Abstract
Samler bevis indikerer at epiteliale kreftceller, inkludert nasofaryngeal karsinom (NPC) celler, uttrykte immunglobuliner (IGS). Vi har tidligere funnet at ekspresjonen av kappa-lettkjede-protein i NPC celler kan bli oppregulert ved EBV-kodet latent membranprotein 1 (lmp1). I denne studien har vi brukt NPC cellelinjer som modeller og funnet ut at LMP1-forsterket kappa produksjon tilsvarer med forhøyede ERKs fosforylering. PD98059 demper lmp1-indusert ERK-fosforylering resulterer i redusert ekspresjon av kappa-lettkjede. ERK-spesifikke små interfererende RNA blunts LMP1-indusert
kappa lett kjede
genuttrykk. Luciferaserapportørplasmid analyser viser at immunoglobulin
κ
3 «forsterker (3’E
κ) er aktiv i Igκ-uttrykker NPC celler og lmp1 oppregulerer aktiviteten av 3’E
κ i NPC celler. Videre mutasjon analyse av PU bindingssetet i 3’E
κ og hemming av MEK /ERK sti av PD98059 indikerer at PU nettstedet er funksjonell og lmp1 forbedret 3’E
κ aktivitet er delvis regulert av denne siden. PD98059 behandling fører også til en konsentrasjonsavhengig inhibering av lmp1-indusert Ets-1-ekspresjonen og fosforylering, som korresponderer med en doseavhengig dempning av lmp1-indusert ERK-fosforylering og kappa-lettkjede-ekspresjon. Undertrykkelse av endogent
Ets-1
av liten interfererende RNA er ledsaget av en reduksjon av Ig-kappa-lettkjede-ekspresjon. Gel skift analyser ved hjelp av kjernefysiske ekstrakter av NPC celler indikerer at transkripsjonsfaktoren Ets-en blir rekruttert av lmp1 til PU motiv innen 3’E
κ
in vitro
. Chip analyser ytterligere demonstrere Ets-en binding til PU motiv av 3’E
κ i cellene. Disse resultatene tyder på at lmp1 oppregulerer 3’E
κ aktivitet og
kappa
genuttrykk ved å aktivere Ets-en transkripsjonsfaktor gjennom ERK signalveien. Våre undersøkelser gir bevis for en ny reguleringsmekanisme av kappa uttrykk, der virus kodet proteiner aktiverer
kappa
3 «forsterker gjennom aktivering av transkripsjonsfaktorer i ikke-B-epiteliale kreftceller.
Citation : Liu H, Duan Z, Zheng H, Hu D, Li M, Tao Y, et al. (2012) EBV-kodede lmp1 oppregulerer Ig
κ
3’Enhancer aktivitet og Ig
κ
Expression i Nasofaryngeal kreftceller ved å aktivere Ets-en gjennom ERKs signalering. PLoS ONE 7 (3): e32624. doi: 10,1371 /journal.pone.0032624
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 27 juli 2011; Godkjent: 01.02.2012; Publisert: 01.03.2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av staten Key Basic Research and Development Plan (973) av departementet for vitenskap og teknologi i Kina (No. 2004CB518703), National High Technology Research and Development Program (863) Kina (No. 2006AA 02A 404) og National Stiftelsen natur Science of China (No. 30471968, nr 30973399). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
begrensning av immunoglobulin (Ig) uttrykk til cellene i B-celle avstamning er godt etablert. Imidlertid fant vi Ig-kappa-lettkjede ble «uventet» uttrykt i epiteliale kreftcellelinjer og epitelvev [1], [2], [3]. Ekspresjonen av Ig-kappa-lettkjede i ikke-hematopoetiske tumorcellelinjer ble også rapportert av andre laboratorier [4], [5], [6], [7].
Immunoglobulin
kappa-lettkjede
genuttrykk er under kontroll av forskjellige cis-regulatoriske elementer, inkludert arrangører og forsterkere. To viktige
kappa
Forsterker: den intronic forsterker (iE
κ), som ligger mellom J
κ-C
κ region, og 3 «forsterker (3’E
κ), som er plassert nedstrøms for C
κ region, er blitt identifisert [8], [9], [10]. Begge forsterkere er inaktive på pro-B-og pre-B-celletrinn og aktiv ved Igκ-uttrykkende modne B-celle og plasma-celle stadier [10], [11]. Aktiviteten til disse forsterkere er vanligvis transkripsjonelt stille i andre celler som ikke kan produsere kappakjeden, slik som T-lymfoide celler (Jurkat) [10], epiteliale celler (HeLa) [10] og NIH3T3 fibroblaster [12]. Basert på disse observasjonene, er aktiveringen av disse regulatoriske elementer generelt antas å være nødvendig for
immunoglobulin kappa
genekspresjon og er en B-celle avstamning begrenset aktivitet [10]. Intriguingly, er det funnet at humant iE
κ er aktiv i Igκ-uttrykkende nese-svelg-karsinom (NPC) cellelinjer, noe som er viktig for kappa-lettkjede-ekspresjon i disse celler [13]. Men om de andre
kappa
Enhancer, 3’E
κ, er funksjonell i Igκ-uttrykke epiteliale kreftceller forblir ukjent.
Funksjonen enhancers er mediert av DNA-bindende proteiner som rekrutteres til de regulatoriske elementer av forsterkere. Flere positive regulatoriske elementer har blitt identifisert i 3’E
κ, inkludert en konsensus PU motiv (TTTGGGGAA) for transkripsjonsfaktor Ets-relaterte proteiner [10]. ETS serien inneholder flere underfamilier, inkludert ETS (ETS-1, Ets-2), TCF (Elk-en, Sap-en, etc.), og SPI (PU.1, Spi-B, Spi-C etc.) . Familiemedlemmer er identifisert på grunnlag av sin strukturelle sammensetning og deres likheter i evolusjonært bevarte Ets domener som medierer binding til purin-rik DNA-sekvenser med en sentral GGAA /T kjerne konsensus [14], [15]. Ets familie proteiner er kjerneproteiner og fosforylering er en viktig post-translasjonell modifikasjon av mange ETS familiemedlemmer, noe som kan påvirke deres transkripsjons aktiviteter og DNA-bindende aktiviteter [15]. I B-celler, binding av PU.1 proteinet til kappa 3′-enhancer spiller en viktig rolle i 3’E
κ funksjon [16]. Fosforylering av PU.1 ved Ser148 er nødvendig for interaksjon mellom PU.1 med Pip på DNA, og denne fosforylering kan regulere transkripsjonen aktivitet av PU.1 [17]. Imidlertid er PU.1 proteinet utelukkende uttrykt i hematopoetiske celler [15], [18] og er neppe utføre regulerende funksjon i Igκ-uttrykkende epiteliale kreftceller. Fersk studie ved hjelp av kromatin immunoprecipitation kombinert med genom-wide promoter mikromatriser til å spørre belegg av tre ETS proteiner i en human T-cellelinje, avslørte at overflødig belegg ble ofte oppdaget, mens bestemt antall personer var mindre sannsynlig [19]. Dermed kan vi spekulere i at, hvis 3’E
κ er faktisk funksjonell i Igκ-uttrykke epiteliale kreftceller, andre Ets familie proteiner er mer sannsynlig til å spille en rolle i 3’E
κ aktivitet enn PU.1 . Derfor bestemte vi oss for å undersøke nærmere det som transkripsjonsfaktor (er) bundet til PU-bindingssetet av 3’E
κ og om binding er viktig for 3’E
κ funksjonell aktivering i Ig kappa-uttrykke epitelial kreftceller.
Vår tidligere studie viste at
kappa lett kjede
genet ble uttrykt i NPC og andre epiteliale kreftceller. Mest interessant, har vi funnet at nivåene av det lettkjedede var vesentlig høyere i lmp1-positive celler sammenlignet med lmp1-negative celler [2]. På grunn av sin transformering og tumorigen aktivitet, er lmp1 anses å være en stor onkogene proteinet kodet for av EBV. Lmp1 medierer en rekke cellulære signalveier inkludert NF-kB, c-Jun-NH
2-terminale kinaser (JNKs), p38 /MAPK, PI3K /Akt og JAK /STAT og fører transkripsjonen oppregulering av flere cellulære gener, slik som
il-6, IL-8, bCL-2, CD23, a20 Hotell og
EGFR product: [20], [21], [22]. Lmp1 kan også aktivere Ras /ERK /MAPK signalveien [23], og Ras /MAPK signale kinaser, Raf, MEK og ERK er aktivert i LMP1-uttrykke nasofaryngeale epitelceller [24]. Videre Kim [25] rapporterte at stabil transfeksjon av
lmp1
gen inn i MDCK celler indusert uttrykk for Ets-en, noe som tyder på at
Ets
kan være et mål gen av LMP1. Som nevnt ovenfor, Ets-1 og Ets-2 er underfamilien medlemmer av Ets-relaterte proteiner. Begge er atom mål for Ras-signalreaksjonsveien og fosforylering av konserverte treoninrester, Thr38 og Thr72, er en nødvendig molekylære arrangement for Ras-mediert aktivering av disse transkripsjonsfaktorene [26]. Kumulativt, en lmp1 /ERK /Ets /kappa signalkaskade kan eksistere der lmp1 oppregulerer kappa lett kjede uttrykk i NPC celler.
I denne studien, The MEK inhibitor, PD98059, ble brukt til å undersøke hvilken rolle den ERKs sti i LMP1-forbedret kappa lett kjede produksjon i NPC celler. Dataene som presenteres her viser at LMP1-forsterket kappa produksjon tilsvarer med forhøyede ERKs fosforylering. PD98059 hemmer lmp1-indusert ERK-fosforylering resulterer i redusert ekspresjon av kappa-lettkjede. ERK-spesifikke små interfererende RNA blunts LMP1-indusert
kappa lett kjede
genuttrykk. Luciferaserapportørplasmid analyser viser at 3’E
κ er aktiv i Igκ-uttrykke NPC celler og stabil lmp1 uttrykk oppregulerer aktiviteten 3’E
κ i NPC celler. Mutasjoner av PU-bindingssetet på 3’E
κ betydelig redusere lmp1 forbedret 3’E
κ aktivitet. LMP1-indusert 3’E
κ aktivitet dramatisk hemmet av ERK oppstrøms kinase inhibitor, PD98059. Behandling av PD98059 fører også til en konsentrasjonsavhengig inhibering av lmp1-indusert Ets-1-ekspresjonen og fosforylering, som korresponderer med en doseavhengig dempning av lmp1-indusert ERK-fosforylering og kappa-lettkjede-ekspresjon. Knockdown av endogent
Ets-1
av liten interfererende RNA er ledsaget av en reduksjon av Ig-kappa-lettkjede-ekspresjon. Gel skift analyser ved hjelp av kjernefysiske ekstrakter fremstilt fra ulike NPC cellelinjer bekrefte at transkripsjonsfaktoren Ets-en blir rekruttert av lmp1 til PU motiv av den menneskelige
kappa lett kjede
genet. Chip analyser viser videre at Ets-en binder direkte til PU motiv av 3’E
κ i cellene. Disse resultatene tyder på at lmp1 oppregulerer 3’E
κ aktivitet og
kappa lett kjede
genuttrykk ved å aktivere Ets-en transkripsjonsfaktor gjennom ERK signalveien.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
HNE2 er en EBV-LMP1-negativ menneskelig NPC cellelinje. HNE2-lmp1 er en cellelinje som konstitutivt uttrykker lmp1 etter innføringen av full-lengde
lmp1
cDNA inn i HNE2 celler [27]. Den humane myelom-cellelinjer, XG6, som uttrykker den cytoplasmatiske λ lette kjede, og XG7 som uttrykker det cytoplasmatiske κ lette kjede [28], ble anvendt som kappakjede negative og positive kontroller, henholdsvis. Raji er en human B-celle Burkitt lymfom cellelinje. Alle cellelinjene ble opprettholdt i RPMI1640 (Gibco, USA) supplert med 10% FBS (Gibco, USA), 1% glutamin og 1% antibiotika i en 37 ° C fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. For XG6 og XG7 celler, 1 ng /ml rIL-6 (Sigma, St. Louis, MO) ble satt til RPMI 1640-medium supplert som beskrevet ovenfor [28]. Celler i logaritmisk vekstfase ble brukt i alle forsøkene.
Kjemikalier og celle behandlinger
ERKs oppstrøms kinase MEK inhibitor, PD98059 (Cell Signaling, USA), ble fremstilt som en stamløsning av 20 mM i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma). Subkonfluente celler ble behandlet med forbindelsen ved forskjellige konsentrasjoner til forskjellige tider. Detaljerte behandlingsprosedyrer er beskrevet i figur Legends. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i kulturmediet ble holdt på mindre enn 0,1%, som ikke hadde noen signifikant effekt på cellevekst. Kjøretøykontroll var forberedt på alle behandlinger.
Plasmider
Den menneskelige
β-globin
arrangøren var en 128 bp minimal promoter identisk med den som brukes tidligere [29]. Promoteren ble oppnådd ved amplifisering av humant HNE2 cellulært genom-DNA med de følgende primere: forstand, 5 «-
gagctc
acggctgtcatcacttagacctcac-3′, som inneholder
Sac I
kloningssete; antisense, 5 «-
AAGCTT
taagcaatagatggctctgccctgac-3′, som inneholder
Hind III
nettstedet. Fragmentet ble satt inn i
Sac I /Hind III
områder av
pGL3-Basic
vektor (Promega, Madison, WI) og plasmidet ble betegnet som
pGL3-β
.
A 313 bp fragment inneholdende den humane 3’E
κ enhancer kjerne og 90 bp oppstrøms for enhancer kjernesekvenser [10], [30], [31] ble klonet. Den 3’E
κ Enhancer fragment ble forsterket fra HNE2 cellular genomisk DNA ved PCR med spesifikke primere fra menneske
Ig kappa
genet (GenBank tiltredelse no NG_000834.): Forstand, 5 «-
ggatcc
cctcttggtaccccagcata-3 «, som inneholder en kunstig
BamHI
nettstedet; antisense, 5′
gtcgac
ctgaaagggtgtggagtgct-3 «, som inneholder en kunstig
Sal jeg
nettstedet. De PCR-amplifiserte fragmenter ble deretter fordøyd med
BamHI /Sall Kjøpe og settes inn i de tilsvarende restriksjonssetene av
pGL3-β
plasmid beskrevet ovenfor for å generere
pβ-3 « E
κwt
. PCR-produktene ble bekreftet ved deres størrelse, som bestemmes ved elektroforese og ved DNA-sekvensering. Den PU motiv mutant (utpekt som
pβ-3’E
κmt
) fra
pβ-3’E
κwt
ble generert ved PCR basert på en overlapping utvidelse teknikk [ ,,,0],32]. Primere som brukes for generering av mutasjoner var: forover, 5′-accctttgggcccctgaaaacagaacc-3 «; omvendt, 5»-ttttcaggggcccaaagggtcttctcc-3 «. De PCR-amplifiserte fragmenter bærer de ønskede mutasjonene ble så klonet inn i
BamHI /Sall
områder av
pGL3-β
plasmid. De forventede mutasjoner og integriteten til enhancer ble bekreftet ved automatisert sekvensering ved hjelp av en Applied Biosystems sequencer og programvare (Foster City, CA).
RNA interferens
HNE2-lmp1 celler ble dyrket i 6 -Vel plater og transfektert med en ERK spesifikke små interfererende RNA oligonukleotid (SI-ERK, Cat nr: # 6560; 100 pmol, Cell Signaling) eller egge oligonukleotider (SI-kryptert, Cat nr: # 6568; 100 pmol, Cell Signaling ); en Ets-1-spesifikk små interfererende RNA oligonukleotid (si-Ets-1; Cat no: sc-29309, 150 pmol, Santa Cruz) eller egge oligonukleotider (SI-kryptert, Cat no: sc-37007, 150 pmol, Santa Cruz ) under anvendelse av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) i 72 timer i henhold til produsentens instruksjoner. For å bekrefte ERK eller Ets-en knockdown, celler transfektert med SI-ERK, si-Ets-en, eller egge oligonukleotid ble høstet for protein utvinning og immunoblotting.
luciferaserapportørplasmid analyser
pGL3-β, pβ-3’E
κwt Hotell og
pβ-3’E
κmt
ildflue luciferase reporter plasmider som er beskrevet ovenfor ble brukt i forbindelse med kontroll
pGL3-Basic
vektor (Promega) og intern kontroll plasmid
PRL-SV40 plakater (Promega). Celler ble dyrket i 24-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
5 per brønn over natten og deretter transfektert med de angitte plasmidet ved hjelp av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. Hver transfeksjon inneholdt 800 ng /brønn av Firefly luciferase reporter plasmid og 80 ng /brønn av internkontrollen
PRL-SV40
plasmid. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene enten ubehandlet eller behandlet med 50 uM PD98059 eller 0,1% DMSO i 12 timer. Cellene ble høstet ved 36 timer etter transfeksjon og lysatene ble analysert for ildflue og
Renilla
luciferase aktivitet i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid Assay Kit (Promega) med en GloMax 20/20 luminometer (Promega) . Luciferase reporter plasmider ble ko-transfektert med
PRL-SV40
vektor for å korrigere for variasjoner i transfeksjon effektivitet. Dataene er representert som folden induksjon sammenlignet med
pGL3-Basic
vektor. Minst tre uavhengige transfeksjon eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for hver eksperimentell konstruksjon.
revers transkripsjon og polymerase chain reaction
Subkonfluente HNE2 og HNE2-lmp1 cellene ble behandlet eller ikke behandlet med 50 mikrometer PD98059 for 12 timer. Total RNA ble isolert fra cellene, inkludert XG6, XG7 eller Raji-cellelinjer som kontrollgruppe, ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble oppløst i 20 ul DEPC-behandlet vann og kvantifisert ved 260 nm. Total RNA (2 pg) ble reverstranskribert med Superscript ™ IIRT (Invitrogen) ved 42 ° C i 50 min, og det resulterende cDNA ble underkastet PCR. For
kappa lettkjede
RT-PCR, for å bestemme den optimale PCR-syklus nummer, en konstant mengde av inngangs cDNA ble brukt i PCR-reaksjoner, syklusen tall ble variert mellom 25 og 40 (25, 28, 32, 36, 38, 40), og PCR-produktet på 36 sykluser viste en god detekterbart signal, og var i det lineære området. Sykkel betingelser for
human kappa lettkjede plakater (GenBank tilgangsnummer AJ010442.) Eller for
aktin
: 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 36 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 50 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek, og en forlengelse i 10 minutter ved 72 ° C. PCR termocykling betingelser for Ets familiemedlemmer, lmp1 og GAPDH er 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 32 sykluser på 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 40 sekunder, og en forlengelse i 10 min ved 72 ° C. For kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR), iTaq SYBR Grønn Supermix med Rox ble brukt med følgende sykkelforholdene (Cat ingen 172-5850, Bio-Rad..): 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder etterfulgt av 60 ° C i 1 minutt i en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). De relative mRNA uttrykk nivåer ble beregnet i henhold til den komparative CT (ΔΔCT) -metoden etter normalisering til GAPDH uttrykket. Primer sekvenser for forsterkning av Ig kappa lett kjede, Ets familiemedlemmer [33], LMP1 [34] og interne kontroller er oppført i tabell S1. PCR-produktene ble separert på 1,5 til 2% agarosegeler og visualisert med etidiumbromid.
Protein ekstraksjon
Hel-celle-lysater ble hovedsakelig fremstilt i henhold til en fremgangsmåte som tidligere er beskrevet [2]. For elektroforese mobilitet skiftanalyser (EMSAs), ble kjerneekstrakter fremstilt ved bruk av NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Extraction Kit (Kat. Nr. 78 833, Pierce, USA) etter produsentens anvisninger. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA Assay Reagent (Kat. Nr. 23228, Pierce).
Western blot-analyse
Proteins (50 til 100 ug) ble kokt i SDS prøvebuffer i 5 min , løst på 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført på en nitrocellulosemembran (Millipore, USA). Ikke-spesifikk reaktivitet ble blokkert ved inkubering av membranen i 30 minutter i en tris-bufret saltoppløsning inneholdende 0,1% Tween-20 og 10% fettfri tørrmelk. Membranen ble inkubert over natten ved 4 ° C med forskjellige primære antistoffer, etterfulgt av inkubasjon ved romtemperatur i 1 time med et pepperrot peroksidase-konjugert mus eller kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz, USA), og deretter vasket tre ganger i 10 min hver enkelt med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20. De antistoff-bundne proteiner ble påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens deteksjon kit (Kat. Nr. 34075, Pierce) etterfulgt av eksponering for autoradiografisk film. Etter at sentret for fosforylert ERK eller fosforylert Ets-1 for å undersøke ERK-aktivering status eller nivået av fosforylert Ets-1, ble membranene strippet ved inkubering ved 50 ° C i 30 minutter i strippebuffer (100 mM β-merkaptoetanol, 2% (vekt /volum) natriumdodecylsulfat og 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8) og reprobed med anti-ERK eller anti-Ets-1. De følgende antistoffer ble benyttet for Western blotting: mus-anti-lmp1 monoklonalt antistoff (CS.1-4, DAKO, Danmark), kanin-anti-human-kappa-lettkjede-antistoff (A0191, DAKO), Ets-1 (sc-350), fosforylerte treoniner (sc-5267), ERK (sc-93), fosforylert ERK (sc-7383), og α-tubulin (sc-5286) (alle fra Santa Cruz).
Immunpresipitasjon
Hel-cellelysater (200 ug) ble blandet med protein A-Sepharose-kuler (Sigma), inkubert ved 4 ° C i 2 timer og sentrifugert i 2 minutter ved 2000 rpm i preclearing. Deretter supernatantfraksjonen ble inkubert ved 4 ° C over natten med 4 ug av en ETS-1 antistoff og protein A-Sepharose-perler, fulgt av sentrifugering i 2 minutter ved 12.000 rpm. Immunopresipitatene ble oppsamlet og vasket fem ganger med PAPI-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 1% NP-40, 0,05% SDS, 0,5% natrium-deoksycholat, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, og proteaseinhibitorer). Bunnfallet ble eluert fra protein A-Sepharose-kuler ved å koke i 5 minutter og til slutt underkastet Western blot-analyse ved anvendelse av et antistoff for å påvise treonin fosforylering.
elektroforetiske mobilitet skift assays
Elektroforetisk mobilitet skift analyser (EMSAs) ble utført ved hjelp av LightShift ™ Chemiluminescent EMSA Kit (Kat. nr. 20148, Pierce) etter produsentens anvisninger. Proteinkonsentrasjonen i atom ekstraktene ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse-reagens (katalog nr. 23228, Pierce) ble utført ved anvendelse av EMSAs og alikvoter inneholdende like mengder protein. Reaksjonsblandingen (20 ul) inneholdende kjernefysiske ekstrakter (8 ug) ble inkubert med biotin-merkede dobbelt-trådede oligonukleotid-prober (2 nM) i reaksjonsbuffer (Pierce) i 20 minutter ved romtemperatur. Reaksjoner ble underkastet elektroforese på 5% polyakrylamidgeler i 0,5 x Tris-borat-etylendiamintetra-eddiksyre (TBE) buffer, etterfulgt av elektroblotting på biodyne ™ B nylonmembraner (Kat. Nr. 77016, Pierce) og UV-tverrbinding . Biotinylerte oligonukleotider ble deretter påvist ved sondering med streptavidin konjugert til HRP og visualisert ved hjelp av en ECL kit og autoradiografi. For konkurranseanalyser, ble et 100-gangers overskudd av det tilsvarende umerket villtype-oligo eller mutanten oligo inkludert i bindingsreaksjonen. For antistoff supershift forsøk ble reaksjonsblandingene preinkubert med 2 pg av et Ets-1 (SC-350X, Santa Cruz) antistoff ved romtemperatur i 1 time. Den komplementære oligonukleotider som benyttes som prober eller konkurrenter er som følger: villtype human κPU oligonukleotider, 5′- gaagaccctttggggaactgaaaacaga-3 «og 5′-tctgttttcagttccccaaagggtcttc-3», avledet fra sekvensen av PU området innenfor den humane 3’E
κ. De muterte κPU oligonukleotider (betegnet som mutPU) som ble brukt var 5′-gaagaccctttgggcccctgaaaacaga-3 «og 5′-tctgttttcaggggcccaaagggtcttc-3». De ikke-spesifikke prober som konkurrerer var 5′-ccagagggggatttccaagaggcca-3 «og 5′-tggcctcttggaaatccccctctgg-3», som ble avledet fra sekvensen av NF-kB stedet innen den humane iE
κ. Bindingssteder er understreket og mutasjoner er vist i fet skrift. De muterte oligo prober mot det κPU bindingssetet for EMSAs er identiske med de av de muterte sekvensene i reporter genkonstruksjoner.
Chromatin immunoutfelling (chip) assay
ChIP analyse ble utført ved anvendelse av en chip analysesett (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York) i henhold til produsentens anbefalinger. I korthet ble en formaldehydoppløsning tilsatt direkte til HNE2-lmp1-celler ved en sluttkonsentrasjon på 1% og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Deretter ble cellene nøytralisert i 5 minutter med glycin ved romtemperatur og vasket to ganger med iskald 1 x fosfatbufret saltvann inneholdende proteaseinhibitorer. Cellene ble ødelagt ved bruk av SDS-lyseringsbuffer inneholdende proteaseinhibitorer. Kromatin i lysatet (350 ul) ble skåret til en gjennomsnittlig lengde på rundt 500 bp ved sonikering med en Branson Sonifier Cell Disruptor B15 (effektregulator 4, driftssyklus 40%), med 14 sykluser av 20-sec pulser ved 20-sek intervaller. Suspensjonen ble klaret i en laksesperm DNA /Protein A /agarose-50% suspensjon i 1 time ved 4 ° C. Etter kromatin var «forbehandlet», ble en liten delmengde (10 pl) lagres som «input DNA» for PCR-analyse senere. De gjenværende alikvoter (100 pl hver) med avskjæres tverrbundet kromatin ble inkubert over natten med 2 ug Ets-1 (SC-350X), kanin IgG (sc-2027) (Santa Cruz), eller ikke noe antistoff ved 4 ° C med mild rister. Immunkompleksene ble inkubert i 2 timer ved 4 ° C i en laksesperm DNA /Protein A /agarose-50% oppslemming med mild rysting, vasket og eluert. Cross-linking ble reversert ved hjelp av fem M NaCl. Etter proteinase K-fordøyelse, ble DNA i prøvene ekstrahert med fenol, presipitert med etanol og resuspendert i 50 ul DDH
2O. DNA-oppløsningen (2 ul) ble anvendt for 36 sykluser med PCR-amplifikasjon. PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på en 2% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Følgende primere ble brukt i chip analyser. Menneskelige 3’E
κ enhancer inkludert PU-bindende regionen, 5’ccagggaccaagatagcaac -3 «og 5’ctgaaagggtgtggagtgct -3» (158 bp)
statistisk analyse
Alle statistiske beregninger ble utført ved hjelp av SPSS (v. 12.0) statistisk programvare. Forskjeller mellom ulike grupper ble evaluert av Student
t
test. Forskjellen var statistisk signifikant når
p
. 0,05
Resultater
lmp1 forbedrer kappa lett kjede uttrykk gjennom ERK signalveien i menneskelige NPC celler
lmp1 kan aktivere Ras /ERK /MAPK signalveien [23] og vår tidligere studie viste at lmp1 oppregulerer kappa lett kjede uttrykk i NPC cellelinjer [2]. For å bekrefte om ERKs veien er involvere i LMP1-augmented kappa lett kjede uttrykk, ble PD98059 brukes til å manipulere ERK-aktivering og kappa kjede oppregulering indusert av LMP1. Nivået av ERK-fosforylering var høyere i HNE2-lmp1 celler enn i HNE2 celler, som viste at lmp1 faktisk aktiverer ERK-reaksjonsveien i NPC-celler (figur 1A). Behandling av HNE2-lmp1 celler med PD98059 resulterte i en doseavhengig undertrykkelse av lmp1-indusert kappa-lettkjede (figur 1B), som korresponderte med en doseavhengig dempning av ERK-fosforylering indusert av lmp1 (figur 1A). PD98059 (50 uM) viste tydelig en hemmende effekt på HNE2-lmp1 celler, men hadde ingen virkning på HNE2 celler (figur 1C). For å bestemme om inhiberingen av Ig-kappa-ekspresjon av PD98059 behandling skjer på transkripsjonsnivået, ble HNE2 og HNE2-lmp1-celler opprettholdt under de samme betingelser og nivåene av
kappa-lettkjede
mRNA ble undersøkt ved RT -PCR. Behandling med PD98059 (50 mm) induserte en markert nedgang i LMP1-indusert
kappa
mRNA uttrykk, men
kappa
mRNA nivå i HNE2 forble i hovedsak uendret (figur 1D), som er enig med Immunoblotanalyse resultater. For ytterligere å bekrefte at ERK pathway spiller en rolle i LMP1-indusert
kappa lett kjede
genekspresjon, vi slått ned
ERK
uttrykk av RNA-interferens. Mens transfeksjon av HNE2-lmp1 celler med en egge oligonukleotid påvirket ikke lmp1-indusert
kappa
genekspresjon,
si-ERK
avstumpet effekten av lmp1 (figur 1E), noe som indikerer at ERK pathway er involvert i denne hendelsen. Samlet disse resultater bekrefter den ideen at oppregulering av kappa-lettkjede ved lmp1 skjer gjennom aktivering av ERK /MAPK-signalveien.
(A) HNE2-lmp1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av PD98059 eller 0,1 % DMSO i 2 timer. Helcellelysater ble fremstilt og total og fosforylert ERK-nivåer ble bestemt ved Western blotting. (B) HNE2-lmp1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av PD98059 eller 0,1% DMSO i 12 timer. Kappa-lettkjede-ekspresjon i NPC-celler, ble vurdert ved Western blotting ved bruk av et spesifikt antistoff. (C) HNE2 og HNE2-lmp1-celler ble behandlet med 50 uM PD98059 eller 0,1% DMSO i 12 timer og Western blotting ble utført for å påvise kappa-lettkjede-ekspresjon. (D) HNE2 og HNE2-lmp1 celler ble inkubert med medium inneholdende den angitte konsentrasjon av PD98059 eller 0,1% DMSO i 12 timer. Total RNA ble isolert fra celler og utsatt for RT-PCR, ved å bruke spesifikke primere laget for å forsterke
kappa-lettkjede og
aktin
mRNA. (E) HNE2-lmp1 celler ble transfektert med
si-ERK
eller egge oligonukleotid. ERK og Ig-kappa-proteinnivåer ble påvist ved immunblotting. Resultatene som er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Fosforylering eller totale ekspresjonsnivået for hvert protein i tillegg til mRNA ble bestemt ved densitometri og er presentert som et forhold til den respektive laste kontroll (høyre panel). XG7 og XG6 celler er vist som positive og negative kontroller, henholdsvis for kappa lett kjede.
Den PU bindingssetet er involvert i LMP1-økt aktivitet av 3’Eκ gjennom ERK sti
aktivering av 3’E
κ er nødvendig for
immunoglobulin kappa
genuttrykk. For å undersøke hvorvidt 3’E
κ kan være funksjonelt aktiveres i NPC celler, koblet vi et 313 bp human 3’E
κ enhancer-fragment, som inneholder forsterkeren kjerne og 90 bp oppstrøms for enhancer kjernesekvenser som er nødvendig for maksimal enhancer aktivitet når forsterkeren kjernen ikke er i direkte tilknytning til promoteren [31], til den menneskelige
β-globin
promotor for å drive ekspresjon av ildflue luciferase-genet og analysert denne reporter konstruksjon av transient transfeksjon av NPC cellelinjer (figur 2A, B). Den menneskelige
β-globin
promoter ble valgt fordi det tidligere har vært brukt i flere studier av immunglobulin forsterkere [35], [36], [37], og også fordi vi har funnet det å være minimalt påvirket av lmp1 i våre eksperimenter (figur 2C og figur 3). Konstruksjonene ble innført i HNE2 og HNE2-lmp1 celler for å teste aktiviteten av 3’E
κ. Transfeksjon av
pβ-3’E
κwt
generert høyere luciferase aktivitet enn transfeksjon av
pGL3-β
konstruere (uten forsterker), uavhengig av om LMP1-negative (
p
0,05) eller LMP1-positive (
p
0,01) NPC celler ble undersøkt. Disse resultatene indikerte at 3’E
κ er aktiv i NPC-celler som uttrykte den Ig-kappa-lettkjede. Videre aktivitet 3’E
κ i HNE2-lmp1 cellene var omtrent tre ganger høyere enn i HNE2 celler (
p
0,05) (figur 2C), som avtalt med kappa kjede uttrykk mønstre i disse to cellelinjene [2].
