Abstract
TIG3 er en tumor suppressor protein som begrenser keratinocyte overlevelse under normal differensiering. Det er også viktig i kreft, som TIG3 nivået er redusert i tumorer og i hud cancercellelinjer, noe som tyder på at tap av ekspresjon kan være nødvendig for kreftcelleoverlevelse. Et viktig mål er å identifisere hvordan TIG3 begrenser celleoverlevelse. I denne studien viser vi at TIG3 uttrykk i epidermal plateepitelkarsinom SCC-13 celler reduserer celleproliferasjon og fremmer morfologiske og biokjemiske apoptose. For å identifisere den mekanismen som driver disse endringene, viser vi at TIG3 lokaliserer nær sentrosomen og at pericentrosomal opphopning av TIG3 endrer microtubuli og fila organisasjon og organelle distribusjon. Organ opphopning på sentrosomen er et kjennetegn på apoptose, og vi viser at TIG3 fremmer pericentrosomal organ akkumulering. Disse endringene er forbundet med redusert cyklin D1, cyklin E og cyklin A, og økt p21-nivå. I tillegg er Bax nivået økes og Bcl-XL nivået er redusert, og spaltning av procaspase 3, procaspase 9 og PARP er forbedret. Vi foreslår at pericentrosomal lokalisering av TIG3 er en viktig hendelse som resulterer i microtubule og fila omfordeling og pericentrosomal organ clustering og som fører til kreft celle apoptose
Citation. Scharadin TM, Jiang H, Jans R, Rorke EA, Eckert RL (2011) TIG3 Tumor suppressor-Dependent Organelle Omfordeling og apoptose i Skin kreftceller. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10,1371 /journal.pone.0023230
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 25 mars 2011; Godkjent: 12 juli 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Scharadin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir RE (NIH R01 AR094713 og NIH R01 AR04694). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
TIG3 (Tazarotene-indusert gen 3), som også kalles retinsyrereseptor responder 3 (RARRES3) og retinoid-induserbar gen 1 (RIG1) [1] – [5], er en hundre sixty- fire aminosyreprotein [6]. TIG3 ble opprinnelig identifisert som øket etter behandling av dyrkede epidermale keratinocytter eller psoriatiske epidermis med syntetisk retinoid, Tazarotene [6]. Det er uttrykt ved lave nivåer i hyperproliferative epidermis (f.eks platecelle karsinom og psoriasis) og ekspresjon gjenopprettes ved behandling retinoid [7] – [9]. I retinoid-behandlede psoriasis epidermis, økes TIG3 uttrykk i forbindelse med restaurering av normal differensiering [6], [10]. Foreningen av økt TIG3 uttrykk med normal epidermal fenotype antyder at TIG3 kan fungere som en pro-differensiering regulator. For å undersøke virkningsmekanismen, studerte vi TIG3 funksjon i normale humane keratinocytter [10] – [12]. Disse studiene viser at TIG3 er til stede i forsvinnende små mengder i keratinocytter i monolagskultur, men er økt i differensiert flåte kulturer [12]. Vektor-mediert ekspresjon av TIG3 i keratinocytter resulterer i redusert spredning og økt forhomede konvolutt formasjon, noe som tyder på at TIG3 regulerer keratinocytt-differensieringen [10] – [12]. Pågående studier viser at TIG3 styres ved hjelp av flere mekanismer, men en fremtredende virkningsmekanisme er regulering av transglutaminase aktivitet [10], [11]. Type I transglutaminase (TG1) er et nøkkelenzym i keratinocytter og andre overflate epitel som uttrykkes i suprabasal differensierte celler [13] – [20]. Transglutaminase katalyserer dannelsen av ∈- (γ-glutamyl) lysin protein-protein-tverrbindinger for å montere den forhomede konvolutt, en vesentlig komponent av den epidermale barriere [21], [22]. Våre studier tyder på at TIG3 co-lokaliserer med TG1 fører til økt transglutaminase aktivitet [10], [11]. Ytterligere undersøkelser viser at TIG3 reduserer keratinocytt spredning, men ikke forårsaker apoptose [10], [11]. TIG3 består av en amino-terminal hydrofilt segment og et C-terminalt membranforankringsdomenet [6], [23]. Mutagenese studier indikerer at mutanter som mangler den C-terminale membranforankringsdomenet, er ikke aktive [10], [11], [23]. I motsetning til dette, omdanner N-terminal trunkering TIG3 til et protein som fører til apoptose i keratinocytter [12].
TIG3 uttrykkes ved reduserte nivåer i hudkreft [7]. Dermed et hovedmål med denne studien er å karakterisere virkningen av TIG3 uttrykk i huden kreftceller. Vi viser at gjenoppretting TIG3 uttrykk reduserer overlevelsen av epidermal plateepitelkarsinom celler via en mekanisme som innebærer pericentrosomal TIG3 lokalisering fører til endret microtubuli organisasjon og organelle distribusjon. Dette er knyttet til endringer i nivået av cellesyklus og apoptose regulatorer.
Resultater
TIG3 uttrykk synker celle nummer
Vi begynte med å undersøke effekten av TIG3 på SCC- 13 celle overlevelse. TIG3 ble levert av adenovirus infeksjoner. Fig. 1A viser at tomme vektorinfiserte celler øker i antall i løpet av 72 timer, men det celleantall er betydelig redusert etter 48 og 72 timer i TIG3-uttrykkende celler. Fig. 1B viser at TIG3 nivå er maksimal i de infiserte celler ved 24 og 48 timer etter infeksjon, og er redusert med 72 timer. I tillegg til den TIG3 monomer, observerer vi akkumulering av høymolekylære former som er antatt å være kovalent-tverrbundet TIG3 [10] – [12]. Som tidligere rapportert, er TIG3 uttrykkes på lave nivåer i de fleste transformerte celler [10], er [11], og derfor ikke oppdaget ved tid null.
Subkonfluente kulturer av SCC-13 celler, vokser i 3,8 cm
2 brønner, ble smittet med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3. Ved 0, 24, 48 og 72 timer etter infeksjon ble cellene tellet og lysater fremstilt. En TIG3 uttrykk synker celle nummer. Verdier er gjennomsnitt ± SEM, n = 3. Disse sammenligningene merket med en stjerne er vesentlig forskjellige som bestemmes av t-test (p 0,001). B TIG3 blir oppdaget av immunoblot i tAd5-TIG3 infisert SCC-13 celler. Monomeren er synlig på 18 kDa og braketten indikerer høyere molekylvekt kryssbundet TIG3 [10], [11]. Molekylvekter er angitt til venstre for blot i kDa.
TIG3 avtar celleproliferasjon ved inhibering av cellesyklusprogresjon
Vi overvåket ved cellesyklusprogresjon. Vi begynte ved å vurdere den prosentandelen av celler i S-fasen ved hjelp av BrdU merking. SCC-13-celler ble infisert med TIG3-uttrykkende virus, og etter 24 timer er merket med BrdU i 2 timer før deteksjon av BrdU og TIG3. Som vist på fig. 2A, 54 ± 2,8% (gjennomsnitt ± SEM) av EV-infiserte celler var positive for BrdU, sammenlignet med 23% ± 4% av TIG3-uttrykkende celler. Som vist på fig. 2B, de mest fremtredende cellesyklus endringene er en reduksjon i G1 og øke i subG1 hendelser. For å undersøke mekanismen som er ansvarlig for disse endringene, målte vi nivået av viktige cellesyklusregulerende proteiner. Fig. 2C viser den cyklin-avhengige kinase (CDK1, CDK2, cdk6, cdk4) nivåene ikke endres ved TIG3, men cyklin D1 og cyclin E-nivåer blir redusert og p21-nivået økes. Disse forandringene er i samsvar med redusert progresjon gjennom G1 fase og G1 /S overgang. Fig. 2D viser at p21 mRNA nivå øker parallelt med økningen i p21-proteinet.
A SCC-13-celler dyrket på dekkglass ble infisert med 10 MOI på EV eller TIG3-kodende virus, og etter 24 timer behandlet med 10 pM BrdU i 2 timer og deretter fiksert og farget med anti-BrdU (rød) og anti-TIG3 (grønn). BrdU-inkorporering er en markør for den syntese-fasen av cellesyklusen. Antall BrdU positive celler som en prosentandel av totalt celleantall er vist under hvert panel. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM (n = 3), og verdiene er vesentlig forskjellige, som bestemt ved t-test (p 0,001). Barer = 10 mikrometer. B SCC-13-celler ble samlet opp for flowcytometri ved 24 timer etter infeksjon med EV eller TIG3-koding virus. Celler ble farget med 50 ug /ml propidiumjodid før analyse. TIG3 reduserer hendelser i G1 og øker subG1 hendelser. C Ved 24 timer etter infeksjon, ble cellene høstet og ekstrakter fremstilt for påvisning av cellesyklusregulerende proteiner. Molekylvekter er angitt til venstre for blot i kDa. D Cellene ble behandlet som ovenfor, og deretter høstet for påvisning av p21-kodende mRNA ved hjelp av sanntids-PCR. Et lignende resultat ble observert i hver av de tre forsøkene.
TIG3 induserer apoptose
Nærværet av subG1 DNA-innhold kan være forbundet med celle apoptose. Vi har derfor vurdert konsekvensene av TIG3 på apoptose. Som vist på fig. 3A, aktiverer TIG3 uttrykk spalting av procaspase 9 og procaspase 3 og genererer kløyvde PARP. I tillegg er den pro-apoptotiske regulator, Bax, økes og prosurvival regulator, Bcl-XL, reduseres. Økt apoptose kan også observeres
in situ
. Fig. 3B viser at svært få spaltet PARP-positive celler er observert i kontrollkulturer (1 ± 1%, middelverdi ± SA), men at antallet økes markert i TIG3-positive (23 ± 8%) kulturer. Disse funnene, sammen med økningen i subG1 DNA innhold (Fig. 2B), tyder på at TIG3 induserer apoptotisk celledød.
En SCC-13 celler ble infisert med 10 MOI av EV eller TIG3-koding virus og etter 24 timer lysater ble fremstilt for påvisning av apoptose markører. Braketten indikerer høy molekylvekt tverrbundet TIG3 [10], [11]. Molekylvekter er angitt til venstre for blot i kDa. B ved 24 timer etter infeksjonen SCC-13 celler ble fiksert og farget med anti-spaltet PARP (rød). TIG3 øker kløyvet PARP farging. Prosentandelen av spaltede PARP-positive celler er presentert i hvert panel (gjennomsnitt ± SD). Pilene indikerer spaltet PARP-positive celler. Lignende resultater ble observert i hver av de tre forsøkene.
TIG3 lokaliserer på en pericentrosomal plassering og forårsaker organ omfordeling
For å få innsikt i TIG3 virkningsmekanismen vi overvåket TIG3 subcellulære sted i tAd5-TIG3 virusinfiserte celler. Som vist på fig. 4A, TIG3 (grønn) samler seg langs cellens omkrets nær plasmamembranen (pilhoder) og i et perinukleært sted (piler), og kjernene i TIG3-uttrykkende celler som er redusert i størrelse. For ytterligere å vurdere TIG3 stedet ble cellene farget for å oppdage pericentrin, en sentrosomen markør. Bildene på fig. 4B viser TIG3 farging sidestilt med pericentrin farging (hvit pil) i tilknytning til kjernen (n). TIG3 (grønn) lokaliserer i den generelle nærheten av pericentrin (rød) tyder på akkumulering i nærheten av sentrosomen.
En SCC-13 celler ble infisert med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og ved 24 timer post-infeksjon ble fiksert og farget med anti-TIG3 (grønn). Pilene viser pericentrosomal og pilspisser indikerer membran lokalisering. Ingen TIG3 oppdages i tomme vektor-infiserte celler. B-celler infisert som ovenfor, ble fiksert og farget med TIG3 (grønn) og pericentrin (rød). Pilene viser pericentrin farging av sentrosomen og n indikerer kjerner. Barer = 10 mikrometer.
sentrosomen er et kontrollpunkt for et bredt spekter av cellefunksjoner. Den fungerer som den microtubule organisering sentrum (MTOC) som er åsted for microtubule forsamlingen [24], [25]. I tillegg replikerer den under celledeling og datter centrosomes tjene til å organisere mitosetråder som styrer kromosom separasjon [24], [26]. Viktigere er det MTOC tjener som et kontrollpunkt for bevegelse av molekylær motor båret gods, inkludert organeller, langs mikrotubuli [27]. Videre er sentrosomen dysfunksjon forbundet med celle apoptose [28]. Vi har derfor undersøkt om pericentrosomal TIG3 opphopning endrer microtubule distribusjon. Som vist på fig. 5A, blir de mikrotubuli i TIG3-negative celler spredt over hele cellen i et typisk gitter-type nettverk som stråler ut fra det sentrosomen (hvit pil). I motsetning til i TIG3-uttrykkende celler (sort pil viser pericentrosomal TIG3), mikrotubuli lokalisere som et band (røde piler) på celle periferien, og ikke stråle ut fra sentrosomen, tyder på at TIG3 påvirker microtubule plassering og forankring. Dette er best sett i fig. 5A (nedre panel) som viser bare den β-tubulin farging. Mikrotubuli i TIG3-positive celle (venstre) mangler sentrosomen-baserte clustering, mens TIG3-negative celle (til høyre) har sentrosomen forankret mikrotubuli (hvit pil). For å vurdere effekten av TIG3 på microtubule nettverket, ble antall celler viser mikrotubuli stråler ut fra sentrosomen telles. Som vist i plottet, er prosentandelen av celler som viser sentrosomen styrt nettverk markert redusert i TIG3-uttrykkende celler.
En SCC-13 celler ble infisert med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og ved 24 h etter infeksjonen ble cellene fiksert og farget med anti-TIG3 (grønn flekk) og anti-β-tubulin (rød flekk). TIG3 akkumuleres på den forventede perinukleær plassering (svart pil). β-tubulin akkumuleres i en atypisk ring på cellen periferien (røde piler). Den normale β-tubulin-nettverket i TIG3-negative celle er angitt med en hvit pil som peker til sentrosomen. Nuclei var Hoechst farget (blå). Det nederste panel er identisk med den øvre, bortsett fra at bare den β-tubulin (rød) signal er indikert. Barer = 10 mikrometer. Grafen viser antall TAD-EV og tAd5-TIG3 infiserte celler med sentrosomen-stammer mikrotubulidynamikk arrays. Cellene ble telt i tjue uavhengige mikroskop felt og minimum ett hundre celler ble talt opp per behandlingsgruppe. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM. Parvise t-test-analyse viser at midlene er signifikant forskjellige (p 0,001). For å vurdere effekten av TIG3 på løselighet tubulin ble cellene infisert med tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og etter 24 timer total pakke, løselig og pellet fraksjoner ble utarbeidet og elektroforese etterfulgt av farging for å påvise β-tubulin og β-aktin. Tilstedeværelsen av flertallet av β-aktin i den løselige fraksjon indikerer at fraksjoneringen var vellykket. B TIG3 uttrykk fører til aktin filament kollaps rundt kjernen. SCC-13-celler ble infisert med adenovirus som ovenfor, og etter 24 timer farget med anti-β-aktin (rød flekk) og anti-TIG3 (grønn flekk). Nuclei var Hoechst farget (blå). For de TIG3-positive celler, viser venstre panel TIG3 og p-aktin signaler (rød og grønn), mens den høyre panel viser kun β-aktin (rød) kanal. Den svarte pilen indikerer TIG3 opphopning på sentrosomen og den røde pilen indikerer β-actin filaatom ring. Barer = 10 mikrometer. Plottet viser antall TAD-EV og tAd5-TIG3 infiserte celler viser aktin filament ringer rundt kjernen. Cellene ble telt i atten uavhengige mikroskop felt og minimum ett hundre celler ble talt opp per behandlingsgruppe. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM. Sammenkoblet t-test analyse viser at midlene er signifikant forskjellig (p 0,001).
omfordeling av tubulin til cellemembranen i TIG3-positive celler antyder at det kan være uløselig. For å vurdere dette, utarbeidet vi totalt celleekstrakt fra TIG3-negative og positive celler og forberedt løselige og spesielle (pellets) fraksjoner. Vi deretter analysert for β-tubulin i hver fraksjon ved immunblot. Som vist på fig. 5A, gjør membran-lokaliserte β-tubulin ikke vises i pellet fraksjonen, tyder på at selv om det er lokalisert på celle periferien på eller nær membranen, er det fortsatt løselig.
tubulin og aktin nettverk i stor utstrekning og så vi overvåket virkningen av TIG3 på aktin filament distribusjon (fig. 5B). I TIG3-negative celler (EV), β-actin (rød) fordeles over hele cytoplasmaet. I motsetning til i TIG3-positive celler (grønn flekk) en distinkt aktin filament ringformer på den kjernefysiske periferien (rød pil). Dette er vist i både en sammenslåtte bildet og β-aktin-farging alene (Fig. 5B). Antall celler som viser en kjernefysisk aktin ring ble tellet. Plottet viser at prosentandelen av celler som viser en kjernefysisk aktin ring økes markert i TIG3-uttrykkende celler.
Fordi organeller bevegelse og forankrings avhenger av tubulin og actin-nettverk [29], forventet vi at TIG3 kan påvirke organ distribusjon. For å vurdere effekten av TIG3 på organelle plassering, ble cellene farget for å oppdage GM130 (cis-Golgi), mannose-6-fosfat-reseptor (M6PR, trans-Golgi og sent endosomet) [30], rab11 (Innsamling endosomes), calnexin ( endoplasmatiske retikulum), og clathrin tung kjede (CHC, intracellulær transport vesikler). Fig. 6A viser at GM130 (rød) lokaliseres ved et perinukleært sted i TIG3-negative og positive celler; viser det seg imidlertid mer komprimert i TIG3-positive (grønn flekk) celler. M6PR, rab11 og calnexin også vises komprimeres på pericentrosomal beliggenhet i TIG3-positive celler (hvite piler). Dette blir lett visualisert for calnexin, ved å sammenligne fordeling som er vist i den røde enkelt fargebilde (sett) med det som ble observert i EV-infiserte celler (fig. 6a), som en intens pericentrosomal konsentrasjon av calnexin er observert i TIG3-positive celler . I tillegg er clathrin tung kjede et spesielt dramatisk eksempel, ved at flekker vises fordelt over hele cytoplasmaet i EV-infiserte celler, men i det vesentlige alle de CHC akkumuleres i nærheten av sentrosomen i TIG3-positive celler. Det ser derfor ut som TIG3 endrer intracellulære organelle fordeling på en måte som konsentrerer og komprimerer mange organeller i nærheten av sentrosomen. Denne komprimeringen ble kvantifisert ved å måle den todimensjonale området som dekkes av de enkelte organeller i hake mikron ved hjelp av ImageJ programvaren (fig. 6B). Denne analysen viser en betydelig og statistisk signifikant reduksjon i areal for GM130, M6PR og rab11. Calnexin og CHC fordeling ble ikke analysert på denne måte, ettersom kondensasjonen var åpenbare. Vi har også undersøkt effekten av TIG3 på organ protein nivå. Fig. 7 viser at TIG3 uttrykk fører til en beskjeden reduksjon i nivået av noen organelle proteiner, inkludert calnexin, rab11, GM130 og EEA1; imidlertid nivået av andre markørproteiner ikke endret.
En SCC-13 celler ble infisert med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og etter 24 timer faste og farget for å oppdage TIG3 (grønn) og diverse organelle markører (rød). Markører omfatter GM130 (cis-Golgi), M6PR (mannose-6-fosfat-reseptoren, trans-Golgi og sent endosom), rab11 (resirkulere endosom), calnexin (ER), og CHC (clathrin tung kjede, intracellulær transport vesikkel). Hvite piler indikerer pericentrosomal lokalisering av TIG3. Kjerner er farget blå. For GM130, M6PR, og rab11, alle paneler er rød /grønn /blå fusjonerte bilder. EV og TIG3 bilder av calnexin flekker er rød /grønn /blå fusjonerte bilder. De setter i TIG3 /calnexin bildet er ensfargede bilder. For CHC flekken, er bare den røde (CHC) bildet som vises. Barer = 10 mikrometer. B TIG3 innvirkning på subcellulære organeller distribusjon. For å måle organelle oppslag, ble mikroskopet fokusert på z-planet som viser den maksimale organ spredning og området dekket av organeller ble overvåket ved hjelp ImageJ programvare og presentert som organelle område i mikrometer
2. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM (n = 30 felt) som inkluderer måling av minst tretti celler per behandlingsgruppe. Sammenkoblet t-test analyse identifiserer de midler som signifikant forskjellige (p 0,001).
SCC-13 celler ble infisert med 10 MOI tAd5-EV eller tAd5-TIG3 og etter 24 h cellelysater var forberedt for immunoblot påvisning av de angitte proteiner. TIG3 uttrykk reduserer nivået av rab11, GM130 og EEA1, men endrer ikke LAMP1 nivå. Molekylvekt er angitt til venstre for blot i kDa.
Diskusjoner
TIG3 (Tazarotene-indusert gen 3) ble opprinnelig identifisert som økte etter behandling av dyrkede epidermale keratinocytter eller psoriasis epidermis med syntetisk retinoid, tazarotene [6], og ble senere identifisert i mage kreftceller og kalte RIG1 [5]. Etterfølgende studier avslører TIG3 mRNA i en rekke vev og celler i kultur [1], [5], [31] – [33]. TIG3 nivået økes med retinoid behandling [4], [34], og i noen celletyper TIG3 gen-ekspresjon er undertrykt av MAPK-signalering [35].
TIG3 er et medlem av NIpC /P60 superfamilien av proteiner [ ,,,0],36]. Den N-terminale domene (aa1-134) koder områder som er konservert blant medlemmer av lecithin:retinol-acyltransferase (LRAT) og H-rev tumor suppressor familier [37] – [39]. Funksjonell analyse av TIG3 strukturen indikerer at det C-terminale hydrofobe domene (aa135-164) fungerer som et membrananker [6], [23], og at den N-terminale region koder for kalsium-uavhengig fosfolipase A1 /2-aktivitet [31] , [32], [40]. Videre betyr fosfolipase A1 /2-aktivitet krever ikke den C-terminale hydrofobe domene [40]. TIG3 har vist seg å redusere celleoverlevelse i et antall celletyper [6], [10], [11], [34], [41], [42], men mekanismen som er ansvarlig for undertrykkelse er ikke godt forstått. I enkelte celletyper, kan TIG3 handle via regulering av MAPK og PI3K /Akt signaliserer [1], [3], [41].
TIG3 i epidermis
TIG3 er uttrykt i suprabasal differensierte lag av keratinocytt-kulturer flåte [12] og i suprabasal epidermis [7], [8], og TIG3 uttrykk er redusert i hyperproliferativ hudsykdom og i hud kreftceller [6] – [9]. Retinoid behandling øker TIG3 nivå, og dette er forbundet med redusert celleproliferasjon [6] – [9]. TIG3 uttrykkes ikke i normale keratinocyter opprettholdt i monolagskultur og vektor-formidlet TIG3 ekspresjon er assosiert med redusert cellenummer [8], [10] – [12]. Mekanistiske undersøkelser i keratinocytter viser at det C-terminale membranforankringsdomenet er nødvendig for aktivitet [10], [11], [23], og at ekspresjon av TIG3 i normale humane dyrkede keratinocytter aktiverer valgt differensieringsrelaterte hendelser [10] – [ ,,,0],12]. Spesielt samvirker TIG3 med type I transglutaminase (TG1) for å bedre TG1 katalytisk aktivitet [10], [11]. TG1 er et nøkkelenzym i differensiere keratinocytter som katalyserer dannelsen av protein-protein-tverrbindinger som fører til montering av forhomede konvolutt, en viktig bestanddel i huden permeabilitetsbarriere [43]. Full-lengde TIG3 protein stimulerer differensiering assosierte transglutaminase aktivitet i keratinocytter. I motsetning til amino-terminal forkortede former forårsake apoptose og nivået av apoptose er mer uttalt som den N-terminale ende blir forkortet, [12]. Andre studier peker på unike effekter av ulike TIG3 underdomener [40], [42], [44]. Den suprabasal mønster av TIG3 uttrykk i epidermis er konsistent med en rolle TIG3 som en kontrollør av keratinocytt differensiering relaterte hendelser.
TIG3 uttrykk i huden kreftceller reduserer spredning og øker apoptose
Tidligere studier indikerer at TIG3 mRNA er tilstede i reduserte nivåer i hudkreft og i hudkreft cellelinjer [8]. Men lite er kjent om hvorvidt TIG3 regulerer hudkreft celle overlevelse og tumorprogresjon. Vi viser at ekspresjon av TIG3 fører til en markert reduksjon i SCC-13 celle nummer som er knyttet til redusert G1 og i S-fasen hendelser og øket sub-G1 DNA-innhold. Disse cellesyklus endringene er forbundet med TIG3 avhengige endringer i cellesyklusregulerende protein-nivå. TIG3 uttrykk reduserer cyklin D1 og cyclin E-nivåer og øker nivået av p21 cyklin-avhengig kinase inhibitor. Disse funnene er i samsvar med en reduksjon i celle progresjon gjennom G1 /S overgang. I tillegg viser vi at TIG3 øker SCC-13 celle apoptose som gjenspeiles av økt produksjon av aktivert caspase 9 og 3 og økt spaltet PARP. Videre immunofarging studier avslører spaltede PARP akkumuleres i TIG3-positive celler. Disse resultatene er spesielt interessant som TIG3 ikke forårsaker apoptose i normale humane keratinocytter. I stedet forårsaker TIG3 cellene å gjennomgå differensiering [10] – [12]. I motsetning til dette mutante former av TIG3 forårsake apoptose i normale humane keratinocytter [12]. Det faktum at TIG3 forårsaker apoptose i kreftceller tyder på en annen virkningsmekanisme i normale versus transformerte celler. I tillegg er noen av disse endringene knyttet til endringer i målet genet mRNA nivå. For eksempel er det TIG3 avhengig økning i p21 protein forbundet med en parallell økning i p21-kodende mRNA, noe som indikerer at TIG3 regulerer p21 gentranskripsjon eller RNA-stabilitet. Vi vet ikke i dag vet om denne handlingen er direkte eller indirekte.
TIG3 uttrykket er assosiert med pericentrosomal organ clustering
Et viktig spørsmål er hvor TIG3 er lokalisert i cellen. En interessant tidligere studie i HeLa livmorhalskreftceller tyder på at TIG3 lokaliserer i cis- og trans-Golgi og at denne lokalisering er nødvendig for å stimulere apoptose [2]. Som vist på fig. 6A, antistoff ko-farging av SCC-13-celler tyder på at TIG3 lokaliserer i cis- og trans-Golgi (GM130, M6RP), sen endosomet (M6PR), resirkulerings endosomet (rab11), det endoplasmatiske retikulum (calnexin) og intracellulære transport vesikler (CHC). Vi mener imidlertid at det er lite sannsynlig at TIG3 er hovedsakelig lokalisert i disse strukturene av flere grunner. For det første synes TIG3 bare for å lokalisere med organeller bare i umiddelbar nærhet av sentrosomen og ikke mer perifert. For det andre, viser vi at TIG3 endrer microtubule og fila distribusjon og dette er forbundet med pericentrosomal organ akkumulering. For det tredje, i en annen rapport studerer vi fordelingen av TIG3 i normale humane keratinocytter og disse studiene sterkt at et pericentrosomal TIG3 plassering (ikke vist). Basert på disse funnene, hevder vi at den største effekten av TIG3 er på sentrosomen og at utseendet på colocalization av TIG3 med organelle markører er en gjenstand på grunn av pericentrosomal organ clustering.
Organelle flytting er et velkjent fenomen som forekommer i løpet av apoptose [45]. Det er tenkt å forbedre organ membran blande til rette for spredning av pro-apoptotiske effektorer [45] – [50]. Men hvordan disse organeller og organelle fragmenter kommer sammen i løpet av apoptose det er ikke godt forstått, men antas å involvere sentrosomen og mikrotubuli. Den sentrosomen fungerer som en microtubule organiserende senter (MTOC) i interfase celler og som arrangør av mitotiske apparatet i mitotiske celler. Som et microtubule kjerne sentrum sentrosomen funksjon kreves for intracellulær organhandel [24], [51]. Organ flytte sammen mikrotubuli forbundet med spesifikke motor proteiner [27], [51]. Tidligere rapporter implisere mikrotubulidynamikk motorer i å bringe organelle og organelle fragmenter til microtubuli organisering sentrum (sentrosomen) under apoptose [45], [52]. Disse inkluderer Golgi-apparatet, endosomer, endoplasmatiske retikulum, mitokondrier og andre organeller [45], [47], [53], [54]. Det best karakteriserte eksempel er omfordeling av mitokondriene til Golgi-proksimale mikrotubuli organisering sentrum i celler eksponert for TNFa, oksidativt stress eller viral infeksjon [45]. Flere rapporter tyder på at denne prosessen aktiverer MAPK aliserte til fosforylere kinesin lett kjede å stanse mitokondriene antero spredning fører til opphopning av disse organeller nær sentrosomen [45].
Disse tidligere rapporter beskriver pericentrosomal organ clustering i respons på behandling med vekstfaktorer, oksidativt stress eller andre stimuli [45]. Våre foreliggende undersøkelser er unike ved at organeller clustering utløses ved ekspresjon av en tumor suppressor protein. Videre er det faktum at TIG3 akkumulerer nær sentrosomen tyder på at det kan ha en direkte rolle i reguleringen av organeller bevegelse under apoptose. Våre studier viser at TIG3 nærvær endrer den normale subcellulære beliggenheten av mikrotubuli og mikrofilamenter, som kan være en mekanisme hvorved det endrer organelle plassering. Fremtidige studier vil måtte ta om TIG3 endrer også microtubule motor avhengig transport av organeller. Vår arbeidshypotese er at TIG3 kan endre både microtubule distribusjon og microtubule baserte motorisk funksjon for å forårsake pericentrosomal organelle clustering. Basert på vår analyse, fremmer TIG3 opphopning av organeller på sentrosomen inkludert endoplasmatiske retikulum, Golgi-apparatet, resirkulering endosomes, sent endosom, og transport vesikler. Imidlertid er ikke alle organ fraktet til sentrosomen. For eksempel, lysosomer, som målt ved påvisning av LAMP1, distribuere i rekker langs mikrotubuli og, i TIG3-positive celler, er dette mønsteret forsterkes (ikke vist). Dermed vil flere studier er nødvendig for å forstå hvilken rolle TIG3 i å regulere microtubule funksjon og organ transport.
Materialer og metoder
Cell Kultur og adenovirus infeksjoner
SCC-13 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) og ble opprettholdt i høy glukose DMEM (Gibco, 11960-044) supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 5% føtalt bovint serum (Sigma, St. Louis, MO). Adenovirus ble fremstilt som tidligere beskrevet [10]. tAd5-TIG3
1-164, er en tetracyklin-induserbar virus som koder for det full-lengde TIG3 protein og en tetracyklin-følsom forsterker-element [10], [11]. Ad5-TA virus koder for tetracyklin transaktivator (TA). tAd5-EV er en tom virus brukt som en kontroll. For infeksjon ble cellene vasket med PBS, inkubert med 10 MOI på TIG3-koding eller tom virus i nærvær av 5 MOI av Ad5-TA i DMEM inneholdende 6 ug /ml polybrene (Sigma, H9268). Etter 5 timer ble mediet erstattet med virusfritt medium og inkubering ble fortsatt i ytterligere 24-72 timer før fremstillingen av celler og ekstrakter av immunohistologi og immunoblot.
Immunologiske metoder
for immunoavtrykket, ble ekstrakter fremstilt i cellelyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 150 mM NaCl, 1 mM etylenglykol-bis (aminoethylether) -tetraeddiksyre, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM glycerofosfat, 1 mM natrium-vanadat, 1 ug /ml leupeptin (Cell Signaling, 9803, Danvers, MA) og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid. protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved anvendelse av Bradford Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad,
