Abstract
Bakgrunn
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) indusert av hypoksi er en av de kritiske årsakene til behandlingssvikt i ulike typer kreft hos mennesker. NF-kB er tett involvert i utviklingen av EMT. Sammenlignet med HIF-1α har korrelasjonen mellom NF-kB og EMT under hypoksi blitt mindre studert, og selv om fenomenet ble observert i det siste, de molekylære mekanismene som er involvert forble uklart.
metodikk /hovedfunnene
Her rapporterer vi at hypoksi eller overekspresjon av hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) fremmer EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler. På molekylært eller farmakologisk hemming av NF-kB, hypoksiske cellene gjenvunnet uttrykk for E-cadherin, mistet uttrykk for N-cadherin og svekket deres meget inngripende og resistent fenotype. Vi presenterer en pcDNA3.0 /HIF-1α i kreft i bukspyttkjertelen celler under normoksisk forhold forsterket NF-kB aktivitet, phenocopying EMT effekter produsert av hypoksi. Motsatt hemme økt NF-kB aktivitet i denne innstillingen dempes EMT fenotype.
Konklusjon /Betydning
Disse resultatene tyder på at hypoksi eller overekspresjon av HIF-1α induserer EMT som er i stor grad avhengig på NF-kB i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Cheng ZX, Sun B, Wang SJ, Gao Y, Zhang YM, Zhou HX, et al. (2011) Nuclear Factor-kB-Dependent Epitelial å Mesenchymale Transition indusert av HIF-1α Activation i bukspyttkjertelkreft cellene under hypoksiske betingelser. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10,1371 /journal.pone.0023752
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 20 april 2011; Godkjent: 23 juli 2011; Publisert: 22 august 2011
Copyright: © 2011 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra New Century Support Foundation for Elitist av kinesiske utdanningsdepartementet (NCET-07-0248), det vitenskapelige grunnlag for Prominent Youth i Heilongjiang-provinsen, Kina (JC200717), den vitenskapelige og teknologiske Prosjekt i Heilongjiang-provinsen, Kina (GC09C407-2), og Natural vitenskapelige grunnlag National of China (30571808, 30872987). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen, som er en av de mest aggressive og dødelige kreft på verdensbasis, er svært motstandsdyktig mot kjemoterapi [1]. Selv systemisk behandling med gemcitabin, en gjeldende førstelinjebehandling ved avansert kreft i bukspyttkjertelen har bare beskjeden fordel på grunn av iboende eller ervervet chemoresistance [2], [3]. Videre nyere kliniske studier indikerer at bare 12% av pasientene med langt fremskreden kreft i bukspyttkjertelen har en respons til gemcitabin [4]. De fattige svarprosenten tyder på at kreft i bukspyttkjertelen enten raskt utvikler eller har gemcitabin chemoresistance. Mekanismer som chemoresistance oppstår i bukspyttkjertelkreft er ikke kjent, dermed en bedre forståelse av hvordan motstand oppstår og hva molekylære forandringer forårsake eller korrelerer med motstand vil trolig føre til nye terapeutiske strategier for kreft i bukspyttkjertelen.
Hypoksi er en miljø stimulans som spiller en nøkkelrolle i utviklingen og kreft progresjon . Tumoral hypoksi eller ekspresjon HIF-1 (hypoksi-induserbar faktor-1) er koblet til en aggressiv fenotype som korrelerer med dårlig respons på kjemoterapi og en dårligere total overlevelse av kreftpasienter [5], [6]. HIF-1 er et heterodimert protein bestående av HIF-1β, et konstitutivt uttrykt subenhet, og HIF-1α, et oksygenfølsomt induserbar subenheten. Under normoksisk betingelser blir HIF-1α protein hydroksyleres av en familie av oksygenavhengige prolyl hydroksylasene (PHD1-3); Dette retter seg mot det for polyubiquitination av et proteinkompleks som inneholder von Hippel-Lindau protein (pVHL) og deretter nedbrytning. Under hypoksiske forhold, Prolyl- hydroksylaser er inaktivert, og HIF-1α degradering blokkert; dette gjør at HIF-1α å akkumulere og forbinder med HIF-1β å danne en funksjonell transkripsjonskompleks som utløser transkripsjon av en rekke hypoksi-induserbare gener [7].
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er prosessen som adherente epitelceller konvertere til motile mesenchymale celler og er viktig i embryoutvikling. EMT er nå kjent for å forekomme i en rekke sykdommer, inkludert utviklingen av kreft [8]. I den siste studien, er bevis fremskaffet tyder på at moderat hypoksiske forhold kan utløse, som en selvstendig faktor, en EMT program fører ulike menneskelige kreftceller til en betydelig økning invasive [9]. I mellomtiden noen studier rapporterte også at aktivering av NF-kB er nært involvert i utviklingen av EMT [10] – [13]. Detaljerte undersøkelser av de mange fasetter av EMT programmet har avdekket sitt engasjement i mer enn bare invasjon og metastasering; Nyere studier har vist at fenotypen av EMT er forbundet med chemoresistance i ulike faste tumorer [14] – [17]
nukleær faktor kappa B-(NF-kB) representerer en familie av transkripsjonsfaktorer som modulerer ekspresjon av. gener med ulike funksjoner. Aktiviteten av NF-kB er regulert av NF-kB-inhiberende protein (IkB), som binder seg til og sequesters NF-kB familiemedlemmer i cytoplasma. Når NF-kB-veien aktiveres, IkB fosforylert av IKB-kinase (IKK), som fosforylerer IicB. Fosforylert IkB underkastes ubiquitinering og proteasom-mediert nedbrytning, hvilket resulterer i translokasjon av NF-kB til kjernen. NF-kB er en allestedsnærværende transkripsjonsfaktor regulert av mange stimuli inkludert hypoksi, cytokiner og cellegifter, og har nylig dukket opp som et mål for kreft. NF-kB er konstitutivt aktivert i de fleste humane kreft i bukspyttkjertelen celler og primære tumorprøver, men ikke i normale pankreatiske vev eller nontumorigenic cellelinjer [18] – [20]. Noen nyere studier viste at hypoksi kan aktivere NF-kB og indusere motstand av kreft i bukspyttkjertelen celler til gemcitabin [21] – [23]. Tidligere rapporterte vi at bruk Dihydroartemisinin eller liten interfererende RNA (siRNA) inaktiverer NF-kB og forsterker antitumoreffekt av gemcitabin på kreft i bukspyttkjertelen både in vitro og in vivo [24], [25].
I denne studien, søkte vi bevis på at kreft i bukspyttkjertelen celler (PANC-1, BxPC3) under hypoksiske forhold gjennomgår prosessen med EMT og tilegne invasive og multiresistent fenotyper i en NF-kB avhengig måte. Heri, viste vi at hypoksi eller overekspresjon av HIF-1α aktivert NF-kB og fremmet EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler. På molekylært eller farmakologisk hemming av NF-kB, hypoksiske cellene gjenvunnet uttrykk for E-cadherin, mistet uttrykk for N-cadherin og svekket deres meget inngripende og resistent fenotype. Vi presenterer en pcDNA3.0 /HIF-1α i kreft i bukspyttkjertelen celler under normoksisk forhold forsterket NF-kB aktivitet, phenocopying EMT effekter produsert av hypoksi. Motsatt hemme økt NF-kB aktivitet i denne innstillingen reversert EMT fenotype. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at hypoksi eller overekspresjon av HIF-1α indusere EMT som er i stor grad avhengig av NF-kB i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Resultater
Hypoksi resulterer i morfologiske og celle biologiske endringer som er karakteristiske for EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler
for å rekapitulere effekten av hypoksi som det skjer i kreft i bukspyttkjertelen, vi utsettes 55-60% subsammenflytende kreft i bukspyttkjertelen celler (Panc-1, BxPC-3) til hypoksiske betingelser (1% O
2, 5% CO
2, og 94% N
2) opp til 48 timer. Vi observerte markerte forskjeller i morfologi og tendensen til å danne celle reir eller klynger mellom kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske forhold og deres normoksisk kolleger (95% luft og 5% CO
2). De normoksisk cellene viste en mangekantet form og brosteinslignende plater, en indikasjon på en epitelial fenotype. I motsetning til de hypoksiske celler begynte å tape celle kontakter, spredt fra cellegrupper, samt at en langstrakt, fusiforme morfologi med dendrittiske prosesser, i samsvar med en mesenchymale overgang (fig. 1B).
(A) Western blot-analyse av epitelial markør (E-cadherin) og mesenkymale markører (vimentin, N-cadherin) og HIF-1α av PANC-1, BxPC-3-celler i henhold til normoksisk (N) eller hypoksisk (H) betingelser i 48 timer. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter ble vist. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) Fasekontrast-analyse (opprinnelig forstørrelse x 100) av morfologiske endringer funnet i bukspyttkjertelcancerceller under normoksiske og hypoksiske betingelser i 48 timer. (C) Immuofluorescence farging av E-cadherin og vimentin i PANC-1, BxPC-3 celler under normoksiske og hypoksiske betingelser i 48 timer. Grønn representerer E-cadherin flekker, mens rød representerer vimentin farging. Blå signal representerer kjernefysiske DNA farging av DAPI. (D) Levedyktigheten av cellene ble bestemt ved celletelling leder-8-analyse og brukes til å beregne indeksen levedyktighet. PANC-1 og BxPC-3-celler ble eksponert for gemcitabin (0 umol /l) i 48 timer som grunnlinjen. *,
p
0,05. (E) Den proliferasjon av celler ble målt ved hjelp av krystall-fiolett analyse. Tallene ble valgt som representative scener fra tre uavhengige eksperimenter. (F) Matrigel invasjon assay. Venstre, photomicrographs av celler som har gått gjennom Matrigel henhold normoksisk eller hypoksiske forhold i 48 h (opprinnelig forstørrelse, × 100). Høyre, kvantifisering av invasjonen. *,
p
. 0,05
For å bekrefte om kreft i bukspyttkjertelen celler gikk EMT utsatt for hypoksi, vi også bestemt uttrykket av markører for epiteliale og mesenkymale fenotyper av Western blot analyse . Som vist på fig. 1A, hypoksiske celler gjennomgikk en «cadherin switch», der de manifestert redusert E-cadherin uttrykk og økt N-cadherin uttrykk. I tillegg, ekspresjon av HIF-1α, en viktig markør for hypoksi vei, ble funnet intenst uttrykt under hypoksiske tilstand på (1A Fig.) I 48 timer. Immunfluorescens farging ble ansatt for å ytterligere bekrefte EMT fenotype endringer av kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksisk tilstand. Det ble vist at ekspresjon av E-cadherin og redusert ekspresjon av vimentin øket når sammenlignet med de i normoksisk-celler (fig. 1C).
Kreftceller som har gjennomgått EMT har en tendens til å oppvise større legemiddelresistens og invasivitet . Som sådan, undersøkte vi disse egenskapene i normoksisk celler versus hypoksiske celler i celletelling Kit-8-analysen, krystallfiolett analysen og Matrigel invasjonen assay. Slående forskjeller ble observert. Cell Counting Kit-8-analysen ble brukt til å vurdere celleviabilitet rate. PANC-1 og BxPC-3-celler ble utsatt for graderte doser av gemcitabin (0-200 umol /L) i 48 timer. Data er vist i fig. 1D, når de behandles med konsentrasjonen av gemcitabin som er større enn 100 nmol /L, hypoksiske celler viste signifikant høyere cellelevedyktighet frekvens enn normoksisk vev. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved krystallfiolett analyse (fig. 1E), når cellene ble behandlet med gemcitabin (10 umol /L for PANC-1 og 500 nmol /L for BxPC-3) under hypoksiske eller normoksisk betingelser i 48 timer, hypoksisk celler viste signifikant høyere celleviabilitet rente enn normoksisk celler. Matrigel invasjon assay ble anvendt for å vurdere celle invasivitet. Både PANC-1 og BxPC-3-celler under hypoksiske betingelser i 48 h lett overført inn i kammeret Matrigel i relativt høye tall, mens deres normoksisk partnere oppviste en markert reduksjon i invasjon (fig. 1F).
I sum våre data indikerer endringer i morfologi, vekstmønster, protein uttrykk, resistens og invasjon støtter forestillingen om at hypoksi fører til EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler.
kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske forhold utstillings økt NF-kB aktivitet
Noen studier har tidligere vist at hypoksi resulterer i aktivering av NF-kB [19], [20]. Derfor søkte vi å finne ut om EMT observert i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold hypoksiske forhold skyldtes økt NF-kB aktivitet. Først dokumentert vi at NF-kB P65 proteiner og NF-kB DNA-bindende aktivitet ble faktisk økt i hypoksiske kreft i bukspyttkjertelen celler sammenlignet med normoksisk kolleger som bestemmes av Western blot analyse og EMSA. I mellomtiden, HIF-1α ble også analysert ved hjelp av Western blot-analyse (Fig. 2A). Panc-1 og BxPC-3-celler ble inkubert i henhold hypoksiske forhold for ulike tidsperioder (24 h, 48 h, 72 h). Etter hver indikert inkubasjonsperioden ble cellene samlet og totale eller kjerneproteiner ble ekstrahert. Som vist på fig. 2A og B, NF-kB p65-proteiner og NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble øket 24 timer etter initiering av hypoksi og opprettholde høye nivåer. Spesifisiteten til gel forskjøvet Båndene i EMSA ble dokumentert av kalde konkurrerende eksperimenter, hvor overskudd av kald vill-type, men ikke kald mutant kB-probe avskaffet signalene fra den forskjøvede båndene.
PANC-1 og BxPC- 3-celler ble dyrket under normoksiske (N) eller hypoksiske betingelser (H) for en rekke perioder (24 timer, 48 h, 72 h). Etter hver indikert inkubasjonsperioden ble cellene samlet opp. Atom ekstrakter og totale proteinekstrakter ble forberedt. (A) NF-kB p65 og HIF-1α ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse fra respektive cellehomogenat. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) EMSA for NF-kB-DNA-bindende aktivitet på de respektive nukleære ekstrakter. Konkurrerende analyse bekreftet spesifisiteten av NF-kB binding til DNA (se Materialer og metoder for detaljer). Høyre to baner, WT, vill-type; m, mutant. (C) VEGF ble analysert ved Western blot-analyse fra respektive cellehomogenat. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (D) Western blot-analyse. Effekter av NF-kB p65 siRNA på VEGF-ekspresjon av PANC-1 og BxPC-3-celler i henhold til hypoksiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
. 0,05
I mellomtiden, HIF-1α ble også analysert ved Western blot analyse. Som vist ved Western blotting (fig. 2A), HIF-1α protein nivåer i kreft i bukspyttkjertelen celler var oppregulert under hypoksi. Økningen i HIF-1α proteinnivå var muligens på grunn av proteinstabilitet effekter som tidligere studert [7]. Siden ekspresjonen av HIF-1α målgen VEGF, en vekstfaktor som kan fremme EMT, medieres av NF-kB, vi også bestemme hvorvidt hypoksi stimulerer VEGF-ekspresjon. Som vist på fig. 2C, Western blotting viste at VEGF protein ekspresjon økte signifikant etter 24 timer med hypoksi og opprettholdes høye nivåer. I motsetning til dette ble det oppregulering av VEGF trykkes av stanse NF-kB p65-ekspresjon i hypoksiske bukspyttkjertelcancerceller ved hjelp av NF-kB p65-spesifikke siRNA, mens ingen effekt ble observert i celler transfektert med styre siRNA (fig. 2D) .
Hemming av NF-kB aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold hypoksiske forhold formidler EMT
etter å ha fastslått at hypoksi fører til forhøyet NF-kB aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi neste undersøkt muligheten for inhibisjon av NF-kB for å dempe mesenchymale egenskapene til hypoksiske celler. Mot dette formål, brukte vi både molekylære og farmakologiske hjelp av hemme NF-kB i disse hypoksiske celler og deretter sammenlignet den resulterende fenotype med kontroll-behandlede celler. Molekyl inhibering ble oppnådd ved siRNA for å nedregulere den p65-subenheten av NF-kB. Vi har også brukt en kommersielt tilgjengelig inhibitor IKK BAY 11-7082 til farmakologisk blokk NF-kB aktivitet. Inhibering av NF-kB aktivitet av enten NF-kB p65 siRNA eller BAY 11-7082 henhold hypoksiske betingelser for 48 timer resulterte i en endring i proteinekspresjon karakterisert ved økt E-cadherin og reduserte N-cadherin uttrykk som bestemt ved Western blot-analyse (fig. 3A), i samsvar med tilbakevending til en epitelial fenotype. Viktigere, hemming av NF-kB ved enten NF-kB p65 siRNA eller BAY 11-7082 førte til en markert nedgang i invasivitet av hypoksiske celler sammenlignet med kontroll behandlet celler i Matrigel invasjonen assay etter hypoksiske betingelser for 48 timer (Fig. 3B) . Når cellene ble behandlet med gemcitabin (10 umol /L for PANC-1 og 500 nmol /L for BxPC-3) i 48 timer med inhibisjon av NF-kB aktivitet enten ved NF-kB p65 siRNA eller IKK-inhibitor i henhold til hypoksiske betingelser, de viste også betydelig lavere levedyktigheten rente enn sine respektive kontroller i krystallfiolett analysen (fig. 3C) og celletelling Kit-8-analysen (fig. 3D). Til tross for disse endringene i protein uttrykk, invasivitet og resistens skyldes til NF-kB blokaden, hadde vi ikke observere noen dyptgripende endringer i morfologi eller vekstmønstre kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske forhold, en observasjon som impliserer NF-kB-uavhengige biokjemiske hendelser som også bidrar til EMT fenotypen i hypoksiske kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Western blot-analyse. Effekter av NF-kB p65 siRNA og IKK-inhibitor BAY 11-7082 på N-cadherin og E-cadherin ekspresjon av PANC-1 og BxPC-3-celler i henhold til hypoksiske betingelser i 48 timer. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) Matrigel invasjonen analyser. Venstre, mikrofotografier etter at cellene ble behandlet med NF-kB p65 siRNA eller BAY 11-7082 (10 umol /L) eller egnede respektive kontroller. Original forstørrelse, × 100. Høyre, kvantifisering av invasjonen analysen. *,
p
0,05. (C) Den proliferasjon av celler ble målt ved krystallfiolett analyse. Tallene ble valgt som representative scener fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Levedyktigheten av cellene ble bestemt ved celletelling leder-8-analyse og brukes til å beregne indeksen levedyktighet. *,
p
. 0,05
Kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske forhold utstillings NF-kB-avhengig oppregulering av Twist, transkripsjons regulatorer av EMT program
den genekspresjon programmet som medierer EMT er regulert av en eller flere transkripsjonsfaktorer, inkludert Twist, Zeb1, Zeb2, og sneglen [26]. Disse transkripsjonsfaktorene påvirker uttrykket av cadherins og metalloproteinaser blant annet proteiner som er involvert i EMT. At disse transkripsjonsfaktorene er transcriptionally indusert av oppstrøms signalveier, inkludert NF-kB [26], bedt oss om å observere deres differensial uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold hypoksiske forhold versus normoksisk betingelser ved Western blot analyse. Hypoksiske kreft i bukspyttkjertelen celler utstilt betydelig oppregulering av Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 sammenlignet med normoksisk celler (fig. 4A). Farmakologisk hemming av IKK av BAY 11-7082 i hypoksiske celler førte til en doseavhengig reduksjon i Twist uttrykk, men ingen merkbare endringer i Zeb1, Zeb2 eller Snail uttrykk, et funn som tiltaler den forsterket av NF-kB som en etiologisk biokjemisk kraft underliggende Twist overekspresjon i kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske betingelser (fig. 4B). Disse funnene tyder på at utvidet uttrykk for Twist som oppstår i innstillingen av kreft i bukspyttkjertelen cellene under hypoksiske betingelser mediert av økt NF-kB aktivitet.
(A) Western blot analyse av baseline uttrykk for EMT-medier transkripsjon faktorer: Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold normoksiske (N) versus hypoksisk (H) betingelser for 48 timer. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) Western blot-analyse. Doseavhengig effekt av en 48-timers eksponering av IKK inhibitor BAY 11-7082 på uttrykk for Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 henhold hypoksiske forhold. En representant blot fra tre uavhengige eksperimenter ble vist. Histogrammet viste gjennomsnittlig volumtetthet korrigert for lasting kontroll (β-aktin).
Overuttrykte HIF-1α i kreft i bukspyttkjertelen celler under normoksisk forhold induserer EMT i NF-kB-avhengig måte
Nye rapporter har etablert en etiologisk sammenheng mellom HIF-1α uttrykk for undertrykkelse av E-cadherin og anskaffelse av en mesenchymale fenotype [27]. Således hypotese vi at EMT som kreft i bukspyttkjertelen celler gjennomgår som følge av HIF-1α ekspresjon forekommer, i det minste delvis, på grunn av HIF-1α-mediert aktivering av NF-kB pathway. Først må vi forbigående innført en pcDNA3.0 /HIF-1α i PANC-en i henhold normoksisk forhold (HIF-1a
+ /N) med en LipofectamineTM 2000. Mens HIF-1α ble nesten umulig å oppdage i PANC-en i henhold normoksisk vilkår transdusert med kontroll tom vektor (pcDNA3.0 /N), den HIF-1α nivåer i HIF-1α
+ /N celler var sammenlignbare med de i cellene i henhold til hypoksiske betingelser for (5a fig.) i 48 timer. Deretter fikk vi bekreftet at NF-kB aktivitet gjorde faktisk økning i disse HIF-1α
+ /N celler enn pcDNA3.0 /N celler. Faktisk HIF-1α
+ /N celler oppviste økt NF-kB aktivitet som bestemt ved Western blot-analyse og EMSA (Fig. 5A og B).
(A) Western blot-analyse av NF-kB p65 og HIF-1α ekspresjon av PANC-1-celler i henhold til hypoksiske betingelser i 48 timer (h /48 h), PANC-1-celler transdusert med pcDNA3.0 tom vektor (pcDNA3.0 /N) og pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α
+ /N) i henhold til normoksisk betingelser i 48 timer. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) EMSAs for NF-kB-DNA-bindende aktivitet i H /48 h, HIF-1α
+ /N, og pcDNA3.0 /N PANC-1-celler. Høyre to baner, kald konkurranse EMSA.
Etter å ha fastslått at HIF-1α
+ /N celler manifest økt NF-kB aktivitet, vi neste vurderes disse cellene etter bevis for EMT. Sammenlignet med pcDNA3.0 /N-celler, HIF-1α
+ /N-celler, viste en økning i N-cadherin ekspresjon og undertrykkelse av E-cadherin i henhold til normoksisk betingelser for 48 timer som bestemt ved Western blot-analyse (Fig. 6A) . Immunfluorescens farging ble ansatt for å ytterligere bekrefte en EMT indusert av HIF-1α i henhold normoksisk forhold, uttrykk for E-cadherin redusert og vimentin økte i HIF-1α
+ /N celler sammenlignet med pcDNA3.0 /N celler under normoksiske forhold for 48 h (fig. 6B). Dette cadherin switch var også assosiert med økt Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 uttrykk (Fig. 6A), funn som minner om de som er observert i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold hypoksiske forhold (fig. 4A). Rollen til NF-kB i modulering av disse protein uttrykk endringene ble illustrert ved virkningene av hemming av NF-kB i HIF-1α
+ /N celler ved eksponering for IKK inhibitoren BAY 11-7082 (0-10 umol /L), som reverserte cadherin svitsje fenomenet, så vel som redusert ekspresjon av Twist i en dose-avhengig men ingen merkbare forandringer i Zeb1, Zeb2 eller snegle ekspresjon (fig. 6C). Invasion og gemcitabin motstand av HIF-1α
+ /N celler og sin avhengighet av økt NF-kB aktivitet ble evaluert i Matrigel invasjonen assay, krystallfiolett analyse og celletelling Kit-8 analysen. For eksempel, invasivitet av HIF-1α
+ /n-celler gjennom en Matrigel kammer var signifikant større enn den til pcDNA3.0 /N celler under normoksisk forhold for (6D fig.) I 48 timer. Tilsvarende, når cellene ble behandlet med gemcitabin (10 umol /l) i 48 timer under normoksisk betingelser, var signifikant høyere cellelevedyktighet sats viste i HIF-1α
+ /N-celler sammenlignet med pcDNA3.0 /n-celler som bestemt ved krystall~~POS=TRUNC fiolett~~POS=HEADCOMP analysen (fig. 6E) og celletelling Kit-8-analysen (fig. 6F). Den forbedrede invasjon og gemcitabin motstand av HIF-1α
+ /N-celler ble opphevet ved NF-kB blokade ved hjelp av eksponering for IKK inhibitoren BAY 11-7082 (10 umol /l) under normoksisk betingelser for 48 h (fig . 6D, E og F). Dermed blir forstørrelse i invasivitet og gemcitabin motstand i PANC-1 som er preget av hypoksi oppstår som et resultat av aktivering av NF-kB veien indusert av HIF-1α.
(A) Western blot-analyse av nivåene av angitte proteiner i PANC-1-celler transdusert med pcDNA3.0 tom vektor (pcDNA3.0 /N) og pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α
+ /N) under normoksisk betingelser i 48 timer. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). *,
p
0,05. (B) EMT fenotype endringer ble bekreftet med Immuofluorescence mikros farging av E-cadherin og vimentin. Grønn representerer E-cadherin flekker, mens rød representerer vimentin farging. Blå signal representerer kjernefysiske DNA farging av DAPI. (C) Western blot-analyse. Doseavhengige virkninger av en 48-timers eksponering for IKK inhibitoren BAY 11-7082 på de angitte proteiner. Histogrammet viser det gjennomsnittlige volum tetthet korrigert for lastkontrollen (β-aktin). (D) Matrigel invasjonen analyser. Effekter av en 48-timers BAY 11-7082 (10 umol /L) på invasjon av PANC-1-celler i henhold til normoksisk forhold. Venstre, photomicrographs på original forstørrelse på × 100; Høyre, histogram for å illustrere invasjon analyseresultatene. *,
p
0,05. (E) Krystallfiolett analyse. Effekter av en 48-timers BAY 11-7082 (10 umol /L) på gemcitabin følsomhet av PANC-1-celler i henhold til normoksisk forhold. Tallene ble valgt som representative scener fra tre uavhengige eksperimenter. (F) Virkningene av IKK-inhibitor for gemcitabin følsomhet av PANC-1-celler i henhold til normoksisk betingelser ble også målt ved celletelling leder-8-analyse og brukes til å beregne indeksen levedyktighet. *,
p
. 0,05
Diskusjoner
I de senere årene har det blitt stadig klarere at EMT spiller viktige roller i utviklingen av kreft og er også ansvarlig for den resistente fenotype av cancerceller til konvensjonelle kjemoterapeutika [8]. Ulike faktorer, inkludert hypoksi, har blitt tiltalt som indusere dette fenomenet gjennom induksjon av Twist, sneglen, Zeb1, og Zeb2 avhengig av mobilnettet sammenhenger [11], [26] – [28]. En hypoksisk mikromiljøet er ofte funnet i den sentrale regionen av solide tumorer. Forbindelsen mellom hypoksi og EMT er tidligere blitt rapportert, og HIF-1α er blitt siktet som medierer dette fenomen. Imidlertid har de molekylære grunnlaget for HIF-1α-indusert oppregulering av disse EMT-induserende transkripsjonsfaktorer vært stor grad udefinert, selv om bevis til støtte for evnen til HIF-1α til direkte indusere Twist transkripsjon er nylig blitt beskrevet i humane embryonale nyreceller [27].
Forrige studie viste at hypoksi fører til NF-kB aktivering og slik aktivering ble formidlet av fosforylering av IκBα på tyrosinrester [28]. NF-kB-aktivering er en kritisk komponent i transkripsjonen respons på hypoksi. Våre data som presenteres her indikerte at NF-kB aktivering er økt i henhold hypoksiske forhold samt forbigående transfektert med et pcDNA3.0 /HIF-1α i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold normoksisk forhold. Samtidig er forsterket NF-kB aktivitet etter hypoksi inhibert av IKK-inhibitor BAY-11-7082, som kan hemme fosforylering og nedbrytning av IκBα, og hindrer translokasjon av p65 /p50. Både våre data og tidligere studier viste at biokjemiske mekanismer som fører til NF-kB aktivering konvergerte på IKK komplekset henhold hypoksiske forhold. Nylig ble det rapportert at NF-kB transkripsjonelt induserer HIF-1α ekspresjon i murine makrofager, lever og hjerne [29]. Vi fant også at farmakologisk hemming av NF-kB, IKK inhibitor BAY-11-7082, medførte redusert HIF-1α uttrykk i både PANC-1 og BxPC-3 celler under hypoksiske betingelser (data ikke vist). Disse funnene tyder på at det foreligger en biokjemisk sløyfe, hvorved HIF-1α aktiverer NF-kB og vice versa. Avbryte denne sløyfen i kreft i bukspyttkjertelen celler på ett eller flere av de mange biokjemiske trinn som lenker HIF-1α til NF-kB er tilbøyelig til å ha en betydelig effekt på kreft i bukspyttkjertelen vekst. Imidlertid er forholdet mellom HIF-1α og NF-kB i prosessen med tumorutvikling spesielt komplisert og krever ytterligere utforskning. Videre har vi vist at EMT programmet som skyldes hypoksi eller overekspresjon av HIF-1α er largly drives ved aktivering av den klassiske NF-kB pathway. Dette EMT program er preget av vimentin og N-cadherin uttrykk og E-cadherin undertrykkelse, slående morfologiske endringer, en meget inngripende og gemcitabin-resistente mesenchymale fenotype.
I den nye studien viste at uttrykket av HIF-1α mål gen VEGF, en vekstfaktor som kan fremme EMT i prostata kreft [30]. I denne studien data viste også at protein ekspresjon av VEGF økt betydelig i kreft i bukspyttkjertelen celler i henhold til hypoksiske forhold og oppregulering av VEGF, forårsaket av hypoksi, ble opphevet av NF-kB p65 siRNA. Vi fant også at disse cellene inkuberes i henhold hypoksiske forhold eller transfektert med pcDNA3.0 /HIF-1α i henhold normoksisk forhold utstillings økt NF-kB aktivitet, hemming av noe som resulterer i hjemfall av cadherin bryteren til det av en epitelial fenotype preget av redusert invasjon og økt gemcitabin følsomhet, funn som implisere NF-kB som en rektor formidler av HIF-1α-indusert EMT program i kreft i bukspyttkjertelen celler under hypoksiske forhold.
Andre studier har tidligere identifisert Zeb1, Zeb2, og Snail som sentrale regulatorer av E-cadherin undertrykkelse og EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler [11], [31]. Men uttrykket av Twist ble ikke oppdaget i henhold normoksisk forhold og Twist genet ble aktivert etter eksponering for hypoksi i fem bukspyttkjertelkreft cellelinjer [32]. I denne studien viste vi at EMT indusert av hypoksi eller overekspresjon av HIF-1α var assosiert med økt Twist, sneglen, Zeb1, eller Zeb2 uttrykk. Vi fant også at farmakologisk inhibisjon av IKK ved BAY 11-7082 i hypoksiske celler resulterte i en doseavhengig reduksjon i Twist uttrykk men ingen merkbare forandringer i Zeb1, Zeb2 eller snegle ekspresjon, noe som antyder at de spesifikke transkripsjonsfaktorer som regulerer EMT avhenge cellulær kontekst og den spesifikke tilstanden til cellene. Dette mesenchymal transformering kan i stor grad bli dempet ved å inhibere NF-kB gjennom enten molekylære eller farmakologiske fremgangsmåter, selv om NF-kB blokade ikke fremmer en fullstendig reversjon til en epitelial fenotype, noe som gjenspeiles ved vedlikehold av sneglen, Zeb1, eller Zeb2 uttrykk i ansiktet av NF-kB p65 siRNA eller IKK hemming.
