Abstract
Sykdom aggressivitet fortsatt en kritisk faktor for utviklingen av prostatakreft. Transformasjon av epitelceller til mesenchymale avstamning, forbundet med tap av E-cadherin, har betydelig potensial invasiv og migrering evne. Nylig har Special AT-rike bindende protein (SATB1) vært knyttet til tumorprogresjon. SATB1 er en celletype begrenset kjerneprotein, som fungerer som en vev-spesifikk arrangøren av DNA-sekvenser i løpet av cellulær differensiering. Våre resultater viser at SATB1 spiller betydelig rolle i prostata tumorinvasjon og migrasjon og dens kjernefysiske lokalisering korrelerer med sykdoms aggressivitet. Klinisk prøveanalyse viste at SATB1 ble hovedsakelig uttrykt i kjernen av høy grad av svulster sammenlignet med lav grad av svulst og godartet vev. Det ble observert en progressiv økning i nivåene av nukleære SATB1 i kreftvevet sammenlignet med benigne prøver. Tilsvarende SATB1 proteinnivåer var høyere i et antall av prostata kreftceller
viz
. HPV-CA-10, DU145, DUPro, PC-3, PC-3M, LNCaP og C4-2B, sammenlignet med ikke-tumorigene PZ-HPV-7 celler. Nuclear uttrykk for SATB1 var høyere i biologisk aggressive subkloner av prostata kreft celler med sine respektive foreldrecellelinjer. Videre ektopisk SATB1 transfeksjon dratt til økt celle motilitet og invasivitet i immortaliserte humane prostata epitel-PZ-HPV-7-celler som korrelerte med tap av E-cadherin uttrykk. Derfor knockdown av SATB1 i svært aggressive menneskelige prostata kreft PC-3M celler hemmet invasivitet og tumorvekst
in vivo
sammen med økning i E-cadherin protein uttrykk. Våre funn viser at SATB1 har evne til å fremme prostatakreft aggressivitet gjennom epitel-mesenchymale overgang
Citation. Shukla S, Sharma H, Abbas A, MacLennan GT, Fu P, Daniel D, et al. (2013) oppregulering av SATB1 er assosiert med prostatakreft Aggressivitet og sykdomsutvikling. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10,1371 /journal.pone.0053527
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 22 august 2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 07.01.2013
Copyright: © 2013 Shukla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av United States Public Health service Grants RO1CA115491 og legat midler til SG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA, med nesten 33 720 dødsfall skjedde i år 2011 [1]. Dårlig prognose av prostatakreft er forbundet med aggressivitet av tumorceller som gir dem med øket evne til å intravasate inn i de vaskulære og lymfatiske avdelinger, metastasere til fjerntliggende steder, og forårsake gjentakelse selv etter definitive behandlinger som kirurgi og strålebehandling [2], [3- ]. Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en viktig hendelse i tumorinvasjon prosess der epitelcelledifferensiering-avledet tumor kjøper mesenchymale egenskaper, mister sine polaritet og celle-celle kontakter og gjennomgår dyptgripende cytoskjelettet ombygging [4] – [6]. Tapet av E-cadherin uttrykk er et kjennetegn på EMT [7], [8]. E-cadherin (CDH1) spiller en sentral rolle i celle-celle adhesjon veikryss i vedlikehold av celle polaritet og miljø [7]. Tap av E-cadherin uttrykk er ofte forbundet med svulst invasivitet, metastase og dårlig prognose i ulike menneskelige kreft inkludert prostatakreft [8], [9]. Identifisering av proteiner som forårsaker molekylære omprogrammering av EMT kan føre til identifikasjonen prognostiske biomarkører og terapeutiske mål, og dermed muliggjør utvikling av nye strategier for å redusere prostatakreft aggressivitet.
Spesial AT-rike bindende protein 1 (SATB1) er en transkripsjonsfaktor som fungerer som et genom arrangøren [10], [11]. Det har en tendens til å binde seg med AT-rike basis uparrede sekvenser av målgenet [11]. SATB1 kjøper en «3 D hønsenetting» struktur ved å danne anker looper rundt kromatin, rekrutterer kromatin remodeling komplekser på forankrings områder, og regulerer histonmodifikasjonene ved å gjengi DNA-sekvenser tilgjengelige eller utilgjengelige for transkripsjon [12], [13]. Transkripsjon GenBank refererer to SATB mRNA-transkript varianter hos mennesker: SATB1 og SATB2 [14]. Konstitutiv aktivering av SATB1 er vist hovedsakelig i celler av hematopoetisk opprinnelse og er involvert i stadier av T-celleutvikling og differensiering kontrollerende ekspresjon av BCL-2-genet inn i BCL-2 større knekkpunkt region (mbr) plassert inne i 3′ UTR [15], [16]. SATB2 er innblandet som en utviklings regulator av neuronal differensiering [17]. Nyere studier har vist avvikende ekspresjon av SATB1 i en rekke epiteliale kreftformer, inkludert melanom, laryngeal squamous cell carcinoma, og karsinomer i bryst, tykktarm, lunge, eggstokk, og leveren [18] – [24]. Overekspresjon av SATB1 har blitt identifisert som en uavhengig prognostisk markør for magekreft [25], og har vist seg å spille en rolle i brysttumorprogresjon gjennom en prosess for omprogrammering genekspresjon og dermed fremme tumorvekst og metastase [26]. Lite er kjent om påvirkning av SATB1 uttrykk på den biologiske oppførsel av prostatakreft.
Selv om SATB1 har blitt rapportert å være aktivert i ulike typer kreft, er dens rolle i kreft progresjon ikke klart. En omfattende analyse av genuttrykk av klinisk prostatakreft prøvene viste tydelig transkripsjonen omprogrammering assosiert med metastatisk potensial [27]. Funksjonell profilering av gener foreslo foreningen av SATB1 med kromatin modifisering påvirker transkripsjonen regulering av gener som regulerer celleadhesjonsmolekyler og EMT [9], [12]. Gitt den betydelige rolle EMT i prostata cancer invasivitet, har det blitt antatt at overekspresjon av SATB1 i prostata cancer kan fremme invasivitet av prostatacancer ved nedregulering av E-cadherin. Så langt har det ikke vært noen data om rollen SATB1 i prostatakreft. I denne studie av SATB1 ekspresjon, ble dens nukleær og cytoplasmisk lokalisering undersøkt i et antall av primær prostata kreft vevsprøver og etablerte cellelinjer gjennom en kombinasjon av immunohistokjemi og Western blotting. Våre resultater viser at kjernefysisk nærvær av SATB1 signifikant korrelert med prostatakreft aggressivitet og sykdomsutvikling. I samsvar med kliniske funn, ektopiske endringer i SATB1 uttrykk medført endringer i cellemotilitet og invasjon både
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne linjen av bevis demonstrerer den prognostiske betydningen av SATB1 i prostata kreft og videre klargjør påvirkning av SATB1 fremme prostata kreft invasivitet.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneske prostatakreftceller, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, CA-HPV-10 og PC-3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Menneskelige prostata kreft celler
nemlig
. PC-3M ble gitt av Dr. ME Kaighn ved National Cancer Institute [28]; C4-2B celler ved Dr. Robert Sikes ved University of Delaware [29], og DUPro celler ved Dr. Rajvir Dahiya ved University of California i San Francisco [30]. Tidligere rapporter har dokumentert etablering av disse cellelinjer [28] – [30]. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 ig /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA), holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C. De dyrkede celler ble dyrket til -60% samløpet og lysatene (totalt lysatene, cytosoliske og kjernefysiske lysatene) ble utarbeidet i samsvar med tidligere protokoll for videre analyse.
Menneskelig Prostata vevsprøver og immunhistokjemi
Samples av kasserte menneskelige prostata vev ble mottatt fra vev anskaffelser Facility University Hospitals sak Medical Center og Midtvesten Division av Cooperative menneskelig vev Network. Ingen samtykke ble innhentet for disse kasserte vev per deres praksis på sykehuset og Institutional Review Board protokoller. Disse studiene ble godkjent av Institutional Review Board ved universitetssykehusene sak Medical Center. Pasienter fra hvem ble anskaffet disse vev hadde gjennomgått kirurgiske prosedyrer for prostatasykdommer og hadde ikke mottatt noen form for adjuvant behandling. Den Gleason grade og score på adenokarsinom i vevsprøver ble tildelt av et kirurgisk patolog med erfaring i urin patologi. Umiddelbart etter innkjøp, ble prøver hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i dampfasen til flytende nitrogen inntil videre anvendelse. For IHC studier et menneske prostata vev microarray (Cat # 73-5063) ble anskaffet fra Zymed Laboratories (San Francisco, California) inkludert kjerner av normal prostata, godartet hyperplastic prostatavevet, lav grad av kreft og høyverdig prostatakreft. I disse prøvene, ble immunhistokjemisk analyse utført i henhold til produsentens protokoll (Biocare Medicals, Concord, CA).
Transient Transfeksjon
Androgen-ildfast svært metastatisk human prostatakreft PC-3M, som besitter høyere ekspresjon av SATB1, mens, PZ-HPV-7 som har meget lavt nivå av basal SATB1in kjernen ble anvendt i studien. Kort sagt ble disse cellene sådd ut i 100 mm plater og fikk feste seg over natten. Omtrent 70% sammenflytende PZ-HPV-7 celler ble transient transfektert med 8 mu g enten pCMV6-AC Sann Clone Menneskelig plasmid DNA inneholder SATB1 (SC320672) uttrykk ble kjøpt fra OriGene (Rockville, MD) eller tom vektor, mens PC-3M celler ble infisert med shRNA (SATB1) menneskelige plasmid DNA til knockdown den SATB1 genekspresjon; som inneholder pool av 3 target-spesifikke lentiviral vektor som koder for hver 19-25 nt (pluss hårnål) (SC-36460-SH), og den tomme vektoren shRNA plasmid-A (SC-108060) (Santa Cruz Biotechnology, California) ved hjelp av Fugene 6 transfeksjon reagens. Etter 6 timer ble mediet supplert med serum-dyrkningsmedium, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator i 48 timer. Senere ble cellene behandlet for immunoblot analyse samt celle migrasjon og invasjon analyser.
Western blotting
Tumor lysatene samt cellelysatene (total, cytosoliske og kjernekraft) var forberedt og utsatt til immunoblot analyse. Protein (40 mu g) fra de totale cellelysatene eller humane prostata tumorlysatene ble løst i løpet av 4-20% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran. Etter blokkering med blokkeringsbuffer (PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og 10% FBS) i 2 timer, ble membranen inkubert med primært antistoff i 2 timer ved romtemperatur. Antistoffene som ble brukt var SATB1 (Cat # ab49061, Abcam, Cambridge, MA); Histone H4 (Cat # 07-108, Millipore, Denvers, MA); E-cadherin (Cat # SC-8426); MMP-9 (Cat # SC-10737); beta aktin (Cat # SC-47778) og Cytokeratin-18 (Cat # SC-6259) fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Membranen ble deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. Proteinet ble oppdaget av ECL-substrat reagenser (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).
Cell Invasion analysen
Forbigående transfektere SATB1 i PZ-HPV-7 (SATB1over-uttrykke celler) og PC -3M infiserte (SATB1 knockdown celler) ble tatt med i studien for å undersøke effekten av SATB1 genet i cellen invasjon, så vel som i migrasjon. Etter 48 timer av SATB1 gen infeksjon i cellene, ble medium inneholdende serum fjernet fra cellene og ble påfylt frisk uten serum RPMI-medium i 6 timer. Videre ble cellene trypsinert, tellet og platet inn i transwells inneholdende 1 x 10
6 celler /ml. Invasjonen kammer testsettet som ble brukt var QCMTM ECMatrix Cell invasjon analysen, 24-brønn (8 mu m) (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM550) basert på prinsippet om Boyden kammeret. Kollagensjikt okkluderer membranporene, blokkerer ikke-invasive celler fra migrering gjennom membranen. Invasive celler, på den annen side, å migrere gjennom den polymeriserte kollagensjikt og seg til bunnen av polykarbonatmembran. Invaderte celler på bunnen av innsatsen membranen ble inkubert med celle Stain-løsning, deretter ekstrahert og deretter detekteres på en standard mikroplateleser (560 nm). Hele prosedyren ble fulgt i henhold til produsentens protokoll.
Cell Migration analysen
Migrasjon analysen ble utført i PZ-HPV-7 (SATB1over-uttrykke celler) og PC-3M infisert (SATB1 knockdown celler) celler ved hjelp QCMTM, 24-brønns kolo celle migrasjon analysesett (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM508) etter leverandørens protokoll.
revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon
Semi -quantitative revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble utført for å bestemme de transkripsjonsnivåer av SATB1 i humane prostata vevsprøver av forskjellige Gleason karakterer og amplifikasjon av GAPDH-transkripter ble anvendt som kontrollen for å normalisere transkripsjonsnivåer av SATB1. Vev ble kuttet i små stykker og anbragt i smelte, en total nukleinsyre isolert system (Ambion, Austin, TX) i henhold til produsentens protokoll. RT ble utført ved hjelp av oligo-dT-primer (Invitrogen), og 0,5 mu g total RNA i en 25 mu l reaksjonsblanding, inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 10 mM DTT, 5 mM MgCl
2, 2,5 ml dNTP (10 mM), 10 U RNasin, og 200 U MMLV revers transkriptase (Invitrogen). RT-reaksjonen ble utført ved 39 ° C i 1 time for å syntetisere cDNA. Deretter, PCR ble utført for å amplifisere cDNA i en 25 mu l reaksjonsblanding inneholdende 50 nmol av hvert gen spesifikk primer, 3 ml RT produkt, 2,5 mM dNTP, 1X PCR-buffer (5 mM Tris-HCl pH 8,3, 42,5 mM KCI , 0,1% Triton X-100), 0,5 ml Taq-polymerase (Promega, Madison, WI), 2 mM MgCl
2 sammen med primerne anvendt i PCR-reaksjonen. Sekvensene til genspesifikke primere for SATB1 fremover: 5′- GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 «og omvendt: 5′- CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′; GAPDH frem: 5»-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 «og omvendt: 5′-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3». SATB1 transkripter ble amplifisert i 30 sykluser (1 min ved 94 ° C, 1 minutt ved 59 ° C, og 1 min ved 72 ° C), og cDNA av GAPDH-transkripter ble amplifisert for 25 sykluser (1 min ved 94 ° C, 1 min ved 55 ° C, og 1 min ved 72). PCR sykling tallene hadde blitt optimalisert for å unngå forsterkning metning. Ti mikro liter av RT-PCR-produktet ble separert på 2% agarosegeler, som deretter ble farget med etidiumbromid. Geleer ble visualisert og bandet intensiteter ble målt under Kodak 2000R bilde stasjonen.
SATB1 knockdown
PC-3M celler ble transduced av SATB1 shRNA lentiviral partikler, som er en pool av viral partikkel som inneholder tre target- spesifikke konstruksjoner som koder 19-25 nt (pluss hårnål) shRNA designet for å slå ned genekspresjon (Santa Cruz Biotechnology, CA, sc36460-v). PC-3M celler ble sådd ut i en 12 brønners plater 24 timer før virusinfeksjon. Transductions ble utført i RPMI inneholdende 10% komplett medium (med serum og antibiotika) og inkuberes cellene over natten. RPMI komplett medium ble fjernet, og supplert med polybren (5 mu g /ml) komplett RPMI-medium. PC-3M-celler ble infisert med ved å tilsette shRNA lentivirale partikler til cellene som inneholder medium. All prosedyren ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Colony Forming analyse
Om lag 400 celler av PC-3M og PC-3M (SATB1 slå ned) celler ble tatt i 100-mm petriskål ( Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft. Etter 12 dager ble cellene vasket med fosfatbuffer og deretter farget med Coomassie-blått. Celler kolonier ble talt opp og fotografert.
Tumor Xenotransplantat studier
Nude mus ble kjøpt fra sak Comprehensive Cancer Center, atymiske nakne mus anlegget og vedlikeholdes i mikroisolatorbur. Alle dyr ble brukt i samsvar med institusjonens retningslinjer og gjeldende eksperimenter ble godkjent av bruk Committee for Animal Care på Case Western Reserve University. Tumorceller, PC-3M og PC-3M (SATB1 knockout) ble suspendert i RPMI 1640 komplett kultur medium med 25% Matrigel (BD Biosciences) og inokulert 1 × 10
6 celler subkutant i høyre og venstre flankene av 6 til 7 uker gamle nakne mus. Musene ble overvåket daglig for håndgripelig tumordannelse og svulster ble målt to ganger i uken med en Vernier caliper, veid og fotografert.
Statistical Analysis
SATB1 atom uttrykk data ble oppsummert av gjennomsnittet (range ) samt boksplott. Endringer i tumorvolum og kroppsvekt i løpet av forsøkene ble visualisert ved spredningsdiagram. Forskjeller i SATB1 atom uttrykket (per 1000 kjerner), tumorvolum (mm3) og kroppsvekt ved avslutning av eksperimentet mellom forskjellige grupper ble undersøkt ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey multiple sammenligningsprosedyre. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom kontroll og behandlingsgruppen ble bestemt ved t-test for uavhengige data fra prøver eller paret t-test for data fra korrelerte sampler. Alle testene var tosidige og p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Expression of SATB1 Protein i Benign og vevsprøver
Uttrykket profilen til SATB1 ble bestemt i de kliniske prøver fjernet kirurgisk. Vi utførte Western blot analyse for SATB1 og CK18 som epithelial lasting kontroll i 14 godartet, 14 lavgradig prostatakreft (Gleason score ≤7), og 6 høyverdig vevsprøver (Gleason scorer 8-10). En typisk blot vist i figur 1A, ble SATB1 funnet å bli uttrykt i både godartede og cancerøse prostata kreftvev. Nivåene av SATB1 var betydelig høyere i kreft eksemplarer sammenlignet med godartet vev. Densitometrisk analyse viste 1,6 ganger økning i SATB1 uttrykk i lavgradige vevsprøver og 2,62 ganger i vevsprøver høy grad, sammenlignet med godartet vev. Neste vi avgjort om SATB1 er oppregulert på meldingsnivå. Vi utførte RT-PCR for mRNA uttrykk for SATB1 og GAPDH som en lasting kontroll. Som vist i figur 1B, ble mRNA transkriptet for SATB1 signifikant oppregulert i høy grad av tumorer sammenlignet med lav grad av tumorer og godartet vev. Densitometrisk analyse viste 1,64 ganger økning i SATB1 mRNA uttrykk i lavgradige vevsprøver og 1,51 ganger i høy grad svulster, sammenlignet med godartet vev. Siden SATB1 er en kjernefysisk protein og fremmer en transkripsjonelt aktiv kromatinstruktur ved å samhandle med AT-rike DNA-sekvenser, oppregulert i kreft, derfor har vi bestemt nivåene av dette proteinet i cytosol og atomfraksjonen i godartede og vevsprøver hentet fra samme individ. Faktisk, høyere nivåer av SATB1 protein var tilstede i atomfraksjonen i forhold til cytosol i tumorvevet i forhold til den benign vev (figur 1C).
(A) Protein ekspresjon av SATB1 i forskjellige graderinger av prostatakreft og godartet vev ble analysert ved hjelp av Western blotting; cytokeratin18 uttrykk tjente som lasting kontroll. (B) SATB1 mRNA uttrykk i ulike graderinger av prostatakreft og godartet vev; GAPDH mRNA uttrykk tjente som lasting kontroll. (C) SATB1 protein uttrykk i sammenkoblede godartede og kreft prøver fra samme individ ble analysert for cytoplasma og kjernekraft distribusjon. Densitometrisk analyse for hvert blot er vist i panelet til høyre. Detaljer er beskrevet i «materialer og metoder» -delen.
Neste vi analysert SATB1 uttrykk ved immunhistokjemisk farging av parafininnstøpte vevssnitt som består av 19 godartet, 5 lavgradig tumor (Gleason score 5- 6), 10 median-grade tumor (Gleason score 7-8) og 5 høyverdig svulster (Gleason score 9-10) i vevet microarray (figur 2). SATB1 ekspresjon ble observert enten i kjernen eller i cytoplasma, eller begge deler, men hovedsakelig sett i kjernen av kreftceller. Sammenlignet med godartet vevet, ble det observert en progressiv økning i SATB1 ekspresjon i kjernen med økende tumor karakter. Lave nivåer av SATB1 uttrykk ble observert i moderat differensierte svulster. Representative farging bilder av SATB1 uttrykk i godartede og ulike kreft karakterer er vist i figur 2A. Vi evaluerte også atomnivå SATB1 i forskjellige histologiske komponenter av vevsprøver ved å telle antallet av kjerner som viser positiv SATB1 uttrykk ved forstørrelse X40, og analysert tellinger statistisk med middelverdi og standardavvik, så vel som boxplot analyse (figur 2B). Forskjellene i SATB1 atom uttrykk (per 1000 kjerner) blant benigne og annen grad tumor prøver ble undersøkt ved analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey er parvis multiple sammenligningsprosedyre. Godartede prøven (n = 15) viste et gjennomsnitt på 56,93 farget atomkjerner (range 37-79), lavgradige svulster med Gleason score på 5-6 (n = 13) viste et gjennomsnitt på 90.54 farget kjerner (range 56-115) ; moderat differensierte svulster med Gleason score på 7-8 (n = 12) viste et gjennomsnitt på 146.33 farget atomkjerner (range 93-198); og høyverdig tumor med Gleason score 9-10 (n = 11) viste et gjennomsnitt på 205,27 (158-298) farget kjerner for SATB1. Atom SATB1 uttrykk blant 4 grupper var svært statistisk signifikant (P 0,0001). Videre Tukey er parvis multippel sammenligning prosedyre viste at SATB1 uttrykk i highscore vevsprøver var betydelig høyere enn i de laveste poengsum prøver (P 0,05).
(A) Parafin-embedded (4,0 mikrometer) deler fra godartet og prostatakreft av ulike Gleason score ble brukt for SATB1 uttrykk ved immunhistokjemi. En sterk kjernefysisk og cytoplasma farging ble observert i Gleason vurdering 3 + 3, mens økt atom SATB1 farging ble observert i høy grad kreft (Gleason score 3 + 4 og 4 + 5, henholdsvis). Forstørret på x20 og x40 (B) Statistisk analyse av SATB1 atom nærvær ble utført ved å sammenligne SATB1 positive atom fargede celler fra forskjellige steder fra godartet, scorer 5-6, scorer 7-8 og scorer 9-10 prøver. Data representerer middelverdi ± SE. *
P
0,05
versus
tilsvarende kontroll. P 0,05, er detaljer beskrevet i «materialer og metoder delen
SATB1 Expression i Human prostata kreft celler
Vi undersøkte SATB1 uttrykk i 8 prostata epiteliale cellelinjer, inkludert ikke. -tumorigenic viralt transformerte humane prostata epitelceller (PZ-HPV-7) og dens kreft motstykke (CA-HPV-10), 3 primær prostatacancercellelinjer viz. DU145, LNCaP og PC-3 og deres biologisk aggressive subkloner: DUPro, C4-2B og henholdsvis PC-3M,. Som vist i figur 3A, SATB1 proteinnivåer var høyere i alle prostatakreftcellelinjer sammenlignet med de ikke-tumorigene PZ-HPV-7 celler. Den primære kreftcellelinjer nemlig. CA-HPV-10, DU145, LNCaP og PC-3 celler uttrykker 7.94- til 16,82 ganger økning i SATB1 uttrykk i forhold til PZ-HPV-7 celler. Den aggressive subkloner utstillings 17.0- til 20,53 ganger økning i SATB1 uttrykk, sammenlignet med ikke-tumorigene celler. Vi sammenlignet også cytosoliske og kjernekraft uttrykk for SATB1 i LNCaP og PC-3 sine respektive subkloner C4-2B, og PC-3M celler. Som vist i figur 3B, ekspresjonen av SATB1 i LNCaP og PC-3-celler var relativt like i cytosol og atomfraksjoner. I motsetning til dette ble høye nivåer av SATB1 protein ekspresjon observert i atomfraksjonen av den aggressive subklon C4-2B og PC-3M-celler. Disse resultatene er i overensstemmelse med vevsprøvene hvor betydelig høy atom SATB1 uttrykk korrelerte med sykdom aggressivitet
(A) Western blotting for SATB1 protein uttrykk i ulike prostata kreft celler.; CA-HPV-10, DUPro, DU145, PC-3, PC-3M, LNCaP og C4-2B inkludert transformerte epitel (PZ-HPV-7), celler. (B) Cytoplasmatiske og kjernekraft SATB1 protein uttrykk ble analysert i prostatakreft foreldre celle avstamning og deres aggressive subkloner LNCaP og C4-2B; PC-3 og PC-3M som representerte høyere atom nærvær av SATB1 i aggressive subkloner. Histone H4 tjente som lasting kontroll. Densitometrisk analyse for hvert blot er vist i panelet til høyre. Detaljer er beskrevet i «materialer og metoder «-delen.
SATB1 knockdown Reduserer Aggressivitet av prostata kreft celler
Vi undersøkte om SATB1 er nødvendig for invasiv fenotype av prostatakreftceller. I forsøket ble det PC-3M-celler som uttrykker høye nivåer av konstitutive SATB1 brukt og korte hårnål RNA (shRNA) til knockdown SATB1 uttrykk. Vi brukte shRNA fra to forskjellige SATB1 sekvenser (shRNA1 og shRNA2) og kontroll shRNA i de svært aggressive PC-3M celler. Som vist i figur 4A, ble SATB1 ekspresjon signifikant redusert med 85,5% og 77,5% i både SATB1 shRNA1 og henholdsvis shRNA2,, mens ingen signifikante forandringer i SATB1 ekspresjon ble observert i PC-3M-celler behandlet med kontroll shRNA. Videre redusert SATB1 knockdown migrasjons og invasjons mulighetene i PC-3M celler sammenlignet med foreldrenes cellelinje og kontroll shRNA celler. Migreringen og invasive kapasitet in vitro av SATB1 mRNA-celler ble redusert med 68-80%, som korrelert med økt ekspresjon av E-cadherin og reduserte nivåer av MMP-9 etter at shRNA knockdown (figur 4B). Reduksjon av SATB1 nivåer i PC-3M-celler ble redusert celleproliferasjon, restaurert forankringsavhengig vekst og tilbakestilt cellene til en polarisert morfologi som observert under lett mikroskopi (figur 4C).
Prostatakreft PC-3M-celler ble transfektert med og uten DNA (uekte), eller SATB1 målrettet shRNA vektor 1og 2 og fortsatte i kultur i 24 timer. (A) SATB1, E-cadherin, MMP9 og p p-aktin totale protein uttrykk ble analysert ved Western blotting. (B) SATB1 stanse i PC-3M celler var assosiert med lav invasiv og migrasjon potensial. Barer representerer gjennomsnitt ± SE av tre forskjellige analyser. **
P
0,001
versus
kontroll. (C) Representative PC-3M celler Bildene vises med og uten SATB1 shRNA transfeksjon. Detaljer er beskrevet i «materialer og metoder» -delen.
SATB1 Fremmer Aggressiv Phenotype i Prostata Epitelceller
Vi neste undersøkt om ektopisk uttrykk for SATB1 er tilstrekkelig til å indusere invasiv aktivitet i viralt transformert non-tumorigene menneskelige prostata epitelceller. Kontroll PZ-HPV-7 celler ble transient transfektert med pCMV6-A6 Sann Clone menneskelig plasmid DNA inneholder SATB1 og med SATB1 mock RNA. Transfeksjon med SATB1 uttrykk plasmid økt uttrykk for SATB1 i PZ-HPV-7 celler og økt migrasjon og invasjon evner
in vitro
av 50-67%. SATB1 overekspresjon i PZ-HPV-7-celler resulterte i redusert ekspresjon av E-cadherin og økningen i MMP-9 nivåer i disse cellene (figur 5A-C).
PZ-HPV-7-celler ble transfektert med og uten DNA (mock), eller den SATB1 målrettede vektor 1 og fortsatte i kultur i 24 timer. (A) SATB1, E-cadherin, MMP9 og Histone H4 protein uttrykk ble bestemt i den cytosoliske og kjernefraksjonen ved Western blotting. SATB1 overekspresjon resultert i nedgang E-cadherin uttrykk og oppregulert MMP9 uttrykk. (B) Overekspresjon av SATB1 i PZ-HPV-7 celler var assosiert med øket invasiv potensial. Barer representerer gjennomsnitt ± SE av tre forskjellige analyser. **
P
0,001
versus
kontroll. (C) Representant PZ-HPV-7 bilder med og uten SATB1 overekspresjon vektor trasfection. Detaljer er beskrevet i «materialer og metoder» -delen.
SATB1 Nedbryting hemmer tumorvekst i atymiske nakne mus Xenotransplantat
Vi testet om SATB1 uttømming fra PC-3M celler hemmet tumorvekst. For disse studiene vi utviklet cellelinjer som ble stabilt forstummet for SATB1 uttrykk ved hjelp av en shRNA-lentiviral leveringssystem. Celler ble valgt opp til 10 passasjer og celler ovennevnte passasje 11 ble anvendt for undersøkelsene. En betydelig reduksjon i SATB1 ekspresjon ble observert i PC-3M-KO-celler. Knockdown av SATB1 var mer fremtredende i den kjernefysiske fraksjonen i disse cellene. SATB1-KO celler viste en økning i doblingstiden fra 26.86 ± 4.89 h, sammenlignet med PC-3M celler med 20,04 ± 4,34 h, henholdsvis. Vi bestemte også invasiv kapasitet
in vitro
av SATB1-KO celler. Konsistent uttømming av SATB1 reduserte kolonidannelse av disse celler i myk agar, noe som indikerer at tapet av SATB1 gjenopprettet sitt forankringsavhengig vekst (figur S1 A-C).
ved siden gikk videre til
in vivo
studier. De styre PC–3M celler og SATB1 KO celler ble injisert til flankene av nakne mus for å danne svulster. Tumorvolumet ble registrert annenhver dag, og forsøket ble avsluttet på 31 dag som tumorstørrelse av PC-3M tumorer var store, mens mus injisert med SATB1 KO klon ført til redusert tumorvekst med en reduksjon i tumorvekt og volum (P 0,003) (figur 6 A-C). Vi målte også protein uttrykk for voksende cell nuclear antigen (PCNA), E-cadherin, MMP9 og SATB1 i disse svulstene. Som vist i figur 6 D; SATB1 knockdown resulterte i markert reduksjon i protein ekspresjon av PCNA i tumorxenografter. En økning i E-cadherin uttrykk ble observert i SATB1-KO svulster i forhold til PC-3M svulster. Disse resultatene indikerer at SATB1 ekspresjon i PC-3M-celler kan være en forutsetning for tumorvekst og aggressivitet av disse cellene.
(A) SATB1 knockout i PC-3M-celler resulterte i reduksjon i tumorvolum. (B) Fotografi av tumor xenograft i PC-3M og SATB1-KO svulster. (C) Tumorene ble skåret ut, veiet og målt ved slutten av studien. Tumorvekt var signifikant redusert i SATB1-KO tumorer i atymiske nakne mus. Omtrent 1 x 10
6-celler ble injisert i flankene av hver mus for å initiere ektopisk prostata svulst, som beskrevet i «Materialer og metoder». Tumorstørrelse ble målt to ganger ukentlig i to dimensjoner gjennom hele studien. Tumorvolum (mm3) og våtvekt av tumorer er representert som gjennomsnittet av 8-10 tumorer hos kontroll PC-3M og SATB1-KO PC-3M tumorer. **
P
0,003; barer; Mean ± SE.
