Abstract
Bakgrunn
naturlig cytotoksisitet, formidlet av naturlige dreperceller (NK) celler som spiller en viktig rolle ved inhibering og eliminering av maligne tumorceller. For å undersøke immunregulerende rolle NK-celler og deres potensial som diagnostiske markører, ble NK celle aktivitet (NKA) analysert i prostatakreft (PCA) pasienter med særlig fokus på NK celle undergruppe distribusjon.
Metoder
Potensielle data av NKA og NK celle delsett fordelingsmønstre ble målt fra 51 pasienter i utgangspunktet diagnostisert med PCa og 54 friske kontroller. NKA ble representert av IFN-y-nivåer etter stimulering av den perifere blod med Promoca®. For å bestemme fordelingen av NK celle undergrupper, ble PBMC farget med fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer. Deretter CD16
+ CD56
dim og CD16
-CD56
lyse celler gating på CD56
+ CD3
-. Celler ble analysert ved hjelp av en flow-cytometer
Resultatene
NKA og andelen av CD56
lyse cellene var signifikant lavere i PCA-pasienter sammenlignet med kontroller (430,9 pg /ml vs. 975,2 pg /ml og 2,3% vs. 3,8%, henholdsvis;
p 0,001
). Begge hadde en tendens til å gradvis redusere henhold til kreft stadium progresjon (
p
for trend =
0,001
). En signifikant høyere CD56
dim-til-CD56
lyse celle ratio ble observert i PCA pasienter (41,8 vs 30,3;
p 0,001
) sammen med en gradvis økning i henhold til kreft stadium progresjon (
p
for trend =
0,001
), noe som tyder på en betydelig reduksjon av CD56
lyse celler i forhold til endring av CD56
dim celler. Sensitiviteten og spesifisiteten av NKA om PCa deteksjon var 72% og 74%, henholdsvis (best cut-off verdi på 530,9 pg /ml, AUC = 0,786).
Konklusjoner
Reduksjon av CD56
lyse celler kan gå forut for NK-cellefunksjon, som fører til nedsatt cytotoksisitet mot PCA-celler. Disse observasjonene kan forklare en av mekanismene bak NK celle dysfunksjon observert ved PCA mikromiljøet og gi støtte til utvikling av fremtidige kreftimmunterapeutiske strategier
Citation. Koo KC, Shim DH, Yang CM, Lee SB, Kim SM , Shin TY, et al. (2013) Reduksjon av CD16
-CD56
lyse NK Cell Subset forut NK celle dysfunksjon i prostatakreft. PLoS ONE 8 (11): e78049. doi: 10,1371 /journal.pone.0078049
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 12. juni 2013, Godkjent: 08.09.2013; Publisert: 04.11.2013
Copyright: © 2013 Koo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2012-0000807). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. En forfatter, SMK, er en ansatt på ATgen som hjalp til med den eksperimentelle prosessen. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Natural killer (NK) celler tjene en viktig rolle i det medfødte og adaptive immunresponser mot tumor transformasjon eller patogen-infiserte celler [1]. NK-celler utøve naturlig cytotoksisitet å eliminere ondartede celler uten forutgående overfølsomhet eller klasse jeg MHC begrensning [1], [2]. Videre NK-celler stimulere det adaptive immunrespons ved å skille proinflammatoriske cytokiner å motvirke rømnings mekanismer som fremmes av kreftceller [3]. Det er gjort fremskritt i å forstå biologien til NK-celler; Likevel gjenstår ytterligere avklaring angående anti-tumor effekter av NK celle aktivitet (NKA) og mønstre av undergruppe fordeling ved PCA.
NK-celler er definert fenotypisk ved deres uttrykk av CD56 og mangel på CD3 uttrykk [4]. Ifølge membran tettheter av CD56 og CD16, er NK-celler klassifisert i CD16
+ CD56
dim og CD16
-CD56
lyse undergrupper [5]. De fleste er CD56
dim celler som i hovedsak utøver potent cytotoksisitet [6]. I kontrast, CD56
lyse celler megle lav cytotoksisitet men erverve større cytolytisk aktivitet enn CD56
dim celler ved aktivering på grunn av frigjøring av proinflammatoriske cytokiner som IFN-γ [7]. Nivået av IFN-γ, dvs. NKA, er vanligvis forbundet med onkologiske prognose, noe som innebærer den vesentlige rollen til differensial NK-celleundersett ekspresjon i immun reguleringen av tumorceller [8]. NKA har vist seg å betjene en viktig rolle i overvåking og i eliminering av tumorceller [9]. Studier har vist at lave NKA fører til høye nivåer av tumor forekomst og metastase, og at dens grad korrelerer med invasivitet av malignitet [10]. Tvert imot, har høy NKA vist seg å korrelere med lavere forekomst av svulster, og deres infiltrasjon i visse svulster, dvs. melanom, hode og nakke plateepitelkarsinom, er en indikator for en bedre onkologisk resultat [11], [12] .
det er vist at en svekket immunrespons er en avgjørende faktor i patogenesen av prostatakreft (PCA) [13], [14]. NK-celle dysfunksjon har vært implisert i PCa sammen med en rekke av tumorer [15], [16]. Til tross for flere foreslåtte mekanismer, inkludert redusert antall, immunosuppressive cytokiner, og reseptor-repertoar ubalanse, er patofysiologien til NK-celle dysfunksjon i PCa ikke fullt ut forstått [5]. Når det gjelder rollen som NKA i tumor undertrykkelse, utnytte mekanismene for NK-celler kan helt klart være en viktig komponent for vellykket immunterapi mot PCa. Prostataspesifikt antigen (PSA) er den mest brukte serum markør som har revolusjonert tidlig oppdagelse og behandling av PCa. Men den relative mangelen på kreft-spesifisitet og mangel på en øvre eller nedre grenseverdi er store ulemper.
For å løse disse problemene, NKA og fordelinger av CD56
dim og CD56
lyse undergrupper ble analysert mellom PCA pasienter og kontroller. Våre funn tyder på at immunregulering ved PCA er svekket som følge av en reduksjon i NKA innledes med omfordeling av NK celle undergrupper. Videre evaluering av den diagnostiske resultatene av NKA avslørte at det kan påføres som et støttende markør i tillegg til PSA.
Materialer og metoder
1. Pasienter og kontroller
Dette prospektiv tverrsnittsanalyse involverte 51 pasienter med nylig diagnostisert biopsi-påvist PCa grunn av en PSA høyde notert på helseundersøkelser fra mars til desember 2012. 54 alders matchet kontroller var selv Frivillig friske personer med prostatavolum, PSA og DRE var innenfor normale godkjente områder. Ingen av pasientene hadde tidligere fått behandling for PCA ble kjent for å ha immunologisk eller andre maligne tilstander, og var alle fri for aktiv infeksjon eller betennelse som vurderes av hvite blodlegemer 10000 celler /mikroliter og C-reaktivt protein 1,0 mg /l (tabell 1). Alle kontroller var fri for betennelsestilstander uten tidligere eksponering for immunsuppressive midler. Uavhengig godkjenning er innhentet fra Yonsei-universitetet etiske komité (4-2011-0660), med alle blodprøver tatt etter å ha innhentet informert samtykke før radikal prostatektomi. Alle deltakerne gitt skriftlig samtykke til å delta i studien.
2. NK celle aktivitet
cytotoksisk aktivitet av NK-celler ble bestemt ved bruk av NK Vue-Kit® (ATgen, Sungnam, Korea). Fullblod ble samlet inn ved hjelp BD Vacutainer® heparin
N1 rør. 1 ml av helt blod ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C under 5% CO
2 med den angitte dose av Promoca® og 1 ml RPMI 1640 medium. Cellefrie supernatanter ble høstet, og IFN-y-nivåer ble bestemt i henhold til produsentens protokoller.
3. NK Cell Subset Distribution
3,1. Utarbeidelse av PBMC.
3 ml heparinisert venøs blod ble innhentet og analysert innen 4 timer etter samlingen. PBMC ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering ved anvendelse CPT® celle fremstillingsrørene (BD Vacutainer®) ved 1600 g i 20 minutter ved 20 ° C. De oppsamlede PBMC (1-2 x 10
6 celler /ml) ble vasket og resuspendert i 5% føtalt bovint serum (FBS) + fosfat-bufret saltvann (PBS).
3,2. Antistoffarging.
For ekspresjon av CD3, CD16, CD56 og på NK-celler, PBMC ble farget med Alexa-anti-CD3, PE-anti-CD16, og FITC-anti-CD56 fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer (BD Biosciences). Etter beising i 30 min ved 4 ° C ble cellene grundig vasket og fiksert i 1% paraformaldehyd-PBS før vurderingen.
3,3. Flowcytometri.
For å bestemme den totale andelen av NK-celler gated i CD3
-CD56
+ cellepopulasjonen, minst 10.000 målceller ble kjøpt opp av LSRII flow-cytometri (BD Biosciences). Fordelingen av CD16
+ CD56
dim NK-celler og CD16
-CD56
lyse NK-celler gated fra CD3
-CD56
+ cellepopulasjonen er presentert som prosent av total NK-celler. For hver prøve, ble dataene videre analysert ved FlowJo 8.1.1.1 (Tre Star, Inc., Ashland, OR, USA).
4. Kreft Stage Klassifisering
PCa oppsetningen ble bestemt i henhold til 7
th amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM-systemet. Stage fordeling og patologiske egenskaper er vist i tabell 2. patologi ble bekreftet av en enkelt patolog.
5. Statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Mann-Whitney U-tester når man sammenligner uparede to gruppedata og Kruskal-Wallis tester med Bonferroni post-hoc korreksjon når man sammenligner mer enn to grupper. Nøyaktigheten av NKA og CD56
dim-til-CD56
lys-forhold ved påvisning av PCa ble bestemt ved mottagerdriftskarakteristikker-avledede område under kurven (AUC). Korrelasjonsanalyse ble brukt til å evaluere assosiasjoner mellom NKA, CD56
dim-til-CD56
lyse forhold, og clinicopathological variabler. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS (v.18.0).
Resultater
1. Demografiske data
Alle pasienter og kontroller ble klinisk og patologisk undersøkt med hensyn til faktorer som er vist i Tabell 1. Faktorer som kan påvirke ens immunstatus manifestert ingen forskjell mellom gruppene.
2. Frekvens av NK-celler og distribusjon av CD56
dim og CD56
lyse NK Cell Delsett
Representant flowcytometrisk data viser fordelingen av total NK-cellepopulasjon representert som CD3
-CD56
+ celler (fig. 1A) og to store undergrupper, CD16
+ CD56
dim og CD16
-CD56
lyse, uttrykt som en prosentandel av totale NK-celler (fig. 1B). Totalt NK sirkulerende frekvenser ikke skiller mellom pasienter og kontroller eller mellom kreft scenegrupper (figur 2A. Tabell 2). Imidlertid ble en preferensiell reduksjon i hyppigheten av CD56
lyse celler registrert hos pasienter. Videre CD56
lyse cellene hadde en tendens til å avta gradvis i henhold til kreft stadium progresjon, dvs. ekstrakapsulær forlengelse, LN eller tilstøtende organ metastase (figur 2B;. Tabell 2). En signifikant høyere CD56
dim-til-CD56
lyse NK-celle-forholdet ble observert hos pasienter sammenlignet med kontroller, med en tendens til å øke i henhold til scenen progresjon (
p
for trend =
0,001
) (tabell 2).
(B) Representative strømningscytometriske data for to store NK-celleundergrupper som detekteres i perifert blod. Venstre, øvre boks: CD16
+ CD56
dim NK celle undergruppe. Høyre, nederste boksen. CD16
-CD56
lyse NK celle undergruppe
Ingen signifikante forskjeller i total NK befolkningen ble oppdaget mellom pasienter og kontroller, og innen scenegrupper. (B) Boxplot diagrammer som viser strømningscytometriske distribusjons resultatene av CD56
dim og CD56
lyse undergruppe distribusjoner innen totale NK-celler mellom kontroller og pasienter, gruppert etter kreft stadium. * P 0,05, ** p 0,01 i forhold til kontrollene
3.. NK-celleaktivitet
Resultatene oppnådd er presentert i fig. 3 og Tabell 2. Som angitt pasientene viste betydelig lavere NKA. Ifølge scenen progresjon, de med høyere stadier viste en større reduksjon av NKA (
p
for trend
0,001
).
** p 0,01 i forhold til kontrollene.
4. Analyse av ROC kurver
ROC kurver og beste cut-off verdier ble brukt for å beregne sensitivitet og spesifisitet av NK cellerelaterte parametre (Tabell 3). Sensitiviteten og spesifisiteten av NKA med hensyn til PCa deteksjon var 72% og 74%, henholdsvis, mens CD56
dim-til-CD56
lyse-celle-forhold viste en sensitivitet på 66% og en spesifisitet på 71% ( fig. 4A). I ytterligere analyse, ble sensitiviteten og spesifisiteten av NKA bestemt i henhold til to PSA-verdiene gruppert som 4 til 10 ng /ml, som er det diagnostiske grå-sone, og nivåer høyere enn 10 ng /ml. Ved et sett spesifisitet på 74%, NKA for PSA-verdier innen grå-sonen viste høyere følsomhet (73% vs. 70%) og AUC (0,82 ± 0,06 vs 0,76 ± 0,07) i forhold til PSA-verdier større enn 10 ng /ml (fig. 4B).
(AUC = Areal under kurven). (B) ROC-kurver sammenligne forestillinger av NK celle aktivitet måling i henhold til Ptil gruppert som; 4 til 10 ng /ml og mer enn 10 ng /ml. (AUC = arealet under kurven).
5. NK celle aktivitet og CD56
dim-til-CD56
lyse Cell Ratio Ifølge Clinicopathological variabler
NKA viste negativ korrelasjon med PSA, kreft stadium, og CD56
dim-til-CD56
lyse forhold. På den annen side, viste CD56
dim-til-CD56
lyse-celle-forhold positive korrelasjoner med PSA og kreft trinn (tabell 4). NKA og CD56
dim-til-CD56
lyse ratio ble sammenlignet mellom kontroller og pasienter gruppert etter clinicopathological variabler (tabell 5). Selv om CD56
dim-til-CD56
lyse forholdet ikke klarte å diskriminere pasienter med Gleason score 7 og de uten extracapsular forlengelse fra kontroller, alle andre undergrupper var skilles fra kontrollene av NKA og CD56
dim-to -CD56
lyse forhold. Analyse i mellom undergrupper av pasienter viste signifikant høyere CD56
dim-til-CD56
lyse forholdet hos pasienter med patologisk bekreftet LN metastase (
p = 0,043
, data ikke vist).
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å avklare rollen til NK-celler i immunrespons mot PCa. Flere mekanismer av PCa utvikling og progresjon er blitt foreslått, inkludert hormonelle, metabolske forandringer, og immunrespons [6], [17]. Det er vist at forskjellige lymfocyttpopulasjoner er involvert i celle-mediert immunosuppresjon som fører til forekomst og progresjon av PCa [13], [18], [19]. Det er imidlertid begrenset informasjon angående den funksjonelle rollen til NK-celler i immunresponsen til PCa. For å løse dette problemet, undersøkte vi NKA som en markør for IFN-γ nivåer og fordeling av NK celle undergrupper i PCA pasienter. Resultatene av studien viser at svekket NKA er antagelig innledes med en reduksjon i CD56
lyse celler, og at nivået av NKA kan benyttes som et støttende diagnostisk markør for PSA.
1. Fortrinnsrett Reduksjon av CD56
lyse NK-celler i PCA pasient
NK-celler er funksjonelt klassifiseres i CD56
dim og CD56
lyse undergrupper. CD16
+ CD56
dim celler er effektorceller med høye mengder av cytolytiske granulat som uttrykker potent cytotoksisitet mot tumorceller [4]. CD16
-CD56
lyse celler slipper proinflammatoriske cytokiner som IFN-γ som driver inflammatoriske mekanismer som regulerer startfasen, immunoevasion, overlevelse, og utvekst [20], [21]. Nylige oppdagelser har vist at CD56
lyse cellene utgjør majoriteten av NK-celler i lymfoid vev, og at de ikke er bare en mindre undergruppe blant NK-celler, men er umodne forløpere for CD56
dim-celler [22]. Arbeidet fokuserer på denne undergruppe, med hensyn til sin betydning i reguleringen av NK-celle-mediert respons mot tumorceller.
Undersøkelse av fordelingsmønstre for NK-celleundergrupper viste en signifikant reduksjon av CD56
lyse celler uten endring av CD56
dim celler. Tidligere studier på ulike tumorbærende verter har rapportert ganske tydelige sammenhengen mellom CD56
dim og CD56
lyse undergrupper. I motsetning til våre resultater, ble en reduksjon i CD56
dim celler uten endring av CD56
lyse celler bemerket i mage og esophageal kreft [23]. På den annen side, ble en reduksjon i CD56
lyse celler observert i bryst, hode og nakke kreft, og en lik fordeling av CD56
dim celler ved PCA; resultater som er i samsvar med den foreliggende undersøkelsen [7], [17].
2. Endring av CD56
lyse NK-celler som et svar mekanisme til svulstens mikromiljø
Vår studie primært observert en fortrinnsrett reduksjon av CD56
lyse celler uten endring av CD56
dim celler. Selv om den underliggende årsaken ennå ikke er klart definert, kan to mulige forklaringer heves; modningsprosess og rekrutteringsprosessen.
Som nevnt, er CD56
lyse celler akseptert som forløpere til CD56
dim celler, med hvert delsett representerer en tydelig modningstrinn [24]. Eventuelt kan en overdreven etterspørsel etter effektorceller som respons på tumor har provosert en overgang av umodne CD56
lyse cellene inn i CD56
dim celler. En lignende forklaring er blitt foreslått for reduksjon av CD56
lyse-celler i pasienter med hode- og nakkekreft [7]. Dette forutsetter imidlertid en samtidig økning av CD56
dim celler, som ikke ble observert i denne studien.
En alternativ forklaring uten demonstrasjonen er at perifere CD56
lyse celler kan ha blitt rekruttert til lymfoid vev nettsteder som metastatisk LNS å tilegne cytotoksisitet. Denne ide var basert på tidligere observasjoner at CD56
lyse cellene fortrinnsvis akkumuleres i T-celleområdet LNS til å bli aktivert for å frembringe proinflammatoriske cytokiner [7], [22,22]. Videre observasjon at CD56
lyse celler isolert fra menneske LNS bli cytotoksiske sterkt ved stimulering av IL-2 antyder at NK-celler rekrutteres til LNS kan representere en umoden pool av effektor celler [25]. En signifikant høyere CD56
dim-til-CD56
lyse celle forholdet hos pasienter med patologisk bekreftet LN metastaser ble observert i vår studie, noe som tyder på at disse sirkulerende celler kan ha blitt rekruttert til patologiske eller sekundære LNS i respons til tumor. Dette er relevant fordi LNS er vanligvis den primære metastaser og CD56
lyse celler er den primære undergruppe funnet i LNS som motvirker de metastatiske celler [26]. For å bekrefte dette problemet, ville det være interessant å undersøke om CD56
lyse cellene er akkumulert i metastatisk LNS følgende LN disseksjon.
3. NK celle dysfunksjon som følge av reduksjon av CD56
lyse NK-celler
NKA ble undersøkt for å bestemme innvirkningen av reduksjonen av CD56
lyse cellene på cytolytisk aktivitet mot tumorceller. Parallelt med observasjoner med CD56
lyse celler, ble NKA observert å være lavere i PCA pasienter, sammen med en tendens til gradvis avta etter kreft stadium progresjon. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter som viste NKA er kompromittert i et bredt spekter av hematologiske og faste tumorer [8], [10], [27]. Flere mekanismer av kompromitterte NKA er blitt foreslått, for eksempel redusert antall tumor-infiltrerende NK-celler [23], økte overflatereseptorer for immunsupres faktorer [28], og inaktivering av effektorceller [10].
Korrelasjoner observert mellom NKA og CD56
dim-til-CD56
lyse-celle-forhold kan være av en direkte relevans til å foreslå en tilleggsmekanisme som svak NKA er en konsekvens av redusert CD56
lyse celler. CD56
lyse celler er kjent for å være viktige kilder for IFN-γ [22], som observert i
in vitro
studier der CD56
lyse celler ble vist til fortrinnsvis sprer i co-kultur med umoden dendrittiske celler og lipopolysakkarider til å produsere IFN-γ [29]. Også, stimulering av CD56
lyse cellene med transduserte karcinomceller resulterte i en forbedret evne til å produsere IFN-γ og meddele høy cytotoksisitet [6]. Videre,
in vivo
studier har vist at CD56 tonsillare
lyse celler som produserer IFN-γ før modning til effektorceller [25]. Motsatt, ble en reduksjon av CD56
lyse celler observert å indusere nedsatt utskillelse av IFN-γ hos pasienter med allergisk rhinitt [30]. Tatt i betraktning disse støttende funn som sekresjon av IFN-γ er direkte avhengig av CD56
lyse celler, foreslår vi at reduksjonen av CD56
lyse-celler er en potensiell mekanisme involvert i lav NKA, noe som fører til nedsatt cytotoksisitet mot PCA-celler.
4. NK celle aktivitet, en støttende diagnostisk markør for PSA
ROC kurver avdekket at NKA kan tjene som en støttende markør for Ptil i diagnostisering PCa. Selv om det er klart at PSA gir den høyeste diagnostiske verdien for PCa, er en vesentlig begrensning for sin mangel på cancer-spesifisitet noe som fører til unødig risiko og kostnader, spesielt i diagnostiske grå-sonen [31]. Selv om pågående utfordringer arbeide for å utvikle nye metoder for PCa gjenkjenning, har ingen klart oppveide fordelene mot ulempene [14]. Undersøkelsen øker muligheten for at NKA kan benyttes i kombinasjon med Ptil for å gi ytterligere diagnostisk verdi, spesielt for de som er innenfor den diagnostiske grå-sonen.
Denne studien var basert på kontroller versus pasienter diagnostisert med PCa grunn av forhøyet Ptil på en rutinemessig helseundersøkelse. Derfor fravær av PCA pasienter med normal PSA ( 4 ng /ml) var den største begrensning av denne studien, som hindret en direkte sammenligning av diagnostiske utbytte mellom PSA og NKA. En utvidet befolkningen studier er nødvendig for å bekrefte våre foreløpige funn og å vurdere kostnadseffektivitet.
Konklusjoner
Denne observasjonsstudie gitt nye funn som CD56
lyse celler tjener en viktig rolle i adaptiv respons mot PCA celler. Denne forestillingen gir ytterligere støtte at longitudinelle studier om NK celle immunosurveillance klart fortjener ytterligere forskning for å potensielt føre til nye immunterapeutiske strategier for å øke onkologiske resultater av PCa.
