Abstract
Mål
Slettede leverkreft 1 (DLC1), et medlem av RhoGTPase aktivere protein (GAP) familie, er kjent for å ha undertrykkende aktiviteter i tumorigenicity og kreft metastasering. Men de underliggende molekylære mekanismene for hvordan DLC1 undertrykker cellemotilitet er ikke fullstendig klarlagt. Rho-kinase (ROCK) er en umiddelbar nedstrøms effektor av RhoA i formidling cellulære cytoskeletal hendelser og cellemotilitet. I denne studien ønsket vi å undersøke effektene av DLC1 på Rho /ROCK signalveien i leverkreft (HCC).
metodikk /hovedfunnene
Vi viste at DLC1 negativt regulert Rock- avhengig actomyosin kontraktilitet. Fra immumofluorescence studie fant vi at ektopisk uttrykk for DLC1 avskaffet Rho /ROCK-mediert cytoskeletal omorganisering inkludert dannelsen av stress fiber og fokale adhesjon. Det også downregulated kortikal fosforylering av myosin lett kjede-2 (MLC2). Disse hemmende hendelsene etter DLC1 var RhoGAP avhengig, som RhoGAP-mangel mutant av DLC1 (DLC1 K714E) avskaffet disse hemmende arrangementer. I tillegg, fra vestlige studie, DLC1 hemmet ROCK relaterte myosin lett kjede fosfatase målretting enhet 1 (MYPT1) fosforylering på Threonine 853. Ved å undersøke cellemorfologi henhold mikroskop, fant vi at ektopisk uttrykk for dominerende aktive ROCK utgitt celler fra DLC1-indusert cytoskeletal kollaps og celle krymping.
Konklusjon
Våre data tyder på at DLC1 regulerer negativt Rho /ROCK /MLC2. Dette impliserer en ROCK-mediert sti DLC1 undertrykke metastasering av HCC celler og beriker vår forståelse i de molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen av leverkreft
Citation. Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, Chan LK, Ching YP, Yam JW-P, et al. (2008) Slettet i Liver Cancer 1 (DLC1) Negativt Regulerer Rho /ROCK /MLC Pathway i leverkreft. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10,1371 /journal.pone.0002779
Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 20 april 2008; Godkjent: 30 juni 2008; Publisert: 23.07.2008
Copyright: © 2008 Wong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av Hong Kong stipend~~POS=HEADCOMP Council (HKU 7436 /04m), RGC Collaborative Reseaarch fondet (HKU 1 /06C), Michael og Betty Kadoorie kreft genetikk Research Program 2004. IOL Ng er Loke Yew professor i patologi
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell migrasjon innebærer sykluser av trinn som begynner fra. dannelsen av celle utvekst i forkant. På nettstedene til utstikket er fokale sammenvoksninger dannet for å feste cytoskjelettet, hovedsakelig aktin og myosin, til den ekstracellulære matrise. Cytoskjelettet genererer spenninger som resulterer i actomyosin kontraktilitet til translocate cellelegemet. Endelig slipper spenningen sammenvoksninger fra cellens bakkant [1]. Deregulering i noen av trinnene som er involvert i cellemigrering kan resultere i avvikende celle bevegelse og, i kreftceller, metastase [2]. Leverkreft (HCC) er en av de mest utbredte kreftformer over hele verden. Intrahepatisk metastaser er den ledende årsaken til dødelighet hos pasienter med denne kreftformen. Derfor tror vi en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som regulerer HCC cellemigrasjon kan kaste lys til utvikling av nye målrettet terapeutisk intervensjon.
Slettede leverkreft 1 (DLC1), en tumor suppressor gen, ble først identifisert i grunnskolen HCC som en rotte p122RhoGAP homolog [3]. I HCC har DLC1 er funnet å ha tumorundertrykkende egenskaper [4] – [6], og er underexpressed hovedsakelig gjennom genet delesjon og DNA-metylering [7] – [9]. Underexpression av DLC1 er også implisert i andre krefttyper som for eksempel bryst, lunge, prostata og [9] – [14]. DLC1 ble også vist å bli nedregulert i metastatiske celler sammenlignet med ikke-metastatiske celler i bryst og HCC modeller [15], [16]. Ektopisk ekspresjon av DLC1 ble funnet å undertrykke cellemigrering og invasjon i HCC, ikke-småcellet lungekreft, brystkreft, lungekreft, eggstokk-kreft cellelinje modeller [4], [15], [17] – [21], og overekspresjon av DLC1 i metastatisk brystkreft cellelinje kunne dempe størrelse og forekomst av lungemetastaser [15]. Men de molekylære mekanismene bak dette undertrykkelse av celle bevegelse og kreft metastase fortsatt uklare.
DLC1 er medlem av RhoGTPase aktivere protein (RhoGAP) familie og besitter RhoGAP aktivitet spesifikt for RhoA [8]. DLC1 regulerer negativt aktiviteten RhoA ved å styrke egen GTP hydrolytisk aktivitet RhoA, og dermed katalyserer omdannelsen av RhoA fra sin GTP-bundet aktiv tilstand til BNP-bundet inaktivt [22]. Rho-kinase (ROCK) er den mest kjente nedstrøms effektor av RhoA [23], [24]. Binding av RhoA utgivelser ROCK fra sin autoinhibitory struktur og aktiverer ROCK-mediert cellulære hendelser [23], [25] – [27]. ROCK er kjent for å regulere cellulære hendelser knyttet til cellemotilitet. For eksempel ble ROCK vist seg å kontrollere celle polaritet ved å regulere PTEN /Akt signalveien i nøytrofile [28] og kontrollere halen tilbaketrekking i monocytter og prostata kreft celler [29] – [31]. ROCK også forbedret actomyosin kontraktilitet, en hovedtrinn av cellemigrering som ovenfor beskrevet [32]. Viktigere er ROCK en kinase som fosforylerer og aktiverer mange nedstrøms underlag som LIMK og myosin lett kjede 2 (MLC2). Fosforylering av disse substrater er viktig i å regulere cytoskeletal reorganisering og cellevandring [33], [34]. Hyperaktive av Rho /ROCK vei er kjent for å være assosiert med mer aggressive tumoregenskaper, slik som metastase og invasjon [35] – [41]. Deregulering av Rho /ROCK sti kan være consequentially relatert til sin avvikende oppstrøms reguleringsveien. Vi har tidligere vist at DLC1 er en RhoGAP protein, og det er derfor logisk å spekulere i at DLC1 undertrykker kreftcelle metastase gjennom negativt regulere ROCK-mediert cytoskeletal omorganisering. Imidlertid har denne hypotese ikke blitt testet eksperimentelt og den mekanistiske grunnlag av hvordan DLC1 hemmer kreftcelle metastase har ikke vært avgrenset. Derfor er det strategisk viktig å undersøke mulige funksjonelle koblinger mellom DLC1 og ROCK sti og deres implikasjoner i HCC.
I denne studien har vi vist at DLC1 hemmet ROCK-mediert cytoskeletal arrangementer, inkludert dannelsen av stresset fiber og focal kontakt nettverk og fosforylering av MLC2 på celle cortex. Betydelig, disse hemmende effekter av DLC1 avhengig av sin RhoGAP aktivitet. I tillegg har vi vist at DLC1 fungert som en negativ regulator av ROCK i å kontrollere celle morfologi. Samlet sett viste vi at DLC1 negativt regulert ROCK undertrykke celle bevegelse i HCC.
Resultater
DLC1 avskaffet dannelsen av ROCK-mediert stresset fiber og brennvidde heft nettverk
Først vi spurte om dannelsen av stress fibre og fokale sammenvoksninger i HCC celler var ROCK avhengig. Vi fant at stress fiber bunting arrays (farget med phalloidin flekken) og fokale sammenvoksninger (paxillin), spesielt de i den sentrale regionen som var knyttet til stress fiber, ble avskaffet ved ROCK hemmer behandling (figur 1A). Dette funn tyder på at dannelsen av stress fibrene og fokal adhesjon i HCC celler er ROCK-avhengig.
(A) ROCK inhibitor trykkes spenning fiber og fokal adhesjonsdannelse i HCC celler. SMMC-7721 celler ble sådd ut på cover-slip en dag før behandling. Stress Fibrene ble farget med phalloidin flekk (rød) og fokale sammenvoksninger med paxillin flekk (grønn). Stress fibre kan observeres tydelig som bunter som strekker seg over cellene og fokale sammenvoksninger var festet til stress fiber bundling arrays i SMMC-7721 mock behandlet kontroll. Behandling med ROCK hemmer Y27632 10 mikrometer i 60 minutter undertrykte dannelsen av stresset fiber og brennvidde heft nettverk i SMMC-7721. (B) og (C) DLC1 trykt ROCK-mediert stresset fiber og brennvidde heft formasjon i HCC celler. SMMC-7721 celler (i) og BEL7402 (ii) ble transfektert med myc-merket ekspresjonsplasmider pCS2 + MT, pCS2 + MT /DLC1, og pCS2 + MT /DLC1 K714E, og anerkjent av anti-myc antistoffer (9E10). Stress fiber og fokale sammenvoksninger ble farget med phalloidin-TRITC og anti-paxillin antistoff, henholdsvis. Villtype DLC1, men ikke RhoGAP-manglende mutant (DLC1 K714E), undertrykket spennings fibre dannelse og redusert antall spennings fibre bundet fokal adhesjon utformet i SMMC-7721-celler. Andel av forskjellige DLC1 konstruksjoner transfekterte celler stiller stresset fiber eller fokale sammenvoksninger ble presentert i et søylediagram tilsvarende. For hver konstruksjon, ble totalt 67-170 transfekterte celler tellet under mikroskop. Feilfelt representerer standardavvik (SD) av data fra to uavhengige forsøk.
For å undersøke regulerende funksjon av DLC1 på ROCK-mediert stresset fiber og brennvidde heft formasjon i HCC, vi forbigående overexpressed DLC1 i DLC1-mangel SMMC-7721 og BEL7402 HCC celler og dens virkninger på nettverket av stress fiber og fokale sammenvoksninger ble studert. Overekspresjon av vill-type DLC1 undertrykte betydelig dannelsen av stress fibre og fokal adhesjon i disse cellene, som antydet med phalloidin (figur 1B) og paxillin flekker (-1C i figur 1C og-ii) hhv. Analogt til ROCK hemming (figur 1A), DLC1 avskaffet hovedsakelig stressfiberbundet fokale sammenvoksninger som ligger i den sentrale regionen av celler (figur S1 A). Tapet av fokale sammenvoksninger ble ytterligere forverret med ektopisk uttrykk for SAM domene-slettet mutant av DLC1 (ΔSAM) (figur S1B), en DLC1 avkortet konstruksjon som forårsaket en mer alvorlig celle svinn og tap av stress fibre [4]. I motsetning til dette, et RhoGAP-manglende mutant (DLC1 K714E) var ikke i stand til å hemme både spenning fiber og fokal adhesjonsdannelse (figurene 1B og 1C). Disse funnene viser at DLC1 hemmet ROCK avhengig stresset fiber og fokale heft formasjon via sin RhoGAP aktivitet.
DLC1 avskaffet ROCK-mediert cortical myosin lett kjede 2 fosforylering
Aktiv ROCK spesielt phosphorylates myosin lett kjede 2 (MLC2) på Ser 19; derfor har dette ROCK spesifikk fosforylering vært mye brukt som surrogatmarkør for ROCK aktivitet [36], [42] – [45]. Fosforylering av MLC2 ved Ser19 er viktig for aktiviteten av myosin som er ansvarlig for actomyosin kontraktilitet og dermed cellevandring [46]. I denne studien, observerte vi at fosfo-MLC2 farging av BEL7402 HCC celler var spesielt fremtredende ved celle cortex. Imidlertid, når ROCK aktivitet ble blokkert enten ved Y27632 (figur 2A) eller ektopisk ekspresjon av en dominant-negativ mutant ROCK (figur 2B), er denne periferi fosforylering av MLC2 var fullstendig avskaffet og fosforylering av MLC2 ble en overveiende cytoplasmatisk mønster. I motsetning til dette, ektopisk ekspresjon av dominant-aktiv ROCK kulminert i en vesentlig økning av MLC2 fosforylering ved aktin legg (figur 2B). Disse funnene tyder på at denne særegne fosforylering mønster av MLC2 på celle cortex er tett og positivt regulert av ROCK aktivitet.
(A) BEL4702 HCC cellelinje behandlet med mock-kontroll eller ROCK inhibitor (Y27632) ble undersøkt med monoklonalt antistoff mot fosfo-MLC2 (Ser 19). Fosfo-MLC2 (grønn) var hovedsakelig detektert ved celle cortex av BEL7402 celler (som indikert ved pilene), og dette kortikale fargemønster ble opphevet ved behandling med ROCK inhibitor Y27632. (B) BEL7402 celler ble transfektert med myc-merket dominant negativ ROCK eller dominerende aktive ROCK konstruksjoner og oppdaget med kanin polyklonale antistoff mot myc-epitop (A14) (rød). Dominant aktiv (DA) ROCK forårsaket intens fosforylering av MLC2 (Ser 19) på aktin bunter (PRECENTAGE av celler som utviser dette fenomenet: 94,0% av DA ROCK-transfekterte celler sammenlignet med 0% av vektor transfekterte celler). Piler peker på aktin bunter av den dominerende aktive ROCK transfektert celle hvor fosforylering av MLC2 (Ser 19) ble forbedret. Dominant negative (DN) ROCK trykt kortikal fosforylering av MLC2 (Ser 19) (Prosent av celler som utviser dette fenomenet: 87,5% av DN ROCK-transfekterte celler sammenlignet med 7,3% av vektor transfekterte celler). Piler peker på cellen cortex av den dominerende negative ROCK transfektert celle hvor fosforylering av MLC2 (Ser 19) gikk tapt. Som vist, ble en stram regulering og et optimalt nivå av ROCK aktivitet er nødvendig for å opprettholde kortikal fosforylering av MLC2 (Ser 19) i BEL7402 celler.
Vi neste undersøkt om DLC1 kunne avskaffe dette ROCK spesifikke MLC2 fosforylering mønster i HCC celler. Vi først vurdert om kortikale fosfor-MLC2 fargemønster var knyttet til de endogene uttrykk nivåer av DLC1 i ulike cellelinjer. Vi har observert iøynefallende fosfo-MLC2 flekker på celle cortex i SMMC-7721, BEL7402, og WRL HCC cellelinjer (figur 3C) og HeLa livmorhalskreft cellelinje (figur 3C), som hadde ingen ekspresjon av DLC1 (figur 3A). På den annen side, HepG2 og Hep3B, de to HCC cellelinjer med DLC1 uttrykket (figur 3A), viste diffuse cytoplasmatisk fosfo-MLC2 farging uten noen distinkt kortikal fosforylering av MLC2 ved celle periferien (figur 3B).
(A) DLC1 mRNA og protein ekspresjon i HCC cellelinjer. (B) og (C) DLC1 ekspresjon ble forbundet med fosfo-MLC2 fargemønster. Representative bilder fra DLC1-positive og DLC1-negative celler, respektivt. DLC1-positive Hep3B og HepG2, vises diffus fosforylering av MLC2, mens DLC1 ikke uttrykke BEL7402 og HeLa, vises uttales kortikal fosforylering av MLC2 på celle cortex.
For å bekrefte at hemming av kortikal fosfor-MLC2 var direkte relatert til DLC1, vi deretter transient uttrykt vill-type DLC1 og DLC1 RhoGAP-manglende mutant (K714E), henholdsvis i DLC1-null BEL7402 celler. Villtype DLC1 vesentlig redusert antall celler som har fosfo-MLC2 cortical farging (figurene 4A 4B), som betegner den undertrykkende rolle DLC1 på ROCK aktivitet. På den annen side, DLC1 RhoGAP-manglende mutant (K714E) var ikke i stand til å avskaffe fosfo-MLC2 cortical farging (figurene 4A 0,0001,
t
-test) og (B) BEL7402 celler (P 0,0001,
t
-test). Feilfelt representerer standardavvik (SD) av data fra tre mikroskopiske felt. Forsøk har blitt gjentatt tre ganger. Celleproliferasjon Analysen ble vist til høyre for å sammenligne vekstrate på mock kontrollceller og Y27632 behandlede celler.
ROCK reversert cellen morfologiske endring av DLC1
Vi har tidligere vist at DLC1 var i stand til å indusere celle morfologisk endring med redusert spenning fiberdannelse i HCC celler og fibroblaster [4]. Siden ROCK er en høvding modulator i cytoskeletal signalering og cytoskeletal organisasjon er en viktig faktor for celle morfologi, vi spekulert i at cellen morfologiske endringer indusert av DLC1 var via ROCK. For å oppnå dette, observerte vi at cellemorfologi av DLC1 og ROCK ko-transfekterte celler ved immunofluorescens farging. Vi har også telles antall celler som viste at celler faller sammen eller krymping på grunn av sammenbruddet av cytoskeletal nettverk (figur 7C), som beskrevet andre steder [4], [47] – [49]. I denne studien, observerte vi at overekspresjon av DLC1 i COS7-celler indusert cytoskeletal sammenbrudd eller cellekrymping (figur 7A-i), lik våre tidligere funn [4]. Cell krymping ble forsterket av ektopisk uttrykk for SAM domene-slettet mutant av DLC1 (ΔSAM) (figur 7B-i). Co-transfeksjon av tomt pEGFP vektor kunne ikke redde DLC1-indusert celle morfologisk endring, men celler med dominerende aktiv ROCK kunne overvinne den hemmende regulering fra DLC1 (figur 7A-ii) og selv DLC1ΔSAM (figur 7B-ii) og gitt ut celler fra DLC1 indusert celle krymping. Dette eksperimentet viste at ROCK er en av nedstrøms effektorer av DLC1 i å koordinere de morfologiske endringene i HCC celler.
COS7 celler ble ko-transfektert med (A) DLC1 og ROCK eller (B) DLC1ΔSAM og ROCK, henholdsvis . Celler transfektert med pCS2MT DLC1 eller pCS2MT DLC1ΔSAM dukket rødt, mens celler transfektert med pEGFP eller pEGFP ROCK dukket opp grønt. DLC1-indusert celle cytoskeletal sammenbrudd eller celle krymping (A-i), som ble ytterligere forbedret og tydelig demonstrert av SAM-slettet konstruksjon, pCS2 + MT DLC1ΔSAM (B-i). ROCK var i stand til å gjenopprette celler fra DLC1-indusert cellekrymping (A-II), og til og med fra DLC1ΔSAM-indusert intens celle krymping (B-ii). (C) co-transfekterte celler ble talt og deres morfologi registrert. Antallet ko-transfekterte celler som viser observerbar cellekrymping (celle kollaps) ble dividert med totalt antall ko-transfekterte celler tellet, for å beregne prosentandelen av celler ved å fremvise krymping som vist i søylediagrammet. For hver kolonne ble 150-200 ko-transfekterte celler telles. Feilfelt representerer standardavvik (SD) av data innhentet fra tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
En av de viktigste rollene DLC1 er dens evne i å undertrykke kreft celle migrasjon og invasjon. I denne studie for å belyse de underliggende mekanismene i reguleringen av HCC cellemigrering og invasjon av DLC1, har vi vist at DLC1 trykkes HCC cellemigrering gjennom regulering av cytoskjelettet og actomyosin sammentrekning. Også har vi vist at DLC1 fungert som en negativ regulator av ROCK i å kontrollere celle morfologi.
DLC1 negativt regulert ROCK mediert actomyosin kontraktilitet
kontraktile bevegelse av kreftceller genereres ved påfølgende sammentrekninger actomyosin bunter består av aktin og myosin kalt actomyosin. Disse actomyosin bunter, visualisert som stress fibre, strekker seg over cellen kroppen og skaper en spenning for å generere celle sammentrekning å kjøre celle bevegelse ved å koble med brenn adhesjonsmolekyler [50]. Basert på tidligere studie på hemmende effekt DLC1 av stress fiber, her fant vi videre at dannelsen av stress fiber og samlingsvoksn nettverk var avhengig DLC1 RhoGAP og ROCK aktivitet i HCC celler. Dette funnet ytterligere belyser at stress fiber og fokale sammenvoksn arbeide hånd i hånd som beskrevet av Hall A. [51], og deres dannelse er avhengige av hverandre og tett regulert av RhoGAP av DLC1 og ROCK aktivitet. I tillegg vil redusert DLC1 ROCK-mediert fosforylering av MYPT1 (Thr853) og fosforylering av MLC2 (Ser19) og vil dermed føre til en reduksjon av total myosin fosforylering og føre til en reduksjon av stress fiber kontraktilitet [46]. Alle disse linjene av bevis konvergerte å forklare at DLC1 styrt et av de viktigste trekkmekanismer, actomyosin sammentrekning, i likhet med et annet medlem av RhoGAP familie, P190-RhoGAP [52].
DLC1 avskaffet fokale heft formasjon og også lokalisert til samlings vedheft kompleks
en spennende utgave av dette funnet om den hemmende effekten av RhoGAP på fokus adhesjonsmolekyler har oppstått. DLC1 og flere medlemmer av RhoGAP proteiner, inkludert P122-RhoGAP og RC-GAP72 ble funnet å være lokalisert på fokal adhesjon [47], [49]. Faktisk, andre og vi har tidligere rapportert at DLC1 også lokalisert til fokale sammenvoksninger og interaksjon med medlemmer av tensin familie [18], [53], [54]. I denne studien fant vi at DLC1 undertrykte stresset fiber bundet fokale heft formasjon ved sin RhoGAP aktivitet. Fra immunfluorescens studie, observerte vi at i en del av DLC1 transfekterte celler, DLC1 oppviste en fokal adhesjon lokaliseringsmønster (figur S1A); mens i noen andre DLC1 transfekterte celler, særlig de som viser omfattende celle krymping, en intensiv tap av spenning fiber-bundne fokal adhesjon ble observert (Fig. 1C). DLC1 lokalisering til fokale sammenvoksninger og dens hemmende effekt på fokale sammenvoksninger er ikke gjensidig utelukkende. Vi spekulerer i at doseringen effekten kan være en av de involverte faktorer. Når en celle ble transfektert med en høy dose av DLC1, ville DLC1 slukke alle spennings fibrene og stressfiberbundne fokal adhesjon og resultere i omfattende celler faller sammen (fig. 1C). På den annen side, når en celle ble transfektert med en lavere dose av DLC1, ville DLC1 slukke det meste av spennings fibrene og stressfiberbundne fokal adhesjon men spare noen knutepunkter sammenvoksninger ikke knyttet til stress fibrene og resultere i en mildere celle kollaps ( Figur S1 A). En annen spekulasjon er at lik RC-GAP72 [47], DLC1 kan lokalisere til samlings heft å gå i oppløsning brenn vedheft komplekser.
cytoskeletal kollaps indusert celle krymping og virkningen av DLC1 på cytoskeletal kollaps
Focal adhesjoner og actomyosin spennings fibre alltid arbeide i inter-avhengig måte, og at de sammen bygge et stillas for å understøtte en intakt morfologien til cellen [47]. De forstyrrelser av ovennevnte nettverket forårsaket av DLC1 førte til en intensiv celle cytoskeletal kollaps resulterer i celle krymping. Dette funnet var lik Barberis D
et al.
«S studie på p190RhoGAP at tap av fokale sammenvoksninger forårsaket av p190RhoGAP innledes celle krymping [48]. Vi observerte at tap av fokale adhesjoner og stress fibrene fant sted en time etter ROCK inhibering av Y27632, men cellene ikke kollapse umiddelbart (figur 1A) til langvarig behandling av Y27632 opptil 24 timer (figur S2). Fra denne observasjonen, vi formodning at cellen kollaps forårsaket av Y27632 behandling var inntruffet tap av brennvidde heft og stress fibernett. Ved inhibering av ROCK ved Y27632, kunne cytoskeletal nettverk ikke bli dannet, og cellene ikke lenger kunne tåle tap av cytoskeletal nettverket og til slutt gjennomgår celler faller sammen, noe som vi observerte som cellekrymping (figur 8). Denne studien viste at cytoskeletal kollaps indusert av DLC1, en RhoGAP som sin downregulation er assosiert med HCC progresjon, kan være delvis reverseres ved aktiv ROCK, videre antyde at DLC1 negativt regulert ROCK i å kontrollere actomyosin kontraktilitet, celle morfologi, og cellemigrasjon sekvensielt . Vår tidligere studie rapporterte at DLC1 ikke bare undertrykt celle migrasjon, men også celle invasjon som involverte ekstracellulære matrise barriere. Sahai E
et al.
Rapporterte at kreftcellelinjer kan ha forskjellige moduser av cellemotilitet og de avrundede morfologi kreftcellelinjer var mer følsomme for ROCK hemmer i tre-dimensjonal matrise [55]. Men om denne modellen er gjeldende for HCC celler og om andre ekstracellulære proteolytiske veier coorperate med DLC1 /Rho /ROCK /MLC veien er fortsatt ukjent og ventet å bli adressert.
(A) Stress fibre ble koblet til fokal adhesjon som danner et nettverk. Stress fibre strukket over cellen for å gi cellen en intakt morfologi. (B) DLC1 RhoGAP eller tap av ROCK aktivitet indusert tap av stress fiber og fokale adhesjon. Noen fokale sammenvoksninger og bunter av stress fiber forble. (C) En langvarig eller alvorlig tap av stresset fiber og brennvidde heft nettverk forårsaket av DLC1 RhoGAP eller undertrykkelse av ROCK aktivitet vil resultere i intensiv cytoskeletal kollaps. Alle stress fiber og fokale sammenvoksninger ble avskaffet.
Vår studie viste at ROCK hemmer Y27632, ikke påvirker HCC celleproliferasjon ved en effektiv dose som undertrykte HCC celle migrasjon. ROCK-hemmere har vært mye brukt i dyremodeller, slik som rotter og mus modeller, uten å forårsake stor giftighet for dyrene på effektive doser [35], [56]. Takamura et al. viste at Y27632 kunne hemme intrahepatisk metastasering av HCC [35] og nylig, en annen ROCK hemmer, fasudil, har blitt brukt i klinisk studie for pasienter med hjerte- og karsykdommer [57]. Disse studiene viser at giftigheten av ROCK-hemmere til celler er begrenset [35]. Akkumulere kunnskap viser at ROCK spiller en viktig rolle i kreft metastase, og denne studien har beriket kunnskap om ROCK signalveien i HCC. ROCK-hemmere som Y27632 kan være nyttig for kjemoterapeutiske intervensjon i å undertrykke intrahepatisk metastase, en viktig årsak til dødelighet i HCC pasienter, uten å forårsake mye negative effekter for pasientene. Ytterligere karakterisering av efficacies av ROCK hemmere og anti-ROCK terapi for behandling av HCC er fortsatt ventet.
Materialer og metoder
Cellelinjer og plasmider
SMMC-7721 og BEL7402 var gaver fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences; 293T, COS7, HepG2 og Hep3B ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293T, BEL7402, SMMC-7721, og COS7 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) høy glukose supplert med 10% føtalt bovint serum; Hep3B og HepG2 ble dyrket i minimum essensielt medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum. Myc-merkede uttrykk konstruerer (pCAG) bærer human vill-type rock, dominant aktiv ROCK (1-725 aa), og dominant negativ ROCK mutant (K105A, I1009A) ble vennlig levert av S. Narumiya (Det medisinske fakultet, Universitetet i Kyoto) [27]. Den menneskelige ROCK kinase domene (ROCK 76-338 A.A.) var PCR forsterket og klonet inn pEGFPC3 vektor hjelp KpnI og Xhol fordøyelse steder og ble brukt som dominerende aktiv form for rock. Villtype DLC1 og RhoGAP mutantene ble klonet som beskrevet tidligere [4].
Medikamentell behandling og transfeksjon
ROCK-spesifikk hemmer Y27632 ble hentet fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). For behandling ble cellene tilsatt Y27632 ved 10 uM og inkubert i 1 time ved 37 ° C. For transfeksjon ble 1 × 10
5 celler sådd på dekkglass i 35 mm-plater én dag før transfeksjon. Indikert plasmider ble transfektert inn i celler med Fugene 6 reagensen (Roche, Basel, Sveits) i henhold til produsentens instruksjoner.
immunfluorescens mikros
Mus monoklonalt antistoff mot fosfor-myosin lett kjede 2 (Ser 19) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Mus monoklonalt antistoff mot paxillin ble oppnådd fra Upstate (Lake Placid, NY). Mus monoklonal (9E10) og kanin-polyklonal (A14) antistoffer mot c-myc ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Rødt fargestoff-konjugert AffiniPure geit-anti-mus-IgG og fluorescein (FITC) -konjugert AffiniPure geite-anti-kanin-IgG ble ervervet fra Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). For immunfluorescens farging ble cellene fiksert i paraformaldehyd, permeabilisert med TritonX, blokkert med bovint serumalbumin og deretter inkubert med angitte primære og sekundære antistoffer.
