Abstract
Hypoksi har vært lang tid anerkjent som viktig kreftfremmende mikromiljøet. I et slikt energi restriktiv tilstand, post-transkripsjonsmekanismer få betydning over energi dyrt gentranskripsjon maskiner. Her viser vi at utbruddet av hypoksi-indusert kreft stamcelle funksjoner krever beta-catenin avhengig post-transkripsjonell oppregulering av CA9 og SNAI2 genekspresjon. Som svar på hypoksi, beta-catenin beveger seg fra plasmamembranen til cytoplasma hvor det binder og stabiliserer SNAI2 og CA9 mRNA, i samarbeid med mRNA stabiliserende protein Hur. Vi tilbyr også bevis for at den etter transkripsjonen aktivitet av cytoplasma beta-catenin opererer under normoxia i basal-lignende /trippel-negativ brystkreft celler, hvor beta-catenin knockdown undertrykker stamcelle fenotype
in vitro Hotell og tumorvekst
in vivo
. I slike celler, rakne vi generalisert involvering av beta-catenin drevet maskineri i stabiliseringen av EGF-indusert mRNA-er, inkludert kreft stamcelle regulator IL6. Vår studie fremhever den viktige rollen som ettertranskripsjons mekanismer i vedlikehold /kjøp av kreft stamcelleegenskaper og antyder at hindring av cytoplasma beta-catenin funksjon kan representere en enestående strategi for målretting brystkreft stilk /basal-lignende celler.
Citation: D’Uva G, Bertoni S, Lauriola M, De Carolis S, Pacilli A, D’Anello L, et al. (2013) Beta-catenin /Hur Post-Transkripsjonell Machinery reglene Cancer Stem Cell Funksjoner som respons på hypoksi. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10,1371 /journal.pone.0080742
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 07.10.2013; Publisert: 15.11.2013
Copyright: © 2013 D’Uva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av: italienske departementet for utdanning, universiteter og forskning stipend PRIN 2008KTRN38 «klinisk, diagnostiske og terapeutiske implikasjoner av studier på brystkreft stamceller» til MT og MB; Cassa di Risparmio i Bologna Foundation «Ruolo della regolazione della Sintesi proteica nelle cellule staminali del cancro» (n. 135 /2010-0102) til LM og MB. RFO midler ex 60%, Cornelia og Roberto Pallotti Foundation (n. 2011-110512) til MB. Forfatterne takker Fondazione Cassa di Risparmio i Bologna og Fondazione Banca del Monte e Ravenna for å støtte Senter for Applied Biomedical Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
stamceller er skjult i spesialiserte nisjer hvor lavt oksygenspenning (hypoksi) bidrar til regulering av selvfornyelse og differensiering [1-3]. Faktisk, opprett hypoksi den udifferensiert tilstand av embryonale, blodkreft, mesenchymale og nervestammen /stamceller [2]. Hypoksi i tumorer er assosiert med dårlig prognose [4]. Celler i hypoksiske tumor regioner stabil hypoksi-induserbar-faktorer (HIFs) og aktivere adaptive genuttrykk som fører til kreft aggressivitet gjennom celleoverlevelse og dedifferentiation [1,5]. Videre HIF aktivitet i en sjelden undergruppe av hypoksiske tumorceller overfører stamcellelignende egenskaper [1-3].
Beta-catenin er en viktig regulator av normal og kreft stamcelleselvfornyelse [6,7 ]. I respons på ulike stimuli, induserer beta-catenin uttrykket av målgener ved skytteltrafikk inn i kjernen, hvor den kommuniserer med TCF /LSF familie transkripsjonsfaktorer [6].
Fysisk interaksjon mellom HIF-1alpha, den store spilleren i hypoksi respons, og beta-catenin har blitt beskrevet [8]. Videre beta-catenin og HIF-1alpha synergi lette hypoksi overlevelse i tykktarm kreft celler og selvfornyelse i nevrale stamceller [8,9].
Hypoksi er en energi restriktiv tilstand, som markert reduserer total
de novo
transkripsjon og fremmer energisparende post-transcriptional regulering av pre-eksisterende mRNA [10-12]. Nyere studier rapporterer at beta-catenin modulerer halveringstid på cytoplasmatiske mRNA [13-17]. Disse data fører til oss anta at den post-transkripsjonelle aktivitet av p-catenin spiller en viktig rolle i tilpasningen av kreftceller til hypoksi. Her analyserte vi rollen som beta-catenin i mRNA produksjon og stabilisering av to viktige brystkreft stamcelle regulatoriske gener, dvs. karboanhydrase 9 (CA9) og SNAI2. Ekspresjonen av CA9 og SNAI2 gener er indusert ved hypoksi, via HIF1-alfa-mediert transkripsjonen oppregulering [18-20]. CA9 ekspresjon regulerer pH-verdien i hypoksisk mikromiljøet for å fremme overlevelse og proliferasjon av kreft stamceller [21,22]. Derfor CA9 har vært foreslått som et anticancerterapi target [23,24]. SNAI2, også kjent som SLUG, er en viktig funksjonell suppressor av menneskelig brystkreft stamcelle avstamning engasjement og differensiering, fremme normal og svulst melkekjertlene stilk /stamceller tilstand [25,26].
Vi her rapporterer at cytoplasma opphopning av beta-catenin respons på hypoksi aktiverer en post-transcriptional de-differensiering og overlevelse program, noe som forbedrer stamcelle funksjoner i brystkreftceller. Fenomenet er avhengig av evnen til cytoplasmatisk beta-catenin til å binde og stabilisere SNAI2 og CA9 mRNA. Vi tilbyr også bevis for at den etter transkripsjonen aktivitet av cytoplasma beta-catenin opererer under normoxia i basal-lignende /trippel-negativ brystkreft celler. Den basale lignende /trippel-negativ brystkreft er en dårlig differensiert og aggressiv brystkreft subtype, karakterisert ved ekspresjon av en stamcelle-lignende gen profil [27,28], med det cytoplasmatiske lokalisering av beta-catenin [29-31 ] og ved CA9 og SNAI2 genet overekspresjon [32,33]. I slike celler, beta-catenin knockdown dramatisk redusert stabilitet og uttrykk for CA9 og SNAI2 mRNA og blunts stamcelle fenotype
in vitro Hotell og xenograft-etablere evne
in vivo
. Videre har beta-catenin beta-catenin var i stand til å regulere mRNA-stabilitet av flere EGF-indusert mRNA, hvorav de pro-inflammatorisk cytokin interleukin 6 (IL6), en anerkjent kreft stilk-vekstfaktor [21,34]. Dataene her rapporteres markere rollen som post-transkripsjonsmekanismer i reguleringen av kreft stamcelle funksjoner, og identifisere beta-catenin som en sentral post-transcriptional aktør i brystkreft stamcelle fenotype. Vi foreslår at hindring av beta-catenin post-transkripsjonen aktivitet her beskrevet representerer en ennå ikke utforsket strategi for å målrette brystkreft stilk /basal-lignende celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer, kjemikalier og hypoksi eksponering
Vi brukte MCF7 celler som en modell for godt differensiert luminal brystkreft og MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler som en modell av dårlig differensiert basal-lignende brystkreft [35 ]. Alle cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 ble dyrket i RPMI-1640, DMEM /F12 og DMEM respektivt. Alle media ble supplert med 10% FBS, 1% penicillin og streptomycin og 1% glutamin Euroclone (Milan-Italia). Alle normoksisk cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2-fuktet atmosfære. Hypoksi (1% pO
2, 5% pCO
2, 94% pN
2) ble oppnådd i en
Invivo
300 hypoksi kabinett (Ruskinn Technology, Bridgend, UK) for 48 h. Celledød ble evaluert av trypanblått farging.
Generering av MS fra primær brystkreft vev og cellelinjer
MS fra menneskelige mammary kjertel vev ble oppnådd som tidligere beskrevet [21]. Kort sagt ble vevsprøver plassert i sterile Epicult media (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), hakket med sterile skalpeller, og inkubert i 6-12 timer i nærvær av 1000 U Kollagenase /Hyaluronidase enzymblanding (StemCell Technologies) og filtrert gjennom et 40 mikrometer nylon mesh (Becton Dickinson), resuspendert i fullstendig MEGM og belagt i 1 cm
2 lave festeplater. Sekundær MS generasjon ble oppnådd ved å inkubere primær eller sammenhengende MS i 1 x Trypsin-EDTA-løsning (Cambrex) i 3 minutter, filtrering gjennom en 40 um nylonnett og enkelt celle resuspensjon i fullstendig MEGM. MS ble scoret på dag 7. Clearance ble hentet fra S.Orsola-Malpighi Hospital etisk komité, University of Bologna (Prot. N. 75/2011 til LM og MB og MT). Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra pasienter hvis vev ble anvendt i studien. MCF7–MS ble generert av seeding 5000 MCF7 celler i lav vedlegg 24 godt og scoret på dag 5.
Stall Beta-catenin og SNAI2 knockdown i MCF7-, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler
Stall beta-catenin knockdown i MCF7-, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler ble oppnådd ved transducing den pCtoGMB-GFP retroviral vektor som bærer human beta-catenin spesifikke 19nt kodende sekvens (GAGCCTCTATACCACCCAC) av en PCR -basert kloningsstrategi, som tidligere beskrevet for shSNAI2 vektor [20]. shBeta og shSNAI2-infiserte celler ble selektert ved GFP cytofluorimetric sortering som tidligere beskrevet [20].
immunfluorescens og Konfokalmikroskopi analyse
dyrkede celler ble sådd på dekkglass på 60% samløpet, mens MS ble dyrket i BD redusert Matrigel
TM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Celler ble fiksert med 2% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,2% Triton X-100. Celler ble inkubert med anti-beta-catenin primære antistoff (klon E5, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) og sekundær anti-muse-FITC-konjugert antistoff (Dako Cytomation, Glostrup, DK). Kjerner var kontra farget med propidiumjodid og montert i anti-fade Pro-lang reagens montering medium (Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, USA). Bilder ble tatt med en Zeiss LSM 710 på en Zeiss Observer Z1 eller en Leica DMI 6000B invertert mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland).
Transient transfeksjon av siRNA og ekspresjonsvektorer
CA9-, Hurtig- og SNAI2 spesifikke sirnas og ikke-spesifikke siRNA kontroll (siSCR) oligonukleotider (Stealth
TM -teknologi) med en matchet GC innhold ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmider som koder vill type beta-catenin (Beta-WT, PCI neo), dominant negative pcDNA4-TCF4DN (TCF4DN), og koding Pter + shBeta-catenin (shBeta) vektor ble oppnådd fra Dr. Marc Van De Wetering (Hubrecht Institute, Utrecht, Nederland) og Bert Vogel (Johns Hopkins University, MD, USA). Plasmid koding HIF1-alfa ble hentet fra Eric Huang (Institutt for nevrokirurgi, University of Utah, Salt Lake City, Utah). Villtype EGFR koding vektor ble hentet fra Pier Paolo di Fiore (European Institute of Oncology, Milano, Italia); sirnas eller plasmider ble transfektert til MCF7-celler (10
5-celler i en 3 cm
2 brønn) ved en konsentrasjon på 1 ug /brønn i 72 timer eller 24 timer henholdsvis ved å bruke lipofektamin 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY ), eller Jet-Pei (Polyplus, Illkirch, Frankrike) i tilfelle av MS. MCF7 celler stabilt transduced med en retroviral vektor som koder for en p53 dominerende inaktive mini-protein (p53D) ble tidligere beskrevet [36].
Gene promoter og mRNA 3’UTR luciferase reporter analyser
karboanhydrase -9 luciferase plasmid (CA9-Luc, som spenner over -170 til 34 regionen CA9 promoter), ble vennlig levert av Dott. Jaromir Pastorek; HIF1alpha svarer luciferase plasmid, HRE-Luc, ble vennlig levert av Dr. Giovanni Melillo (Tumor hypoksi laboratorium, National Cancer Institute, Frederick, MD, USA). SNAI2-Luc plasmid ble vennlig levert av Dr. Togo Ikuta (Saitama Cancer Centre, Saitama, Japan); TopFlash, var en gave fra Dr. Rolf Kemler (Max Planck Institute, Heidelberg, Tyskland); Østrogen Response Element (ERE-Luc) reporter ble levert av Rakesh Kumar (Institutt for molekylær og Cellular Oncology, MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas); Thymidine Kinase Renilla luciferase reporter plasmid (Promega, Madison, WI) ble anvendt som kontroll i luciferase-assay etter 24 timer ved hjelp av Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Data er uttrykt som brette forandringer av ildflue enn Renilla luciferase-aktivitet. CA9 og SNAI2 3’UTR luciferase assay konstruksjonene ble hentet fra Genecopoeia (Rockwell, Maryland, USA). Hver cellelinjen ble transfektert med 3’UTR-CA9 /SNAI2 vektor eller med kontroll pEZX-MT01 tom vektor. Data er presentert som forholdet mellom 3’UTR-CA9 /SNAI2 over kontrollen vektor, i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA ekstraksjon og cDNA forsterkning
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp TRIzol® Reagens henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, California). Primere og PCR-forhold er rapportert i tabell S1.
Real-Time PCR-analyse
Real-Time PCR-analyse ble utført av TaqMan tilnærming i aiCycler iQ ™ Real-Time PCR DetectionSystem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Hver prøve ble analysert i triplikat. Sett av primere og fluorogene prober spesifikke for CA9, SNAI2, ESR1, IL6 og CD44 mRNA ble kjøpt fra Applied Biosystems. Reaksjonene ble inkubert ved 50 ° C i 2 minutter; 95 ° C i 15 minutter etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative mengden av mål-mRNA ble beregnet lik 2
– (Δ
C
t mål mRNA Δ
C
t-kontroll), under anvendelse av human beta-glukuronidase mRNA som kontroll, med unntak av mRNA immunoprecipitation analysen, mRNA stabilitet analysen, og cytoplasmatiske fraksjone analysen.
Høy gjennomstrømning Gene Expression Måling med real Time PCR i et mikrofluid Dynamisk Array (Fluidigm® real-Time PCR)
RNA ble isolert ved hjelp av PerfectPure RNA Cultured Cell Kit med DNAse-en fordøyelse (5 Prime, Hamburg, Tyskland). cDNA ble syntetisert ved bruk av SuperScriptII første-tråd-syntese-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA). For qPCR av pre-mRNA og mRNA henholdsvis forover primere ble plassert i den andre intron og exon, og en felles revers primer (her kalt universell) ble plassert i det tredje ekson konstitutiv. For genene som universelle primere sekvenser ikke var tilgjengelig, ble 2 par av primere designet for å forsterke henholdsvis intronic og exonic sekvenser. Hver cDNA prøve ble blandet med pool av primere for en pre-forsterkning reaksjon av 14 sykluser med Reagens (Fluidigm PN 85000735) og TaqMan PreAmp Master Mix, i henhold til produsentens instruksjoner. Den Preamplified cDNA ble fortynnet 1: 100. Den modifiserte 2 x TaqMan universell Master Mix ble tilsatt til den fortynnede cDNA for å oppnå en sluttkonsentrasjon på Master Mix 1x i prøvene. Brikken ble primet i NanoFlexTM 4-IFC Controller før lasting av prøver og assayreagenser inn i viker. Data ble analysert ved hjelp Ct verdier og ΔΔCt verdier. Hver prøve var i triplikater og normalisert enten på GAPDH, B2M og TBP. Primer sekvenser er oppført i tabell S2.
Western Blot og co-immunoprecipitation analysen
Totalt proteiner ble ekstrahert med RIPA buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 145 mM NaCl, 1% NP -40, SDS 0,1%, Na-Deoxycolate 0,5%) tilsatt med proteasehemmer Cocktail (Roche, Basel, Sveits). Western blot analyse ble utført ved hjelp av følgende antistoffer: laminin, Beta-tubulin, anti-beta-catenin (E5), anti-Actin (C4) kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA); anti-Hur (Molecular sonder, Invitrogen) kjøpt fra molekylære prober; anti-CA9 (AF2188) kjøpt fra R D (Minneapolis, MN) og klone M75 vennlig levert av professor J. Pastorek (Slovakiske Academy of Science (Bratislava, Tsjekkia) Samtidig immunoprecipitation analysen ble utført i CO-IP buffer (. 50 mM tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40) lagt med proteasehemmere (Roche).
mRNA immunoprecipitation analysen
mRNA immunoprecipitation analysen ble utført etter standard protokoll som bevarer mRNA /protein-interaksjon ved hjelp av Polysome lyseringsbuffer [37]. i korte trekk dyrkede celler ble suspendert i lyseringsbuffer (100 mM KCl, 5 mM MgCl
2, 10 mM Hepes, pH 7,0, 0,5% Nonidet P-40) supplert med RNase og proteasehemmere. proteiner ble immunopresipitert ved hjelp av protein A-kuler (Santa Cruz) og enten anti-Beta-catenin (E5, Santa Cruz) eller anti-Hur (Molecular prober), eller normal IgG (sc-2025, Santa Cruz) mus antistoffer, i NT-2-buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl
2, 0,05% Nonidet P-40), supplert med RNAase inhibitor (40U /ul), DTT (1 mM). Immunutfelninger ble lysert i Trizol® reagens (Life-teknologi). cDNA ble analysert ved RT-PCR (MCF7 celler, MDA-MB-468 og MDA-MB-231-celler), eller av Real Time PCR (T-MS). Data er presentert som gangers økning av hvert mRNA bundet til det spesifikke antistoff over kontroll-IgG [37].
Actinomycin D-mRNA-stabilitet assay
Stabilitets assay for mRNA ble utført ved å eksponere cellene til Actinomycin D ved 100 ng /ml og vurdere nivået for hver spesifikk mRNA ved forskjellige tidspunkter (0 6 t) : mRNA nivået ved første timen etter Actinomycin eksponering ble tatt som referansepunkt (tid 0)
Cytoplasmatiske pre-ribosom og 40S ribosom fraksjone prosedyre
for isoleringer av ribosomale fraksjoner to 10 cm plater. 80% konfluente celler ble lysert i lyseringsbuffer (10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl pH 7,5). Organfrie cytoplasma ble oppnådd ved å lagre supernatanter etter sentrifugering ved 14 000 x g i 5 min ved 4 ° C. Ribosomale fraksjoner ble deretter separert ved sentrifugering av lysatet ved cytoplasmisk 100,000 g (36.000 rpm) i en SW41Ti rotor (Beckman) på en 15-50% sukrosegradient tilsatt med RNase inhibitor og cykloheksimid. Fraksjoner svarende til 40S ribosom-subenhet eller lav tetthet pre-ribosomale cytoplasma ble anvendt for RNA og protein utvinning (Material S1A-B). RNA ekstraksjon ble utført av TRI-reagens (Ambion). Proteiner ble ekstrahert med TCA ved 4 ° C, tørket ved 95 ° C, og re-suspendert i 1 x Laemli buffer. mRNA ble vurdert av Real Time PCR. Data er presentert som gangers økning av hvert mRNA i beta-catenin knockdown-celler sammenlignet med kontroller.
Cytofluorimetric analyse
Cellene ble vasket en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter høstet med celledissosiasjon løsning ikke-enzymatiske 1x (Sigma). Frigjorte celler ble vasket med PBS inneholdende 5% FCS og 0,1% natriumazid (vaskebuffer) og resuspendert ved en konsentrasjon på 0,5 * 10
6 celler /100 pl vaskebuffer. Kombinasjoner av fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer hentet fra BD Biovitenskap Pharmigen (San Diego, California, USA) mot humant CD44 (G44-26, APC,. Katt # 560890) og CD24 (PE-Cy7;. Katt # 561646) eller deres respektive isotype kontroller ble tilsatt til cellesuspensjonen ved konsentrasjoner som anbefales av produsenten, og inkubert ved 4 ° C i mørke i 30 min. De merkede cellene ble vasket i vaskebuffer og deretter analysert på en LSR II Flowcytometer (BD Biosciences).
Foci dannende analysen
For å teste evnen til utvalgte cellelinjer for å danne foci ble cellene sådd ut i seks-vel-plater, opprettholdes på con innflytelse, erstatte mediet hver 3-4 dager. Foci ble scoret på dag
th 14.
Xenotransplantat analyse og vev immunhistokjemi
2 * 10
6 MDA-M6B-468 celler ble injisert i melkefettpute kvinnelige nakne mus. Tumorvekst ble overvåket ukentlig og deretter fjernet etter 10 uker (Weizmann Institute Animal Care og bruk komité godkjente dyreforsøk, IACUC n. 01990412-2). 1 * 10
6 MDA-MB-231-celler ble injisert subkutant i flanken av nakne mus. Tumorvekst ble overvåket ukentlig, og deretter fjernet etter 4 uker. (Animal Etisk komité University of Bologna godkjente dyreforsøk, prot. N. 8134-X /10). Formalinfiksert /parafin innebygd vev ble farget med Hematoxylin-Eosin, og vurderes av immunonistochemistry, med følgende antistoffer: anti-ESR1 (klone ID5, DakoCytomation, Glostrub, Danmark); anti-CDH1 (klone NCH38, Dako Cytomation), anti-SNAI2 (L40C6, Cell Signal, Beverly, MA), anti-CA9 (klone M-75, vennlig levert av J. Pastorek, slovakisk Academy of Sciences, Bratislava).
Statistikk og bioinformatikk
bioinformatikk analyse på AU-Rich element som inneholder mRNA ble utført konsultere online database AREsite [38] (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi -bin /AREsite.cgi). Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av SPSS programvare. Data er presentert som gjennomsnitt +/- s.d .; p-verdiene refererer til
t
testen oppgis, med mindre annet er spesifisert (n = 3).
Resultater
Hypoksi utløser brystkreft celle dedifferentiation og overlevelse /spredning ved å utløse CA9 og SNAI2 uttrykk
in vitro
, brystkreft stammen /progenitor funksjoner er overrepresentert i mammospheres (MS) [39]. Vår undersøkelse ble bedt av den observasjon at eksponering eller pre-eksponering for hypoksi (1% pO
2) økte MS dannende evne MCF7 celler (Figur 1a), og av ductal bryst karsinom vev-avledet celler (T-MS figur 1B). Vi observerte at i MCF7-celler, så vel som i T-MS, hypoksi øket mRNA ekspresjon av to avgjørende brystkreft stamcelle regulatoriske gener, nemlig karbonsyreanhydrase 9 (CA9) og SNAI2 (figur 1C), via
de novo
mRNA produksjon (Figur S1 A). Viktigere, SNAI2 shRNA knockdown redusert normoksiske MS forming evne, samt avstumpet hypoksi MS ekspansjon (figur 1D). Konsekvent, siRNA-mediert SNAI2 knockdown tuklet hypoksisk T-MS dannelse (figur S1B). Videre shRNA-mediert SNAI2 knockdown stanses den hypoksi-indusert nedregulering av de epiteliale differensieringsmarkører østrogen reseptor alfa (ESR1), keratin 18 (KRT18) og E-cadherin (CDH1) (figur 1E og fig S1C) og hypoksi- indusert oppregulering av CD44 ekspresjon (figur 1F), en markør for brystkreft stilk /stamceller [21,40]. Til slutt, i samsvar med den pro-overlevelse /proliferative rolle CA9 [21,22], siRNA-mediert CA9 stanse økt celledød og hindret MS dannelse i hypoksiske MCF7 celler (figur 1G). Disse data viser at hypoksi induserer en SNAI2 avhengig de-differensiering program og et CA9 avhengig overlevelse /proliferering program, som fører til en økning i stammen /stamceller sub-populasjon (figur 1 H).
, Mammosphere (MS) dannelsesbestemmelsen i MCF7-celler i respons til hypoksi eksponering (1% pO
2) eller etter pre-eksponering av adherente celler til 1% pO
2 (pre-1% pO
2) ; MS forming evne MCF7 celler i normoxia (Nor) er rapportert som basal verdi; B, Tumor MS-analysen (T-MS) i Nor /1% pO
2 ductal brystkarsinom vev-avledede celler, n = 5; representative bildene som følger; C, CA9 og SNAI2 mRNA i Nor /1% po
2 MCF7 celler og T-MS; D, MS-analysen av Ctrl /SNAI2 spesifikke shRNA retroviral vektor (shSNAI2) -transfected MCF7 celler eksponert for Nor /1% pO
2; E, Real-Time PCR-analyse av ESR1 og KRT18 mRNA nivåer i Ctrl /shSNAI2 MCF7 celler eksponert for Nor /1% pO
2; F, Real-Time PCR-analyse av CD44 mRNA nivåer i Ctrl /shSNAI2 MCF7 celler eksponert for Nor /1% pO
2; G, Celledød og MS analyse i rykke ut (Ctrl) og CA9 siRNA (siCA9) transfektert MCF7 celler eksponert for Nor /1% pO
2; H, Skjematisk fremstilling av rollen CA9 og SNAI2 i reguleringen av kreft stamcelle funksjoner som svar på hypoksisk mikromiljøet. Data er presentert som gjennomsnitt +/- s.d .; p-verdiene refererer til t-test. n = 3, med mindre annet er spesifisert.
Beta-catenin øker brystkreft stamcelle fenotype som respons på hypoksi uavhengig av sitt atom transkripsjonen aktivitet
Vi undersøkte rollen beta -catenin i reguleringen av CA9 og SNAI2 avhengig brystcancer stamcelle-fenotype. MCF7-celler som bærer P-catenin spesifikk shRNA retroviral vektor (shBeta) viste en dramatisk reduksjon av SNAI2 og CA9 proteinekspresjon (figur 2A), kombinert med redusert normoksiske MS dannelse og nedsatt hypoksisk MS ekspansjon (figur 2B). Brystkreft stilk /stamceller er også overrepresentert i CD44
høy /CD24
lav sub-befolkningen [40]. I samsvar med dataene på MS, MCF7-shBeta celler avslørt innskrenket andel av CD44
høy /CD24
lave celler i normoxia, og avstumpet CD44
høy /CD24
lav befolkning ekspansjon etter hypoksi (figur 2C ). I langtids hypoksi-eksponert MCF7–shBeta celler, vi også observert redusert evne til å danne foci (figur S2A). Videre shRNA mediert beta-catenin knockdown bemerkelsesverdig redusert myk agar-kolonidannelse evne (figur S3A), sistnevnte blir en strengere
in vitro
analyse for påvisning av celle malign transformasjon. Disse data førte oss til grunn at beta-catenin knockdown vanskelig stilk /stamceller selvfornyelse. Interessant, beta-catenin knockdown også hindret hypoksi-indusert nedregulering av ESR1 (figur 2D), avslører evnen til beta-catenin til å spille en sentral rolle i den hypoksi-indusert de-differensiering program som paralleller til gevinst på stamcelle egenskaper hos brystkreftceller. Vi observerte at hypoksi fremkalt betydelig delokalisering av beta-catenin fra cellemembranen til cytoplasma, dette faktum blir parallell i en reduksjon i celle-til-celle-kontakter (figur 2E). Interessant, hypoksi utløst hverken beta-catenin nukleær lokalisering eller beta-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet i MCF7-celler og i T-MS (figur 2F, G). Disse data førte oss til å tenke at beta-catenin letter CA9 og SNAI2 uttrykk og den påfølgende stamcelle fenotype i hypoksi utsatte brystkreft celler, uavhengig av sitt atom transkripsjonen aktivitet.
A, Western analyse (WB) av beta-catenin, SNAI2 og CA9 proteinnivåer i Ctrl /shBeta MCF7 celler ved Nor /1% po
2 forhold; B, MS forming analyse i stabile beta-catenin forstummet (shBeta) MCF7 celler ved Nor /1% pO
2 forhold; C, Cytofluorimetric analyse av CD44
høye /CD24
lav stilk /progenitor befolkningen ctrl /shBeta MCF7 celler ved Nor /1% po
2 forhold; D, Real-Time PCR-analyse av ESR1 mRNA nivå i Ctrl /shBeta MCF7 celler ved Nor /1% po
2 forhold; E, immunfluorescens (IF) analyse av Beta-catenin i Nor /1% pO
2 MCF7 celler; F, WB analyse av beta-catenin i Nor /1% pO
2 MCF7 celler cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner (Lamin B og beta-tubulin ble brukt som fraksjone kontroller); G, beta-catenin /TCF transkripsjonen reporter (TOPFLASH) assay i MCF7 celler og T-MS etter Nor /1% pO
2. Data er presentert som gjennomsnitt +/- s.d .; p-verdiene refererer til t-test. n = 3, med mindre annet er spesifisert.
Hypoksi induserer CA9 og SNAI2 uttrykk via HIF1-alpha avhengig mRNA transkripsjon og beta-catenin avhengige mRNA stabilisering
CA9 og SNAI2 er hypoksi-induserbar -faktor-1-alfa (HIF-1alpha) transkripsjons mål [8,20]. Nylig har det blitt foreslått at P-catenin fremmer CA9 ekspresjon, ved å virke som HIF-1alfa transcriptional ko-faktor i colon cancerceller [8]. Etter oppfordring fra disse dataene, forsøkte vi å undersøke effekten av beta-catenin på HIF-1alpha avhengig transkripsjon, samt på CA9 og SNAI2 promoter aktivitet. Overraskende, luciferase drevet responsive reporter analysen viste at beta-catenin over-uttrykk vanskelig HIF1-alpha transkripsjonen aktivitet på hypoksi eksponering eller etter HIF1-alfa transient overekspresjon (figur 3A). Konsekvent, beta-catenin knockdown utløst HIF1-alpha transkripsjonen aktivitet (figur 3B). Tilsvarende beta-catenin undertrykte hypoksi-indusert CA9 og SNAI2 gener promoter aktivitet (figur 3C). Disse funnene peker til utbruddet av antagonistisk aktivitet mellom beta-catenin og HIF1-alpha mediert transkripsjon i hypoksi utsatte brystkreft celler. I tråd med disse resultatene, transfeksjon av den dominerende negative isoform av TCF4 (TCF4-DN), som stopper beta-catenin transkripsjonen aktivitet [6], var ikke i stand til å redusere CA9 og SNAI2 mRNA uttrykk i hypoksi-eksponerte MCF7 celler (Figur S3b). Bevis for at beta-catenin reduserer paradoksalt CA9 og SNAI2 promoter aktivitet, men øker uttrykket nivåer av beslektet mRNA, bedt oss om å undersøke mRNA stabilitet som et nytt lag av beta-catenin avhengig funksjon. For å bevise denne hypotesen, brukte vi actinomycin D, en hemmer av Polymerase 2 (Pol2) som svekker
de novo
mRNA transkripsjon. I tråd med vår hypotese, stabile beta-catenin lyddemping forkortet CA9 og SNAI2 mRNA halveringstid i hypoksi utsatt MCF7 celler (figur 3D). Disse data tyder på at den hypoksi-indusert de-differensiering /stamcelle program i brystcancerceller er avhengig av HIF1alpha-avhengig produksjon av CA9 og SNAI2 mRNA, etterfulgt av p-catenin avhengig stabilisering av disse mRNA (figur 3E).
A, HIF-1alpha transkripsjonen reporter (HRE-Luc) assay i MCF7 celler transfektert med villtype beta-catenin (Beta-wt) under Nor /1% po
2 forhold eller i kombinasjon med HIF1 alfa (HIF1a) koding vektor; B, HRE-Luc analysen i 1% pO
2-eksponert ctrl /shBeta MCF7 celler; C, CA9-Luc og SNAI2-Luc analysen i ctrl /Beta-wt transfektert og ctrl /shBeta MCF7 cellene under Nor /1% po
2 forhold; D, CA9 og SNAI2 mRNA stabilitet analysen etter hemming av Polymerase 2 transkripsjonen aktivitet av actinomycin D (100 ng /ml) i ctrl /shBeta MCF7 celler eksponert for 1% pO
2; E, Skjematisk fremstilling av HIF1-alfa /beta-catenin samspill i brystkreft celler som respons på hypoksi: HIF1-alpha fremmer transkripsjon og cytoplasmatiske beta-catenin forbedrer stabilisering av SNAI2 og CA9 mRNA; den negative effekten av p-catenin på HIF-1alfa-indusert transkripsjon er også avbildet. Data er presentert som gjennomsnitt +/- s.d .; p-verdiene refererer til t-test. n = 3, med mindre annet er spesifisert.
konstitutivt aktiv beta-catenin post-transcriptional aktivitet i basal-lignende /trippel-negativ brystkreft celler
Når vi sammenlignet MCF7- avledet MS til beslektede tilhenger celler for CA9 og SNAI2 uttrykk, fant vi høyere CA9 og SNAI2 promoter aktivitet og mRNA uttrykk som ble stanset i shBeta normoksiske MS (figur 4A-B). Riktignok fenomenet Parallelt med økningen i beta-catenin cytoplasmatisk lokalisering (figur 4C), tilsvarende nivåer av total beta-catenin protein og transkripsjonen aktivitet var til stede i vedheftende og MCF7 avledet MS (figur 4D). Disse data påpeke at den post-transkripsjonelle aktivitet av p-catenin kan være involvert i opprettholdelsen av stammen /stamcelle status, selv i normoxia.
