Abstract
Androgen reseptor (AR) er involvert i utvikling og progresjon av prostatakreft. Imidlertid er mekanismene som dette skjer forblir ufullstendig forstått. I tidligere rapporter, har kylling ovalbumin oppstrøms promoter-transkripsjonsfaktor II (COUP-TF II) foreslått å spille en rolle i utviklingen av kreft. I denne studien, utforsket vi en antatt rolle COUP-TF II i prostata kreft ved å undersøke dens effekt på celleproliferasjon og et krysstale mellom COUP-TF II og AR. Overekspresjon av COUP-TF II resulterer i inhibering av androgen-avhengige proliferasjon av prostata kreftceller. Videre studier viser at COUP-TF II fungerer som en corepressor av AR. Den undertrykker AR transaktivering på mål-promotorer inneholdende androgen responselementet (ER) på en doseavhengig måte. I tillegg COUP-TF II samvirker fysisk med AR
in vitro
og
in vivo.
Det binder seg til både det DNA-bindende domene (DBD) og den ligand-bindende domene (LBD) av AR og forstyrrer N /C-terminal samspill av AR. I tillegg konkurrerer COUP-TF II med coactivators som ARA70, SRC-1, og GRIP1 å modulere AR transaktivering, så vel som å inhibere rekrutteringen av AR til sin ARE-inneholdende target-promoteren. Til sammen våre funn tyder på at COUP-TF II er en roman corepressor av AR, og gir et innblikk i den rollen COUP-TF II i prostatakreft
Citation. Song CH, Lee HJ, Park E Lee K (2012) The Chicken ovalbumin Upstream Arrangøren-transkripsjonsfaktor II Negativt Regulerer trans av androgen Receptor i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (11): e49026. doi: 10,1371 /journal.pone.0049026
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 03.10.2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2012-0085). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
normal vekst, differensiering og funksjon av prostatakjertelen er i hovedsak regulert av androgener, som virker gjennom androgenreseptoren (AR) [1], [2]. Hemming av AR aktivitet på noen måte, inkludert kastrering og anti-androgen behandling kan hindre eller avskaffe alle faser av prostata utvikling [3]. AR funksjon kan moduleres ved intracellulære signalveier, transkripsjonsfaktorer, cellesyklusproteiner, og andre faktorer, som modifiserer Ar transkripsjonen aktivitet eller gi en anordning for krysstale mellom androgen og andre signaler [4]. Androgener og AR spiller også en viktig rolle i veksten av prostatakreft [5], [6]. Progresjon av prostatakreft skjer via vekslingen av den normale androgen aksen ved feilregulering av AR aktivitet gjennom signaltransduksjon kaskader, endringer i AR coregulator uttrykk, og mutasjoner i AR [7].
AR, en ligand- avhengig transkripsjonsfaktor, regulerer ekspresjonen av målgener når den aktiveres av androgener [1]. AR består av tre separate funksjonelle domener: den N-terminale aktiverende domene, midt DNA-bindende domene, og det C-terminale ligandbindende domenet [8]. N-enden er vist å direkte kommunisere med den C-terminale ende i en ligand-avhengig måte, noe som er nødvendig for fullstendig transkripsjonen potensialet av AR [9]. Før androgenisering, AR binder seg til en multi-protein anstand kompleks i sin inaktive tilstand. Androgen-binding induserer en konformasjonsendring i AR som resulterer i frisettingen fra anstand komplekset, dimerisering, og translokasjon inn i kjernen, for derved å binde til ares i de regulatoriske regioner av målgener [9] – [11]. AR transkripsjonen aktivitet blir modulert av coregulatory proteiner. Den ARE-bundet AR homodimer rekrutterer coactivators som P160 og P300 /CBP, som bro interaksjoner med den generelle transkripsjon maskiner og modifiserer histoner, og dermed utføring aktivering av genekspresjon [12] – [16]. I motsetning til dette, kan corepressors rekruttere histon-deacetylase (HDAC) til AR-komplekset, for derved å opprettholde kromatinstruktur [17], [18]. De kan også hemme den funksjonelle samspillet av de generelle transkripsjonsfaktorer med arrangøren [16].
kylling ovalbumin oppstrøms promoter-transkripsjonsfaktorer (COUP-TFS) er foreldreløs medlemmer av kjernefysisk reseptor super som aktiverer eller undertrykker genet transkripsjon ved direkte å binde DNA-sekvens [19]. Det er tre medlemmer av den menneskelige COUP-TF familie: COUP-TF I (NR2F1), COUP-TF II (NR2F2), og Erba-relatert protein 2 (NR2F6) [20]. COUP-TF I og COUP-TF II-proteinene er 95% homologe og evolusjonært konservert i det DNA-bindende domene, så vel som den ligand-bindende domene, hovedsakelig ulik ved N-terminus (oversikt i [19]). COUP-TF I er mer høyt uttrykt i neuronale vev av det sentrale og perifere nervesystemet, mens den COUP-TF II er mer høyt uttrykt i å utvikle organer som lunge, nyre, bukspyttkjertel og prostata [20], [21]. Erba-relatert protein 2 er mindre bevart og lite er kjent om dens uttrykk og funksjon [22].
COUP-TF samhandler med andre kjernereseptorer, inkludert østrogen reseptor (ER), retinoid X reseptor (RXR) , peroksisom proliferator-aktiverte reseptorer (PPAR), og vitamin D-reseptor (VDR) [23] – [27]. Generelt hemmer COUP-TF den transkripsjonelle aktivitet av andre nukleære reseptorer ved å konkurrere om sine DNA-bindingssetene eller ved heterodimerisering med klasse II nukleær reseptor-heterodimer partner retinoid X-reseptor, for derved å hindre gen-ekspresjon [28]. I tillegg, som tyroid hormon reseptoren, og retinsyre reseptoren, unliganded DNA-bundet COUP-TF I undertrykker genekspresjon av en aktiv lyddemping domene innenfor den ligand-bindende domene som rekrutterer corepressors (dvs. NCoR og smrt), en prosess som kalles aktiv undertrykking [29]. Endelig kan COUP-TF også undertrykke transkripsjon ved direkte binding til det ligandbindende domene av nukleære hormonreseptorer (transrepression; [30], [31]). I tidligere rapporter, ble COUP-TF beslektet med utvikling av ulike kreft inkludert brystkreft [24], [32] – [34], lungekreft, og adrenal kreft progresjon [35] -. [37]
i den foreliggende undersøkelse, viser vi at COUP-TF II undertrykker den transaktivering av AR i prostata kreftceller, noe som resulterer i inhibering av androgen-avhengige cellevekst. COUP-TF II binder direkte AR, hindrer N /C-terminal samspill av AR. Videre COUP-TF II hemmer ligand-induserte rekruttering av AR til Ptil arrangøren og konkurrerer med AR coactivators å modulere AR trans. Alle sammen, tyder våre resultater COUP-TF II som en potent AR corepressor og gi et innblikk i rollen COUP-TF II i prostatakreft.
Materialer og metoder
Reagenser
Antistoffer for AR (sc-815), PSA (sc-7638), ble HA (sc-7392), GFP (sc-9996), og α-tubulin (sc-5286) oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc . og antistoff for AR (PG-21, 06-680) ble oppnådd fra EMD Millipore Corporation. Antistoff for COUP-TF II (PP-H7147-00), som ikke anerkjenner COUP-TF I [19], ble kjøpt fra Perseus Proteomics Inc. Radiomerket tymidin ([metyl
3H] -tymidin, spesifikk aktivitet 80 Ci /mmol) ble oppnådd fra Perkin Elmer Life Science. Trichostation A ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, og Sodium butylat og nikotinamid (NIC) ble kjøpt fra Calbiochem.
plasmider og Anlegg
pattedyr Plasmidene mus AR (pcDNA3-AR ), pcDNA3-ARA70, pcDNA3-p300, pSG5HA GRIP1, og pCR3.1 SRC-1, og MMTV-Luc og PSA-Luc rapportør plasmider er tidligere blitt beskrevet [38]. Den pPBARE x 7-tk-Luc ble konstruert ved innsetting av de åtte kopier av androgen reseptor responselement (ER) av mus probasin (PB) genet. HA-merket mus COUP-TF II ble konstruert ved innsetting av
MSL
I /
Xho
I-fordøyd fragment fra pCR3.1-mus COUP-TF II i
Eco
RV /
Xho
I-fordøyd HA epitop-merket pcDNA3 vektor (pcDNA3HA). GFP-COUP-TF II og GST-COUP-TF II full lengde ble subklonet ved innsetting av
Eco
RI /
Xho
I-fordøyd fragment fra pcDNA3HA-COUP-TF II i
Xma
I-fordøyd pEGFP-C1 vektor og
Eco
RI /
Xho
I-fordøyd pGEX4T-en vektor, henholdsvis. GST-kuppet-TF II full lengde og sletting mutanter, AF1, DBD + hengsel (DBDH), og ΔAF1 regioner, ble bygget av selvligering av
Sma
I /
Xho
I-
Sph
I /
Xho
I- og
Eco
RI /
Sma
I-fordøyd fragment fra GST-COUP-TF II full lengde hhv. Pattedyr ekspresjonsplasmider VP-AR1-660 og GAL-AR624-919 og reporter konstruere 5XGAL4-Luc3 (opprinnelig fra Dr. Donald McDonnell) var velvillig gitt som gaver av Dr. Elizabeth M. Wilson (University of North Carolina) [39 ].
Utarbeidelse av rekombinant adenovirus
for ektopisk uttrykk for mus COUP-TF II, et adenovirus levering systemet ble brukt [40]. Kort fortalt ble kuppet-TF II cDNA klonet inn pAdTrack-CMV shuttle vektor. Homolog rekombinasjon ble utført ved transformasjon av Adeasy-BJ5138 kompetente celler med pAdTrack-CMV-COUP-TF II sammen med adenovirus genet bærer vektor. De rekombinante virus ble valgt, amplifisert i HEK-293-celler og renset ved cesium-klorid tetthetssentrifugering. Viral titere ble målt ved hjelp av Adeno-X rask titer (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner.
Cell Kultur og Transient Transfeksjon analysen
COS-7 og PPC-1 celler ble opprettholdt i Dulbeccos minimum essential medium (DMEM) (Life Technologies, Inc.) supplementert med 10% FBS og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin. LNCaP-celler (American Type Culture Collection) ble holdt i RPMI 1640-medium (Life Technologies Inc.) supplementert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin /streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
Twenty- fire timer før transfeksjon ble cellene sådd ut i 24-brønners plater og transfektert med den angitte mengde av ekspresjonsplasmider, en reporter konstruksjon og kontroll lacZ ekspresjonsplasmidet pCMVß hjelp av Superfect (Qiagen) eller Lipo2000 (Invitrogen) transfeksjon reagens. Totale mengder av ekspresjonsvektorer ble holdt konstant ved tilsetning av passende mengder av den utarmede vektoren. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 10% trekull-strippet serum og enten DHT eller kjøretøy. Cellene ble høstet 24 timer etter tilsetning av hormonet, og luciferase og ß-galaktosidase-aktivitet ble analysert som tidligere beskrevet [41]. Nivåene av luciferase aktiviteten ble normalisert til lacZ uttrykk.
RT-PCR og QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra prostata med Tri reagens løsning (Molecular Research Center, Inc.) . For RT-PCR, en mikrogram total RNA ble revers-transkribert og PCR-forsterket med COUP-TF II-spesifikke primere, som presiserer et 650 bp fragment som strekker seg over ORF. Kvantitativ analyse av PSA genuttrykk i LNCaP celler infisert med AdGFP eller AdCOUP-TF II ble vurdert av QRT-PCR med PSA-spesifikke primere, som forsterker en 517 bp region som strekker seg over ORF, ved hjelp av en SYBR Grønn PCR kit og en Rotor-Gene RG3000 real-Time PCR system (Corbett Research). Som en intern kontroll ble også PCR-reaksjoner utført ved anvendelse β-aktin-spesifikke primere som amplifiserer et 362 bp-område som strekker seg over exon 4. Oligonukleotid-sekvensene var som følger: forover 5′-AAGCTGTACAGAGAGGCAGGA-3 «og 5»-revers AGAGCTTTCCGAACCGTGTT- 3 «for COUP-TF II; frem 5»-GGCCAGGTATTTCAGGTCAG-3 «og omvendt 5′-CCACGATGGTGTCCTTGATC-3» for PSA; og videre 5’GAGACCTTCAACACCCCAGCC -3 «og omvendt 5’CCGTCAGGCAGCTCATAGCTC -3» for β-aktin.
GST Pull-down analyse
GST, GST-AR domene mutanter, og GST -COUP-TF II delesjonsmutanter ble uttrykt i
E. coli
BL21-celler og isolert med glutation-Sepharose-4B kuler (Pharmacia, Biotech AB). Immobilisert GST fusjonsproteiner ble deretter inkubert med [
35S] metionin-merkede COUP-TF II eller AR proteiner som produseres av
in vitro
oversettelse ved hjelp av TNT-koblet transkripsjon-oversettelse system (Promega). Bindingsreaksjoner ble utført i 250 ul av GST-bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl ved pH 7,9, 250 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% NP-40, 5 mM MgCl
2, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT og 1,5% BSA) over natten ved 4 ° C. Kulene ble vasket fem ganger med 1 ml GST-bindingsbuffer. Bundede proteiner ble eluert ved tilsetning av 20 ul SDS-PAGE prøvebuffer, og ble analysert ved SDS-PAGE og autoradiografi [41].
For å kunne bestemme å interferere med interaksjonen mellom forekommende DBD og LBD av AR av COUP-TF II gjennomførte vi GST rullegardin konkurranse analysen. Immobilisert GST-AR LBD proteiner ble inkubert med [
35S] metionin-merkede AR AF1DBDh proteiner som produseres av
in vitro
oversettelse. For konkurranse analyse, 2, 5 og 10 ganger mer enn
in vitro
oversatt COUP-TF II proteiner ble lagt sammen med radiomerkede AR AF1DBDh proteiner.
Coimmunoprecipitation og Western Blot analyse
In vivo
coimmunoprecipitation analysen ble utført med PPC-1 celler transfektert med 5 mikrogram av AR og 5 mikrogram av GFP-COUP-TF II ekspresjonsplasmider. Transfekterte celler ble behandlet med 10 nM DHT eller kjøretøy i 4 timer etter transfeksjon og høstet med RIPA-cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl ved pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 ug /ml aprotinin, 0,1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 0,1 mM PMSF). Hele cellelysat (800 ug) ble inkubert med 20 pl protein A /G plus vulst agarose slurry (Santacruz) for å utelukke ikke-spesifikk binding, og ble deretter sentrifugert. Supernatanten ble delt i to like deler. En porsjon ble inkubert med 2 ug anti-AR-antistoff (sc-815) og den andre ble inkubert med 2 ug anti-GFP-antistoff (sc-9996) over natt ved 4 ° C. Hver porsjon ble ytterligere inkubert i ytterligere 4 timer etter tilsetningen av 20 pl protein A /G plus vulst agarose slurry (Santacruz). Agarosekuler ble vasket fire ganger hver med RIPA-buffer ved 4 ° C, og bundne proteiner ble separert ved SDS-PAGE. Proteiner på gelene ble overført til nitrocellulose Protran overføringsmembran (Schleicher og Schuell Bioscience), og utsatt for Western blot-analyse med anti-AR (sc-815) og anti-GFP (sc-9996) antistoffer. Signaler ble deretter påvist med en ECL (Amersham Pharmacia).
Chromatin Immunoutfelling (chip) Assay
LNCaP-celler dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% trekull-strippet serum ble infisert med enten AdCOUP -TF II eller AdGFP, og cellene ble behandlet med 10 nM DHT eller kjøretøy i 6 timer. Celler ble så tverrbundet med 1% formaldehyd, og bearbeidet til spon assay som tidligere beskrevet [42]. Anti-AR-antistoff (PG-21) ble anvendt for immunopresipitering. Immunopresipitert DNA og input-skåret DNA ble underkastet PCR ved anvendelse av en spesifikk primer-par (forover: 5′-CATGTTCACATTAGTACACCTTGCC-3 «og omvendt: 5′-TCTCAGATCCAGGC TTGCTTACTGTC-3′), som forsterker en 315 bp region som spenner over hele AR-bindingssetet Ptils enhancer region [43]. Som en negativ kontroll ble PCR-reaksjoner utført ved å bruke et primerpar aktin (forover: 5»-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3 «og omvendt: 5′-CCGTCAGGCA GCTCATAGCTC-3»), som forsterker en 362 bp region som spenner over exon 4 av β- aktin-genet.
immunfluorescens
dagen før transfeksjon, PPC-en ble sådd ut på gelatin-belagt dekkglass. RFP-merket AR og GFP-merket COUP-TF II ble transient transfektert hjelp Superfect reagens (Qiagen). Etter 4 timer ble friskt medium tilsatt til cellene. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene matet med friskt medium med 10 nM DHT eller kjøretøy og inkubert i ytterligere 4 timer. Cellene ble deretter vasket tre ganger med kald PBS og fiksert med 2% paraformaldehyd i 10 min. Faste celler ble montert på objektglass og observert etter laserskanning confocal mikroskop (LSM 5 PASCAL Laser Scanning Microscope, Zeiss).
thymidine
LNCaP cellene ble dyrket i 24-brønners plater på en tetthet av 2 × 10
4 celler per brønn og infisert med enten AdCOUP-TF II eller AdGFP i 10% trekull-strippet serum-leverte medium. Etter å ha sittet over natten, ble cellene behandlet med 10 nM DHT i 24 timer og deretter puls merket med [
3H] -tymidin (10 pCi /ml, spesifikk aktivitet 80 Ci /mmol, PerkinElmer Life Sciences, Norwalk, CT) for 4 timer. Cellene ble høstet på et glassmikrofiberfilter (Whatman, Inc., Florham Park, NJ) og intensivt vasket med destillert vann. Inkorporering av tymidin i DNA er målt ved å telle filtrene med en scintillasjonsteller.
Soft Agar Colony Forming
LNCaP celler ble infisert med enten AdCOUP-TF II eller AdGFP i 10% trekull-strippet serum-leverte medium. Etter 24 timer på infeksjon, ble cellene trypsinert og sådd ut i 5 x 10
3-celler i 0,35% agar 0,7% agar lag i seks-brønners kulturskåler. Fersk komplett vekstmedium eller kull-strippet serum medium som inneholder fravær eller gave av en nM DHT ble endret hver 2 dager for 2 uker. Kolonier større enn diameter på 300 mm ble scoret.
Statistical Analysis
En statistisk analyse ble utført ved å bruke t-test med PRISM programvaresystem for Windows. I alle tilfeller sannsynlighet (P) verdier under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
COUP-TF II Overuttrykte undertrykker spredning av prostata kreft celler
COUP-TF II er sterkt uttrykt i mesenkymale kamrene til utviklings organer, inkludert prostata [20], [21]. I tillegg har COUP-TF II blitt foreslått å spille en rolle i utvikling av kreft [24], [32], [33], [35] – [37]. Derfor vi først undersøkt uttrykk for COUP-TFS i prostatakreftcellelinjer og også en rolle i spredning av prostata kreft celler. COUP-TF II ble sterkt uttrykt i en normal prostata cellelinje, RWPE1, men dets ekspresjon var knapt påvises eller meget lav i prostatakreftcellelinjer, både androgen-avhengige og androgen-uavhengig (figur 1A).
(A) COUP-TF II-ekspresjon i humane prostatacancercellelinjer. Protein ekspresjonsnivåene av COUP-TF II ble bestemt ved Western blot-analyse av totale proteiner ved anvendelse av anti-TF COUP-II, anti-AR (sc-815), og anti-a-tubulin-antistoffer. mRNA ekspresjonsnivåer av COUP-TF II ble bestemt ved RT-PCR av total RNA. Ekspresjonen av tubulin og β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (B) COUP-TF II hemmer veksten av prostata kreft celler. Bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen ble utført med komplett vekstmedium (venstre panel) eller med medium inneholdende trekull-strippet serum og supplementert med eller uten 1 nM DHT (høyre panel). LNCaP-celler ble infisert med AdGFP eller AdCOUP-TF II i 24 timer, og ble bearbeidet for kolonidannelse analyse som er angitt i «Materialer og metoder». Kolonier større enn diameter på 300 mm ble scoret. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) COUP-TF II reduserer frekvensen av DNA-syntese i prostatakreftceller. LNCaP-celler ble infisert med AdGFP eller AdCOUP-TF II i medium inneholdende trekull-strippet serum og supplementert med eller uten 1 nM DHT. Deres DNA-syntese hastigheten ble deretter analysert ved [
3H] -tymidin inkorporering analysen. Minst tre uavhengige eksperimenter ble slått sammen og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P . 0.001
Fordi COUP-TF II ble uttrykt på svært lavt nivå i prostata kreft cellelinjer, postulerte vi at COUP-TF II kan hemme spredning av prostata kreft celler. For å teste denne hypotese, infiserte vi androgen-avhengige LNCaP-celler med AdGFP eller AdCOUP-TF II, og sjekket celleformeringshastigheten av bløt agar-kolonidannelse assay. Overekspresjon av COUP-TF II betydelig redusert kolonien nummer samt koloni størrelsen LNCaP celler i komplett vekstmedium (figur 1B, venstre panel). Vi deretter undersøkt om COUP-TF II påvirker androgen-avhengige spredning av LNCaP celler. Overekspresjon av COUP-TF II fullstendig hemmet DHT avhengig koloni dannelsen av LNCaP cellene i medium som inneholder trekull-strippet serum (figur 1B, panel til høyre). Hemming av androgen-avhengige vekst av COUP-TF II ble ytterligere bekreftet i [
3H] -tymidin inkorporering analysen. COUP-TF II uttrykk fullstendig blokkert androgen-induserte DNA-syntese i LNCaP celler (figur 1C). Disse resultatene tyder på at COUP-TF II hemmer androgen-avhengige vekst av prostata kreft celler.
COUP-TF II undertrykker AR trans
Siden COUP-TF II overekspresjon hemmer androgen-avhengige veksten av LNCaP prostatakreftceller, undersøkte vi en mulig krysstale mellom COUP-TF II og AR, noe som er viktig for utviklingen av prostatakreft. For å teste for en cross-talk, koekspresjon vi COUP-TF II med AR i PPC-en cellelinje, en PC-3 deriverte og AR-negative [44], og åpnes effekten på trans potensialet i AR. Som vist i figur 2A, COUP-TF II hemmet androgen-avhengig transaktivering AR på en doseavhengig måte. COUP-TF jeg også sterkt hemmet AR trans, men det ble uttrykt verken i mus prostata (data ikke vist) eller i prostatakreft cellelinjer [20], [21].
(A) doseavhengig hemming av AR trans etter kuppet-TFS. PPC-1 celler ble kotransfektert med 350 ng av pPBARE x 7-tk-Luc reporter og 50 ng av AR ekspresjonsplasmid sammen med økende konsentrasjon (100, 250, og 500 ng) av COUP-TF I eller COUP-TF II. Celler ble behandlet med eller uten 3 nM DHT i 24 timer. (B) COUP-TF II-mediert undertrykkelse av AR trans på naturlige AR-target arrangører. PPC-1-celler ble transfektert som i «A», sammen med PSA-luc eller MMTV-luc reporter. (C) COUP-TF II-mediert undertrykkelse av endogent AR trans. LNCaP-celler ble transfektert som i «A», uten at AR ekspresjonsplasmidet. (D) undertrykkelse av androgen-indusert PSA mRNA uttrykk av COUP-TF II. LNCaP celler ble infisert med AdGFP eller AdCOUP-TF II. Etter 24 timer for utvinning, ble cellene behandlet med 10 nM DHT, og dyrket i ytterligere 24 timer før høsting. Kvantitativ RT-PCR-analyse ble utført med bestemte primere for PSA og β-aktin. Den relative PSA mRNA uttrykk ble normalisert ved β-aktin uttrykk. Minst tre uavhengige eksperimenter ble slått sammen og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM (A-D). **, P 0,01; ***, P 0,001. (E) undertrykkelse av androgen-indusert PSA protein uttrykk av COUP-TF II. LNCaP celler ble infisert og behandlet som i «D», og dyrket i en annen 48 timer før høsting. Western blot-analyse av totale proteiner ble utført ved anvendelse av anti-PSA, anti-AR (sc-815), anti-HA, og anti-α-tubulin. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter (til venstre). Den relative Ptil protein uttrykk ble kvantifisert ved å normal med tubulin uttrykk (rignt).
For å fastslå betydningen av COUP-TF II-mediert AR undertrykkelse, undersøkte vi COUP-TF II effekt på naturlig AR-målet arrangører som MMTV og PSA. I PPC-1 celler, koekspresjon av COUP-TF II med AR trykt AR trans på både MMTV og PSA arrangører (figur 2B). Videre COUP-TF II undertrykker også den endogene AR trans på minimal ARE arrangøren AREx7 og PSA promoter i LNCaP celler som uttrykker det muterte, men funksjonell, AR (figur 2C).
PSA er best karakteriseres androgen- responsiv-genet, så vel som en prostataspesifikt tumormarkør. Dermed vurderte vi effekten av COUP-TF II på uttrykk for endogene PSA i AR-positive LNCaP celler, som ble infisert med COUP-TF II uttrykker adenovirus (AdCOUP-TF II). Overexpressed COUP-TF II signifikant nedregulert androgen-indusert ekspresjon av endogene PSA mRNA (figur 2D) og protein (figur 2E), mens det hadde ingen effekt på AR proteinekspresjon. Sammen utgjør disse resultatene indikerer at COUP-TF II undertrykker AR funksjon i prostata kreft celler, hemme uttrykket av endogene AR målgenets Ptil.
COUP-TF II Fysisk Samhandler med AR
in vitro
og
in vivo
GST rullegardin analysen ble utført for å undersøke om AR undertrykkelse av COUP-TF II er mediert gjennom direkte protein-protein interaksjon. Interaksjoner av AR med COUP-TF II, så vel som AR domenene er ansvarlige for interaksjonen, ble undersøkt ved anvendelse av forskjellige AR delesjonsmutanter fusjonert til GST-proteinet (figur 3A, venstre panel).
in vitro
oversatt COUP-TF II samhandlet med GST-AR AF1DBDh, GST-AR DBDH, og GST-AR LBD, men ikke med GST-AR TAU, noe som tyder på involvering av de DBDH og LBD domener AR i sin interaksjon med COUP-TF II. COUP-TF II domener som er ansvarlige for sin interaksjon med AR ble deretter undersøkt ved hjelp av GST fusjonsprotein av COUP-TF II delesjonsmutanter (figur 3A, panel til høyre).
in vitro
oversatt AR samhandlet med full lengde COUP-TF II og delesjonsmutanter (COUP-TF II AF1, COUP-TF II DBDH og COUP-TF II ΔAF1), noe som tyder på AR samspill med flere domener av COUP-TF II.
(A) Direkte interaksjon mellom COUP-TF II og AR. Venstre øvre panel, Skjematisk fremstilling av full-lengde AR og dens forskjellige domene delesjonsmutanter som brukes i GST pull-down-analyse. Venstre nedre panel, COUP-TF II samhandler direkte med AR via DBDH, og LBD regionen AR. [
35S] metionin-merkede COUP-TF II fikk lov til å binde med bakterielt uttrykt GST alene eller med forskjellige domene delesjonsmutanter av AR (GST-AR AF1DBDh, GST-AR TAU, GST-AR DBDH, GST-AR LBD ). Reaksjonene ble utført med den ekvivalente mengde av hvert protein som bestemt ved Coomassie blå farving (data ikke vist). Fem prosent av merket protein anvendt i bindingsreaksjonen ble lastet som inndata. Øvre høyre panel, Skjematisk fremstilling av full-lengde COUP-TF II og dens sletting mutanter. Høyre nedre panel, AR samhandler direkte med COUP-TF II. [
35S] metionin-merkede AR fikk lov til å binde med GST alene, full lengde (GST-COUP-TF II F) eller forskjellige delesjonsmutanter av COUP-TF II (GST-COUP-TF II AF1, GST COUP-TF II DBDH, og GST-COUP-TF II ΔAF1). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. F: Full lengde COUP-TF II; AF1DBDh: AF1 + DBD + hengslene; TAU: trans enhet; DBDH: DBD + hengsel region. (B) COUP-TF II coimmunoprecipitated med AR. PPC-1-celler ble transfektert med AR og GFP-kondensert COUP-TF II ekspresjonsplasmider og deretter behandlet med eller uten 10 nM DHT i 24 timer post-transfeksjon. Coimmunoprecipitations ble utført med anti-AR (sc-815) eller anti-GFP-antistoff. Western blot analyser av immunopresipitert materialer ble utført ved anvendelse av anti-AR (sc-815) eller anti-GFP-antistoffer. Input-blot er vist for ekspresjonsnivået av hvert protein. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å undersøke
in vivo
samspillet mellom COUP-TF II og AR, vi utførte coimmunoprecipitation analysen med PPC-1 celler som ble transfektert med AR og GFP-smeltet COUP-TF II ekspresjonsplasmider. Immunoutfellinger bruker anti-AR eller anti-GFP antistoff, etterfulgt av Western blot analyse av immunoutfelt komplekser for AR og COUP-TF II, viste at AR og COUP-TF II ble effektivt samutfelt (figur 3B).
COUP-TF II forstyrrer N /C-terminal Samspill AR
ved ligand binding, dissosierer AR fra varmesjokkproteiner og translocates inn i kjernen, og dermed binding til sine mål genet arrangører som en homodimer som er dannet av inter N /C-terminal samspillet mellom to AR molekyler. Fordi noen AR corepressors forstyrre trinnene involvert i androgen-avhengige AR aktiverings følgelig repressing AR transaktivering potensiell [45], evne til COUP-TF II til å hemme noen av AR aktiveringstrinn, slik som N /C-terminal interaksjon og den kjernefysisk translokasjon av AR, ble undersøkt. PPC-1-celler ble transfektert med VP-AR1-660 (inneholdende AR-rester 1-660), GAL-AR624-919 (inneholdende AR-rester 624-919), og økende mengder av COUP-TF II ekspresjonsplasmid, sammen med en luciferase reporter genet reguleres av tandem Gal4-responsive elementer (5XGAL4-Luc3) [39]. Som vist i figur 4A, COUP-TF II inhiberer interaksjonen av Gal4-AR624-919 med VP-AR1-660 i pattedyr to-hybrid system. Disse resultater antyder at COUP-TF II hemmer dimerisering av AR gjennom N /C-binding. For å avgjøre om COUP-TF II forstyrrer fysisk med samspillet som oppstår mellom N-terminale og C-terminalen av AR, gjennomførte vi GST rullegardinkonkurranseanalyse ved hjelp av GST-AR LBD,
in vitro
oversatt [ ,,,0],
35S] metionin-merkede AR AF1DBDh og
in vitro
oversatt COUP-TF II proteiner. AR AF1DBDh ble vist å interagere med GST-LBD AR, og interaksjonen ble forstyrret av COUP-TF II på en doseavhengig måte (figur 4B).
(A) fra pattedyr to-hybrid-analyse. PPC-1 celler ble transfektert med 5XGAL4-Luc3 sammen med eller uten VP-AR1-660, GAL-AR624-919, og COUP-TF II ekspresjonsplasmider. Celler ble behandlet med eller uten 10 nM DHT i 24 timer. Minst tre uavhengige eksperimenter ble slått sammen og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. ***, P 0,001. (B) GST pull-down konkurranseanalyse. Immobilisert GST-AR LBD proteiner ble inkubert med [
35S] metionin-merkede AR AF1DBDh proteiner som produseres av
in vitro
oversettelse. For konkurranse analyse, 5 og 10 ganger mer enn
in vitro
oversatt COUP-TF II proteiner ble lagt sammen med radiomerkede AR AF1DBDh proteiner. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. AF1DBDh: AF1 + DBD + hengsel region
COUP-TF II-indusert AR undertrykkelse var ikke relatert med Nuclear Translokasjon av AR og HDAC Rekruttering
Effekten av COUP-TF II. på AR kjernefysisk trans ble vurdert av coexpressing RFP-merket AR og GFP-merket COUP-TF II i COS-7 celler. Når RFP-AR og GFP-COUP-TF II ble koekspresjon ble AR-protein hovedsakelig lokalisert i cytoplasma i fravær av ligand, men, AR-protein translokert til kjernen i nærvær av 10 nM DHT (figur 5A). Uavhengig av DHT, ble COUP-TF II forutsigbart lokalisert i kjernen. Derfor verken AR eller COUP-TF II protein ble mislocalized av deres koekspresjon. **, P 0,01;
