske middel for oocyst sheding (P = 0,02 og 0,005, respektivt): ved 75 dager PI, mus inokulert med tiltenkte doser på 1, 10, 100 og 10
5 oocyster hadde en multiplikasjon av 3,3 , 3,25, 2,26 og 1,45 log henholdsvis i forhold til startinokulum. Etter 45 dager etter infeksjon, alle grupper av mus har et gjennomsnitt på oocyste shedding overlegne i forhold til 10 000 oocyst /g bekrefter den høye formeringshastigheten av parasitt vekst ved lavere doser.
Eksperimentelle grupper ble inokulert med tiltenkte doser på 1 , 10, 100 og 10
5 oocyster. Hvert punkt representerer en mus, linjene blir de geometriske hjelp av oocyste Shedding per gruppe. Kun dyr med oocyste Shedding på et bestemt tidspunkt på dagen er representert. Ingen av mus infisert med en oocyste utgitt parasitter til dag 15 (se materiale og metoder for oocyste Shedding vurdering).
Etter histologisk undersøkelse av vev, gastrointestinale neoplastiske lesjoner (Tabell 1) ble observert i alle Dex -behandlet SCID-mus infisert av
C. parvum
, uansett podestoff (figur 2).
A. Invasiv adenokarsinom i antropyloric regionen (piler) i en muse 100 dager P.I .. Bar = 1250 mikrometer (hematoxylin og eosin). B. Invasive adenokarsinom i antropyloric regionen i en mus 100 dager P.I. viser parasitter inne i kjertler (piler). Bar = 50 mikrometer (hematoxylin og eosin). C. Adenom av ileo-blindtarmen som region i en mus 45 dager P.I .. Bar = 625 mikrometer. D. Høy klasse intraepitelial neoplasi i ileo-blindtarmen som region i en mus 45 dager P.I. med mange parasitter (pil) inne i kjertler. Bar = 25 mikrometer (hematoxylin og eosin).
I magen, ble neoplastiske lesjoner lokalisert i antropyloric regionen og ble oppdaget så tidlig som dag 45 P.I. i alle grupper av infiserte mus. På dag 45 P.I. Disse lesjonene ble beskrevet som lavgradig intraepitelial neoplasi (LGIEN) eller invasiv adenokarsinom for grupper 1 og 2, og som høy klasse intraepitelial neoplasi (HGIEN) eller invasiv adenokarsinom for gruppe 3 og 4 (tabell 1). På dag 100 PI, observerte vi nærvær av adenokarsinom i submucosa invadere det ytre muscularis laget i antro-pylorique regionen til en mus inokulert med en enkelt oocyste (figurene 2A, 2B).
I ileo- blindtarmen som region, med tiltenkte doser på 1 og 10 oocyster en polypoid slimhinne (adenom) som inneholder LGIEN og HGIEN lesjoner ble observert henholdsvis 45 og 100 dager PI (Tall 2C, 2D). Med større podestoff (100 oocyster) HGIEN ble observert tidligere (dag 45 P.I.). Retikulin farging og cytokeratin immuno-merking tillot bekreftelse på HGIEN: Det ble observert en fragmentert basalmembran og neoplastiske epitelceller i lamina propria. Disse endringene, som er typisk for intramucosal adenokarsinom, ble observert hos mus i gruppe 3, etter bare 80 dager PI. Neoplastiske lesjoner syntes å være mer alvorlig i magen enn i ileo-blindtarmen som region.
For kvantitativ analyse av
Cryptosporidium
DNA i ileo-blindtarmen som vev, 17 mus ble valgt. Standardkurver generert for begge
Cryptosporidium
og beta-aktin viste en reproduserbar lineær sammenheng mellom Ct-verdien og log transformert antall kopier i løpet av nesten fem størrelsesordner av DNA fortynning. Korrelasjonskoeffisient erholdt ved lineær regresjonsanalyse av tre uavhengige eksperimenter var R «> 2 = 0,99 for begge
Cryptosporidium
og mus plasmider. DNA forsterkning effektivitet var 99% for
Cryptosporidium Hotell og 89% for mus. Standardkurver ble også utført med
Cryptosporidium
genomisk DNA samt mus genomisk DNA. For begge plotting av de delta Ct-verdiene (Ct plasmid-DNA – Ct genomisk DNA) mot logaritmen av fortynningsfaktorer resulterte i en kurvehelling lavere enn 0,1 (data ikke vist), noe som viser at plasmid-DNA kan brukes til å kvantifisere genomisk DNA .
antall
Cryptosporidium
og mengden av muse-DNA til stede i hver prøve ble kvantifisert ved interpolering av de tilsvarende Ct-verdiene i standardkurver for
Cryptosporidium
DNA og for muse-beta-aktin-genet. Nivåer av parasitt-DNA i vev av undersøkte dyr er vist i tabell S1. I alt ble 14 av 15 undersøkte inokulert mus kolonisert med
Cryptosporidium
.
Parasitten belastning i vev av mus inokulert med høyere podestoff (10
5) ble høyere sammenlignet med mus inokulert med lave doser (≤ 100 oocyster) (s 0,001). Imidlertid, når man sammenligner vev belastninger samtidig P.I. (45 dager) mellom den laveste og høyeste inokulum, mus N ° 12, inokulert med 100.000 ganger mer enn oocyster mus N ° 1, hadde bare 3,6 ganger mer parasitt belastninger. Nei
Cryptosporidium
DNA ble funnet i en mus (N ° 7) inokulert med 10 oocyster (Tabell S1). Denne musen utviklet verken infeksjon eller neoplastiske lesjoner, som bekreftes også av IMS-DFA.
For 6 prøver,
Cryptosporidium
qPCR var ikke positivt for alle 3 replikater forutsatt en Poisson fordeling av malen når detektere svært lave kopiantall av målet. For slike prøver, de oppnådde Ct-verdiene var mellom 39 og 40 som viser at PCR-reaksjonen inneholdt teoretisk en genomet kopi. Faktisk var deteksjonsgrensen for analysen nådd, og vi kan ikke forsøke kvantifisering med en akseptabel grad av nøyaktighet og pålitelighet. Kjøringer av
Cryptosporidium
qPCR ble testet med prøvene til en lavere fortynning punkt for å oppnå lavere Ct-verdier. Usannsynlig, de ble ikke validert på grunn av en negativ PCR resultat (Ct fravær) eller fordi den gjennomsnittlige endringer i Ct ikke produserte den forventede endring (respektere 10-gangers fortynning).
Histologiske forandringer var alltid forbundet med tilstedeværelse av parasitter som det ble observert ved mikroskopi (figurene 2B, 2D) og qPCR (tabell S1). DNA påvisning av parasitter gjennom qPCR bekrefter at selv mus med lavest parasitter belastninger i vev hadde neoplastiske lesjoner. Verken parasitter eller lesjoner ble oppdaget i negative kontrollgrupper (mus inokulert med PBS uten parasitter eller med varmeinaktiverte oocyster) (tabell 1, S1).
Diskusjoner
Dagens funn viser at Dex -behandlet SCID-mus er mottakelige for infeksjon med ekstremt lav
C. parvum
inokulum Størrelser på 1 og 10 oocyster. Disse inokulert kalibrert doser ble vurdert flere ganger av mikroskopisk observasjon (se Materiale og metode og tabell 1). Denne dyremodell for Dex behandlede SCID-mus avslørte å ha en høy følsomhet for
C. parvum
infeksjon og kan være svært nyttig for å vurdere tilstedeværelsen av denne parasitten i kliniske eller miljøprøver der oocyster priser kan være svært lav (for eksempel vann fra springen, spiselige grønnsaker, insekter).
Vi har sammenlignet våre resultater med data rapportert tidligere for en annen dyremodell av kortikosteroidbindende behandlet C57BL /6N mus infisert med en oocyste av samme
C. parvum
Iowa isolere [15]. De fant 17% av smittsomhet etter inokulering med en enkelt oocyste sammenlignet med 29% i vår studie [15]. Ettersom disse forfatterne også diskutert, kan forskjellige grunner forklare det faktum at ikke alle mus ble smittet med et enkelt parasitt [15]: den oocyst var ikke tilstede i inokulum på grunn av seriefortynning metoden, oocyst kunne forbli i målermaterøret under inokulasjon, den oocyste var ikke i stand til å nå tarmen, eller det var ikke levedyktig på tidspunktet for vaksinasjon (en levedyktighet på 50% målt i aksje suspensjon).
i tillegg, i vår studie dyr utfordret med lav inokulum utviklet kronisk infeksjon og skur oocyster uten stasjonær eller nedgang fase til slutten av forsøket.
modellen av immunosupressed C57BL /6 voksen mus [15] ble testet også for utbredelsen av
C. meleagridis
(arter fra fugler) og 50% av musene utfordret med et enkelt
C. meleagridis
oocyste ble smittet [16]. Men til tross for dyp immunosvekkelse av SCID-mus, forsterkes ytterligere av Dex forvaltningen, disse dyrene var tilsynelatende ikke utsatt for isolater av andre
Cryptosporidium
arter som
C. meleagridis product: (upubliserte observasjoner),
C. hominis product: (fra mennesker) eller
C. molnari product: (fra fisken
Sparus auratus
) [10]. Således, som det er blitt beskrevet for andre opportunistiske parasittsykdommer, kan immunosuppresjon være ikke nok til å bryte den art barrieren (eller vert-artsspesifisitet) [17].
Likevel er den mest imponerende observasjon av den foreliggende arbeid er den demonstrasjon at infeksjon med lave doser, selv med bare en oocyst av
C. parvum
kan føre til utvikling av fordøyelses invasiv adenokarsinom. Vi demonstrerte før at vår modell av Dex behandlet SCID mus var nyttig å vurdere muligheten for
C. parvum
å indusere fordøyelses adenokarsinom i dyr inokulert med doser mellom 10
5 og 10
8 oocyster [7], [8], [10] men minimum antall oocyster som kan indusere disse slags lesjoner var ikke kjent til nå. Faktisk, som det tidligere ble observert etter infeksjon med høyere podestoffer (10
5-10
7) av
C. parvum
Iowa belastning [7], [10], i denne studien neoplastiske lesjoner (LGIEN og HGIEN) ble oppdaget så tidlig som dag 45 P.I. både i magesekken og i den ileo-blindtarmen region av Dex behandlede SCID-mus utfordret med ment doser på 100, 10 eller til og med en oocyst, og disse lesjonene kan også utvikle seg i en invasiv adenokarsinom utvikler seg gjennom alle lagene i mage og ileo-blindtarmen region.
Jevnt, observerte vi at i mus inokulert med lav inocula parasitten utskillelse økte raskt, og nådde et gjennomsnitt på oocyste Shedding av mer enn 10 000 oocyste /g avføring på 45 dager PI. det virker som de få oocyster inokulert til mus hadde en viktig multiplikasjon, og at en økning i oocyste vaksinert doser heve nivået på smittsomhet, men ikke nødvendigvis utgytelsen av parasitter og patologisk utfall.
i eksperimentelle infeksjoner av immunkompetente dyr, ulike observasjoner har blitt rapportert. Hos storfe, etter vaksinasjon med så lite som en rød blodceller infisert med
Babesia bovis
, en annen apicomplexan parasitt, var det en økning i prepatent perioden (som vi også observert), men høy sykelighet og dødelighet av dyr ble ikke endret i forhold til de som er smittet med høyere podestoffer [18]. Disse funnene er i motsetning til de for infeksjoner med haemoparasite
Theileria parva
, hvor infeksjon av storfe med en lav inoculum resulterte i redusert sykdommens alvorlighetsgrad og lavere dødelighet [19]. Interessant, i studier av
Eimeria
infeksjon av kyllinger og rotter, det var spesielt merkbart at med størst infiserer dose og antallet oocyster produsert pr oocyst inokulert var mindre, [20].
På den annen side, i vårt tidligere studie, den oocyst shedding etter inokulering med 10
5 oocyster var mye høyere [8].
