Abstract
Immunologi baserte tiltak har blitt foreslått som en lovende kurativ mulighet til å effektivt angripe postoperativ minimal restsykdom og fjernt metastatisk lokaliseringer av prostatakreft. Vi har utviklet et kimert antigen-reseptor (CAR) konstruere målretting av den humane prostata-spesifikt membran antigen (hPSMA), basert på en ny og høy affinitet spesifikk mAb. Som en overføringsmetode, som anvendes vi siste generasjon lentivirale vektorer (LV) som bærer et syntetisk toveis promoter som evner å robust og koordinert ekspresjon av CAR-molekylet, og en bioluminescent reportergen for å tillate sporing av transgene T-celler etter
in vivo
adoptiv overføring. Alt i alt demonstrerte vi at CAR-uttrykkende LV effektivt transdusert kortvarig aktivert PBMC, som i sin tur lett ble stimulert til å produsere cytokiner og for å utøve en relevant cytotoksisk aktivitet ved inngrep med PSMA
+ prostatatumorceller. Ved
in vivo
overføring i tumorbærende mus, CAR-transduced T-celler var i stand til å fullstendig utrydde en spres neoplasi hos de fleste behandlede dyr, og dermed støtter oversettelse av en slik tilnærming i klinisk setting.
Citation: Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo A, Montagner IM, Rondina M, Bobisse S, et al. (2014) PSMA Spesifikke CAR-Engineered T celler Utrydde disseminert prostatakreft i prekliniske modeller. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10,1371 /journal.pone.0109427
Redaktør: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: May 27, 2014; Godkjent: 01.09.2014; Publisert: 03.10.2014
Copyright: © 2014 Zuccolotto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC, IG-13121, og spesialprogram Molecular Clinical Oncology 5 per mille ID 10016 til AR) og Universitetet i Padova, «Progetti Strategici di Ateneo 2011» til AR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adoptiv celleterapi med umodifisert og
ex vivo
ekspanderte T-celler har vist seg å være effektiv mot forskjellige tumortyper, særlig melanom og EBV-assosierte tumorer [1]. I dag kan genmodifisering av T-celler gi ny svulst målretting egenskaper til naturlig forekommende lymfocytter, og dermed overvinne avhengigheten av komponenter av endogen immunsystemet.
Mens transduksjon med Ag-spesifikke TCR kan bare omdirigere T-celle aktivitet basert på de samme anerkjennelse egenskaper, har kimære antigen reseptor (CAR) -teknologi et potensiale til å gi gave til T-celler med fordelaktige trekk et antistoff, nemlig spesifisitet, tilhørighet og mulighet for å målrette ikke-proteinantigener [2]. Videre, i en unik molekyl CAR gir noen tiltak for å motvirke svulst immun evasion strategier: det lindrer T-celle anerkjennelse og aktivitet av MHC begrensning og uttrykk, og kan videresende samtidig stimulerende signaler gjennom sine intracellulære domener
Terapeutisk effekt av CAR. T-celler er allerede rapportert hos pasienter, spesielt mot kronisk lymfatisk leukemi (KLL) og akutt lymfatisk leukemi (ALL) [3] – [6] med svært lovende resultater i form av sykdomsfri overlevelse og fullstendig hematologisk og molekylære responser selv i pasientene som sviktet alle tidligere standard behandling. Imidlertid hematologiske maligniteter, spesielt de av B-celleopprinnelse, kan betraktes som et ideelt mål for immunterapeutiske metoder [7]. Faktisk disse ondartede celler naturligvis gi samtidig stimulerende reseptorligander og deler de samme fysiologiske avdelinger med adoptiv overført T-celler. Endelig er eliminering av normale B-celler assosiert med ikke livstruende uønskede effekter, som kan være klinisk administreres med intravenøs immunglobulin administrasjon.
Motsatt er fortsatt solid svulst behandling en stor utfordring og bør forbedres både når det gjelder klinisk effekt og sikkerhet. Partielle suksesser var erfarne mot neuroblastom ved hjelp av GD2-spesifikke CAR T-celler uten forhåndskondisjonering diett, i den virtuelle fravær av bivirkninger, [8], [9]. Derimot ble ingen kliniske reaksjoner registrert med infusjon av T-celler omdirigert mot folat reseptoren i ovarialcancer pasienter [10], og heller ikke mot karboksy-anhydrase IX (Caix) hos nyrecellekreft pasienter [11], til tross for relevant «på -target, off-tumor «toksisitet dokumentert i sistnevnte tilfelle. Erfaringer fra disse erfaringene tilsier at definisjonen av målet antigen for sikkerhetsspørsmål, og utholdenhet og tumor homing kapasitet på tilført cellene er spesielt kritisk for en vellykket behandling.
Vi adressert noen av disse spørsmålene ved å målrette prostata svulst kreftceller med T-celler modifisert til å uttrykke en CAR spesifikk for den menneskelige prostata-spesifikt membran antigen (hPSMA).
prostata svulst representerer et alvorlig klinisk enhet, med anslagsvis 233.000 nye tilfeller og 29,480 dødsfall i USA i 2014 [12], med for tiden kun palliativ behandling for hormon ildfast og metastatisk former [13]. For disse pasientene har immunterapi vist seg å være et gyldig alternativ basert på vaksinering med modifiserte hele prostatatumorceller (GVAX [14]) eller PBMC presentere en relevant prostata antigen (Sipuleucel-T [15]). Med hensyn til adoptiv celle terapi tilnærminger, har prekliniske studier rapporterte oppmuntrende resultater [13], [16], [17] og klinisk evaluering er under (klinisk utprøving nummer NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196, www.clinicaltrials.gov). I dette scenariet kan PSMA representere et passende mål og faktisk det er i dag utnyttes til både bildebehandling og terapeutiske formål. Spesielt PSMA uttrykk nivåer skille normale og kreft prostata- vev, og parallelt Gleason score på prostatakreft [18]. Interessant, innebærer PSMA uttrykk neovaskulaturen av flere kreft enheter, og dermed ser for seg en ekstra antiangiogen effekt.
Her rapporterer vi utformingen av CAR mot hPSMA basert på en roman og høy affinitet spesifikk mAb [19], og den fenotypiske og funksjonell karakterisering av T-body-hPSMA både
in vitro Hotell og
in vivo
. For transduksjon, anvendte vi en lentiviral vektor som bærer en toveis promoter som driver samtidig ekspresjon av CAR-molekylet og en reporter bioluminescent genet. Dette tillot sporing av infundert T-celler og således direkte korrelasjon av det terapeutiske resultat med utholdenhet og homing kapasitet av T-celler. Samlet sett CAR-transduced T-celler ikke bare hatt en relevant lokoregionalt terapeutisk aktivitet, men også helt utryddet en spres neoplasi hos de fleste behandlede dyr. Disse resultatene støtter sterkt oversette slik tilnærming i klinisk setting
Materialer og metoder
Cellelinjer
Følgende cellelinjer ble brukt i denne studien. LNCaP og PC3 , menneskelige prostata carcinom cellelinjer; Jurkat human T-lymfoblastisk leukemi og 293 T [20], human embryonisk nyrecellelinje. Den PC3-PIP cellelinje, som stabilt uttrykker menneskelig PSMA (hPSMA) [21] ble sjenerøst gitt av Dr. Warren Heston; LNCaP-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). LNCaP, PC3, PC3-PIP og Jurkat-celler ble holdt i RPMI 1640 medium (EuroClone, Milano, Italia), mens DMEM-medium (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) ble brukt for 293-T-celler; begge media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco BRL Paisley, UK), 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin (alt fra Lonza, BioWhittaker, Basel , Sveits), ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
Anti-hPSMA CAR generasjon
CAR mot hPSMA antigenet inneholder hele sekvensen til anti- hPSMA scFv avledet fra anti-hPSMA D2B hybridoma [19]. Denne sekvensen ble klonet inn i multiple kloningssete (MCS) i pSecTag2A vektor (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italia). MCS av pSecTag2A plasmidet er mellom to sekvenser: i 5 «, den murine Ig-kappa-lettkjede-ledersekvensen V-J2-C, og i 3»-myc-tag sekvensen. Dermed ble leder-ScFv-myc sekvens brukes for CAR generasjon. Lederen-ScFv-myc-fragment ble amplifisert ved PCR og innsatt i pBS SKII konstruktet (Invitrogen). En del av CD28 (baser 438-759) og CD3ζ intracellulære domenet (227-563 region), begge oppnådd fra cDNA av EBV-spesifikke CD4
+ T-celler [22], ble smeltet ved PCR og deretter innsatt i PBS SKII vektor, nedstrøms Leader-ScFv-myc fragment. Denne vektor ble deretter sekvensert ved Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI) fra Padua University, Italia. Den anti-hPSMA CAR-sekvensen til slutt ble subklonet inn i pcDNA3.1 vektor (Invitrogen). For å sjekke kapasitet til å drive uttrykk for CAR-molekylet på membranen, ble denne vektoren brukt til å transfektere 293 T-celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner.
LV plasmider og lentiviral forberedelse
følgende lentiviral emballasje vektorer ble brukt: pMDLg /pRRE, pRSV-Rev, pMD2.VSVG og pADVantage, alle vennlig levert av Dr. L. Naldini (San Raffaele, Milano, Italia). Den overføringsvektor # 945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre er en selv-inaktivering (SIN) HIV-avledet vektor [23], som bærer en minCMVPGK divergerende toveis promotoren som driver den samtidige uttrykket av to gener i antisense orientering. Transfer vektorer brukt i denne studien utført på anti-hPSMA CAR sekvens (oppnådd fra PMA-T-legeme vektor) under kontroll av den hPGK promoteren, og den EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller ildflueluciferase (Fluc) rapportørgener i henhold kontroll av minCMV. PMA-T-body vektor og Fluc sekvens ble syntetisert ved GeneArt, Life Technologies (Regensburg, Tyskland). Lentiviral produksjon i 293 T-celler har tidligere blitt beskrevet [23]. En lentiviral vektor koding bare for Fluc [24] ble brukt til å omsette PC3-PIP celler.
Western blot analyse
293 T-celler, utransfekterte eller transfektert med pcDNA3.1-CAR, ble lysert i buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-merkaptoetanol, 10% glycerol, og 0,1 til 0,05% bromfenol blå (al fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) Proteinene ble separert på 10% SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membran (Immobilion-P, Millipore, Billerica, MA, USA). Membranen ble blokkert i 5% skummet melk (Sigma-Aldrich) i TBS og 0,05% Tween 20, fulgt av inkubering med det primære antistoff (mus anti-c-myc-mAb, 1:1000, Sigma-Aldrich) i en time ved romtemperatur. Etter tre 10 minutters vaskinger i PBS-Tween, HRP-konjugert geite-anti-mus IgG sekundært antistoff (fortynnet 1:10000, Amersham, Milano, Italia) ble tilsatt i én time ved romtemperatur og i melk. Membranen ble utviklet ved hjelp av SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA) og visualisert ved hjelp chemiluminescence. Signalintensitet ble målt ved hjelp av en Bio-Rad XRS chemiluminescence deteksjonssystem (Life Science Group, Milano, Italia).
Jurkat celle transduksjon
For å vurdere funksjonaliteten LV vektorer, ble Jurkatceller inkubert med viral supernatant (hPSMA /EGFP LV CAR eller hPSMA /Luciferase LV CAR) i 15 timer i nærvær av 8 mikrogram /ml protaminsulfat (Sigma-Aldrich). Flowcytometri og Bioluminesens (BLI) analyser ble utført ved ulike tidspunkt innlegg transduksjon å evaluere CAR og EGFP uttrykk eller luciferase aktivitet.
T-organer generasjon
For å generere T-organer, PBMC fra friske donorer ble aktivert 48 timer med OKT-3 (50 ng /ml, Ortho Biotech Inc, Raritan, NJ, USA) og humant IL-2 (HIL-2, 300 U /ml; Proleukin, Novartis, Horsham, UK ). T-cellene ble så infisert med det virale supernatanten i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO
2, i nærvær av protamin-sulfat (40 ug /ml; Sigma-Aldrich) og hIL-2 (500 U /ml ). Supernatanten ble deretter erstattet med friskt komplett medium som inneholdt hIL-2 (100 U /ml). Sytti-to timer senere, PBMC ble analysert for CAR og EGFP uttrykk, og for luciferase aktivitet. PBMC ble referert til som T-body-hPSMA /EGFP og T-body-hPSMA /Fluc når transduced med hPSMA /EGFP LV CAR eller hPSMA /Luciferase LV CAR, henholdsvis. T-organer ble gjen stimulert en gang i uken med bestrålt (60 Gy) PC3-PIP på en 10:01 forholdet. Komplett medium med frisk IL-2 ble fylt opp to ganger i uken
Antistoffer
CAR-uttrykke celler ble merket med anti-c-myc mAb (klone 9E10, Sigma-Aldrich). Eller isotypekontroll (mus lgG1, Southern Biotech, Milano, Italia), fulgt av et sekundært antistoff (PE-konjugert geit-anti-mus IgG; Southern Biotech). Celleoverflatemarkører ble merket ved hjelp av APC-, FITC- eller PE-konjugerte antistoffer mot CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, USA), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) og de relative isotype kontroller kjøpt fra de samme selskapene.
Cvtotoksisitetsmålinq
Den cytotoksiske aktiviteten til T-body-hPSMA /EGFP og T-body-hPSMA /Fluc ble vurdert i en standard 4 h
51 Cr-release assay som tidligere rapportert [25], ved ulike tidspunkt etter transduksjon. PC3, PC3-PIP og LNCaP ble brukt som målceller.
cytokine release analyser
For å evaluere IFN-γ produksjon, en ELISA IFN-γ Screening Set (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, en x 10
6 T-celler ble podet med 1 x 10
6 målceller (PC3 eller PC3-PIP) i triplikate brønner i 96-brønners rundbunnede plater. Cytokin sekresjon ble målt etter 12 timers inkubering ved hjelp av T-legemer på ulike stadier av differensiering. Negative og positive kontroller ble representert ved untransduced PBMC og T-legemer ustimulert eller behandlet med 40 ng /ml PMA og 4 ug /ml Ionomycin (Sigma-Aldrich), respektivt. Supernatantene ble deretter analysert på en VICTOR X4 (PerkinElmer, Zaventem, Belgia).
Mus og
in vivo
eksperimenter
In vivo
eksperimenter involvert 6 til åtte uker gamle hanner SCID, Rag2
– /- /γc
– /- og NOD /SCID mus (Charles River Laboratories, Calco, Como, Italia), som ble plassert i den spesifikke patogen-frie dyr innretningen av Department of Surgery, Onkologi og Gastroenterology, Padua University (Italia). Dyrene ble huset med en 12-timers lys /mørke-syklus, i temperatur (22 +/- 1 ° C) og fuktighet (55 +/- 5%) kontrollert rom. Alle mus ble tillatt fri tilgang til vann og en diett vedlikehold. Alle bur plassert inntil 6 dyr og inneholdt tre spon og et papprør for miljøberikelse. Prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg var i samsvar med institusjonelle retningslinjer som er i samsvar med nasjonale og internasjonale lover og retningslinjer (DL 116/92 og påfølgende gjennomførings rundskriv), og den eksperimentelle protokollen (n ° 7/2012) ble godkjent av den lokale Etisk Komité av Padua University (CEASA). Under
in vivo
eksperimenter, ble dyr i alle eksperimentelle grupper undersøkt daglig for en nedgang i fysisk aktivitet og andre tegn på sykdom; alvorlig syke dyr (vekttap på over 15%, slapphet, rusket hår, lav temperatur) ble avlivet av karbondioksid overdose.
Winn assay.
Winn assay ble utført ved å injisere subkutant SCID-mus med 5 × 10
6 PC3 eller PC3-PIP tumorceller per dyr, blandet med enten RPMI eller T-body-hPSMA /EGFP celler (5 × 10
6 /mus, 6 mus /gruppe). Tumorvolumet ble beregnet i henhold til følgende ligning: V (mm
3) = (d
2 * D) /2, hvor d (mm) og D (mm) er de minste og de største perpendikulære tumor diametre, henholdsvis som vurdert av skyvelære måling.
Loco-regional behandling.
for å evaluere det terapeutiske potensialet i lokoregionalt behandling, ble SCID-mus injisert sc med 5 × 10
6 PC3-PIP celler. Når svulster blir følbar om fire dager senere, mus ble randomisert til kontrollgruppen (de ble stående ubehandlet) eller eksperimentgruppen (de ble injisert intralesjonalt med CAR-transduced T-celler i 72 timer etter transduksjon, 6 mus /gruppe). To primære utfall ble analysert: tumorvekst ble overvåket over tid ved skyvelære måling og total overlevelse ble registrert
Systemisk behandling av subkutane prostatakreft
For å vurdere den terapeutiske aktiviteten av systemisk T.. -body administrasjon, SCID-mus ble injisert sc med 5 × 10
6 PC3-PIP celler og 4 dager senere fikk de intravenøst T-body-hPSMA /Fluc (10 × 10
6 /mus) på 72 timer eller 5-6 uker etter transduksjon (n = 6); ubehandlede dyr tjente som kontrollgruppe (n = 6). T-celle biodistribusjon ble vurdert ved bioluminesens imaging (BLI) i samme forhold, bortsett fra at mus ble injisert med begge PC3-PIP eller PC3 tumorceller på høyre og venstre flanke, henholdsvis.
Disseminert prostata svulst modell.
for å sette opp en modell av disseminert prostata svulst, SCID, Rag2
– /- /γc
– /- og NOD /SCID-mus ble injisert iv med ulike tall (fra 1 × 10
5-5 × 10
6) av Fluc-transduced PC3-PIP-celler (6 mus /gruppe). Tumor engraftment og vekst ble evaluert av BLI. Videre tumor-fri SCID, Rag2
– /- /γc
– /- og NOD /SCID-mus ble injisert med 20 × 10
6 T-body-hPSMA /Fluc, for å evaluere deres skjebne etter BLI (6 mus /gruppe).
adoptiv immunterapi eksperimenter.
I adoptiv immunterapi eksperimenter, selvlysende PC3-PIP ble injisert iv i NOD /SCID og Rag2
– /- /γc
– /- mus (1 × 10
5 /mus). Fire dager senere ble dyrene randomisert til kontrollgruppen (de forble ubehandlet) eller den eksperimentelle gruppe, hvor de fikk i.v. 20 × 10
6 T-body-hPSMA /EGFP for 3 ganger i løpet av en uke (6 mus /gruppe). Tumorvekst ble overvåket ukentlig av BLI, og overlevelse ble registrert.
Kvantitativ Bioluminesens
Kvantitativ BLI er en kraftig teknologi som gjør det mulig å få flere bilder på langs og på samme tid, for å redusere dyre tall. Bioluminesens bilder ble samlet inn med IVIS Lumina II Imaging System (PerkinElmer). Ti til femten minutter før imaging, ble dyrene bedøvet med isofluran /oksygen og administrert intraperitonealt med 150 mg /kg av D-luciferin (PerkinElmer) i PBS. Tre mus ble avbildes samtidig med eksponeringstider som strekker seg fra 0,5 til 3 min. En 12 × 12 cm synsfelt og lav, middels eller høy binning nivåer ble brukt for å maksimere sensitivitet og romlig oppløsning. Ventral bildene ble innhentet for hvert dyr og kvantifisert gjennom regionen av interesse (ROI). Leve Bilde programvare (PerkinElmer) ble brukt til å erverve og kvantifisere bioluminesens bilde datasett.
Cytofluorimetric evaluering av hPSMA uttrykk i voksende svulster
tumorceller suspensjoner ble oppnådd ved enzymatisk fordøyelse med 270 enheter /ml DNase, 35 U /ml hyaluronidase, og 200 U /ml kollagenase buffer (alt fra Sigma-Aldrich). Etter en 30-minutters inkubering ved 37 ° C ble cellene passerte gjennom en 70-mikrometer celle sil (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prøvene ble deretter farget ved 4 ° C med et mus-anti-hPSMA mAb [19], etterfulgt av et PE-konjugert anti-mus lgG1 sekundært antistoff (BioLegend) og analysert på et FACSCalibur (BD) strømningscytometer. Data ble evaluert med FlowJo programvare (TreeStar Inc., Olten, Sveits).
Statistisk analyse
Kaplan-Meier produkt-limit metoden ble utført for å estimere overlevelseskurver, og sammenligning av overlevelse mellom grupper ble utført ved hjelp av log-rank test. Statistiske analyser ble utført med Sigmaplot (versjon 12.3) statistikkpakke.
Resultater
Konstruksjon og utvikling av en effektiv toveis LV for anti-hPSMA CAR uttrykk
En CAR sekvensen ble konstruert som kodet for de følgende bestanddeler i-ramme fra 5 «til 3»-endene (figur 1A.): en ledersekvens, er enkelt-kjede variable fragment (ScFv) av det nye anti-hPSMA antistoff IgGD2B [19], c-myc-tag sekvensen, og CD28 kostimulerende molekyl knyttet til den CD3ζ sekvensen. Vi bestemte oss for å utnytte denne nye anti-PSMA scFv (scFvD2B) for bygging av vår bil, på grunn av sin meget tiltalende egenskaper, særlig nanomolar affinitet for målet som er lik den som dokumentert av hele J591 antistoff [19] . Dessuten viser våre scFvD2B høy spesifisitet og identifiserer en annen epitop fra det anerkjent av J591 antistoff, som vurdert av konkurranse eksperimenter utført med radio immunoligands eller biotin-merkede antistoffer ([19] og data ikke vist).
(A) Anti-hPSMA CAR kartet. EC: ekstracellulært domene; TM: transmembrane domene; IC: intracellulære domenet. (B) Cytofluorimetric profilen til CAR uttrykk i 293-T-celler. 293 T-celler ble transfektert med vektor pcDNA3.1 bærer CAR sekvens og analysert ved flow-cytometri etter 24 timer (mørk linje). Utransfekterte celler (grå tomt) fungerte som kontroll. (C) CAR uttrykk som vurdert ved Western blotting ved 24 timer (linje 1) og 7 dager (linje 2) etter 293 T-celle transfeksjon. Negative kontroller var det medium alene (linje 3) og utransfekterte 293 T-celler (linje 4). Linje 5, molekylvektmarkører. (D) lineær transformasjon av det rekombinante virale vektor inneholdende minCMVPGK toveis promoter (22). Spesielt reportergenet (EGFP eller luciferase) er under kontroll av promoter minCMV, mens CAR-genet er under kontroll av promoter hPGK. (E) Transduksjon av Jurkatceller med LV CAR anti-hPSMA /EGFP. Co-uttrykk for c-myc og EGFP i LV-transduced Jurkatceller, som vurderes av flowcytometri. Prikkplott rapporterer hendelser gating på totalt levedyktige celler; mer enn 90% av cellene co-uttrykker både c-myc og EGFP. (F) Transduksjon av Jurkatceller med LV CAR anti-hPSMA /Luciferase.
Venstre panel
, c-myc uttrykk (svart) i Jurkatceller på 72 timer etter transduksjon, som vurderes av flowcytometri. Grey tomten representerer isotypekontrollantistoff.
Høyre panel
, Vurdering av luciferase aktivitet i LV-transduced Jurkatceller (2 × 10
5 /brønn) av BLI.
For å vurdere kapasiteten på konstruksjonen til drive ekspresjonen av en reseptor som korrekt montert på cellemembranen, ble den anti-hPSMA CAR-sekvensen klonet inn i vektoren pcDNA3.1 og det resulterende plasmidet ble anvendt for forbigående transfeksjon av 293-T-celler. Ved forskjellige tidspunkter deretter ble ekspresjonen av det kimære reseptor vurdert ved cytofluorimetric og Western blotting-analyse (Fig. 1B og 1C, henholdsvis), ved bruk av anti-c-myc-mAb. Resultatene avslørte at CAR ble riktig montert på membranen og hadde den forventede molekylvekt (omtrent 60 kDa); CAR uttrykk allerede var detekterbar 24 timer etter transfeksjon, for raskt å forsvinne de neste dagene på grunn av mangel på et utvalg trinn (fig. 1C). Deretter ble CAR-sekvens settes inn i en LV bærer en toveis promoter som tillater transkripsjon av et reportergen (EGFP eller Fluc) fra oppstrøms minimal promoter minCMV, uten å påvirke nedstrøms ekspresjon av anti-hPSMA CAR på effektiv hPGK promoter (fig . 1D). For å vurdere funksjonaliteten til lentiviral vektorer, ble Jurkatceller transduced med LV CAR hPSMA /EGFP og LV CAR hPSMA /Fluc. CAR viste seg å være sterkt uttrykt som allerede 72 timer etter transduksjon, som demonstrert ved den høye andelen av c-myc
+ celler detektert ved strømningscytometri-analyse (Fig. 1E og 1F). Spesielt CAR-uttrykke celler var mer enn 90% når transduced med LV CAR hPSMA /EGFP (Fig. 1E) og mer enn 60% ved bruk av LV CAR hPSMA /Fluc (Fig. 1F,
venstre panel
). Spesielt de toveis LV vektorer syntes å drive uttrykk for enten bilen og reporter gener med en veldig balansert effektivitet, som demonstrert av den høye intensiteten av EGFP signal (Fig. 1E) og relevant Luciferase aktivitet (Fig. 1F,
høyre panel
).
Fenotypisk karakterisering av CAR-transduced T-cellepopulasjoner
for den generasjonen av T-cellepopulasjoner som uttrykker anti-hPSMA CAR, en rask ekspansjon protokollen ble utviklet . Den optimale infeksjon gang ble satt opp etter 48 timer med OKT3 aktivering, siden på dette tidspunktet vi oppnådd den høyeste andelen av CAR-uttrykke T-celler (fig. 2A,
venstre panel
), og et mindre differensiert fenotype , som vurdert av den høye uttrykk for CD27, CD28 og CD62L markører (fig. 2A,
sentrale panel
). Deretter involvert utvidelse protokollen ukentlig restimuleringen med PC3-PIP celler som tillot en rask og vedvarende spredning av både T-body-hPSMA /EGFP og T-body-hPSMA /Fluc populasjoner (Fig. 2A,
panel rett
).
(A) Sett opp av transduksjon protokollen og vekstkinetikk.
Venstre panel
, PBMC ble aktivert med OKT3 ved tid 0 og omformet samtidig (Td0), eller etter 48-h (TD2) eller 72-h (TD3) timer. Flowcytometri analyse av c-myc tag uttrykk ble utført 72 timer etter infeksjon.
Central panel
rapporterer uttrykk for CD27, CD28 og CD62L i de tre ulike forhold av aktivering /infeksjon rapportert i
venstre panel
.
Høyre panel, etter Utvidelse av T-body-hPSMA /Fluc og T-body-hPSMA /EGFP omformet etter 48 h aktivering i respons til ukentlig restimuleringen med PC3-PIP celler. Untransduced PBMC ble anvendt som kontroll. (B) Phenotype og CAR uttrykk i omsatte T-celler ved stimulering.
Venstre panel
, Expression av overflatemarkører i T-kroppen-anti-hPSMA /Fluc på ulike tidspunkter (3, 11 og 18 dager) etter transduksjon, som vurderes av flowcytometri. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. Overlappende resultater ble oppnådd i T-kroppen-anti-hPSMA /EGFP.
Høyre panel, etter andel av c-myc
+ celler i LV CAR hPSMA /Fluc og LV CAR hPSMA /EGFP-omsatte T-cellepopulasjoner på ulike tidspunkter poste transduksjon. Figuren viser midlere +/- SD av minst tre uavhengige eksperimenter. (C) Kinetikk av CD4 og CD8 undergrupper i transdusert T-cellepopulasjoner. Uttrykk av CD4 og CD8 markører i c-myc
+ – gated T-body-hPSMA /EGFP
(venstre panel) Hotell og T-body-hPSMA /Fluc (
panel høyre)
populasjoner på ulike tidspunkter legge transduksjon, som vurderes av flowcytometri. Dataene er hentet fra et representativt eksperiment av tre som produserte lignende resultater.
For å bedre definere statusen for differensiering av CAR-transduced T-lymfocytter i posten infeksjon perioden antigene restimulations, uttrykk for ulike overflatemarkører (CD62L, CD27, CD28, CCR7, CD57) ble vurdert ved å cytofluorimetric analyse. Syttito timer etter transduksjon, den nye profilen var i det vesentlige av tidlig effektor-T-celler, som vist ved høy ekspresjon av CD62L, CD27 og CD28, tilstedeværelsen av CCR7-positive celler og den lave ekspresjon av CD57 (fig. 2B,
venstre panel
). Etter restimulations med antigenet, T-celler anskaffet en mellomliggende effektor minne fenotype med den progressive ned-modulering av CD62L, CD28 og CCR7, og en liten økning i CD57 ekspresjon (Fig. 2B,
venstre panel
). Interessant, mens den etterfølgende møtet med antigen førte til en utvidelse av CAR-uttrykkende populasjonen (fig. 2B,
høyre panel
), en todeling kunne observeres mellom de voksende T-celleundersett. Faktisk, mens CAR ekspresjon var nesten like innenfor CD4
+ og CD8
+ T-cellepopulasjoner umiddelbart etter infeksjonen, den antigene restimulering bestemt progressiv akkumulering av CD8
+ T-celle-undersett bare, som nesten fullstendig vant CD4
+ T celler ved måned en etter transduksjon (fig. 2C).
Funksjonell karakterisering av CAR-uttrykke T-celler
CAR uttrykk gitt transduced befolkningen med evnen til å gjenkjenne den hPSMA antigenet på overflaten av prostata tumorcellelinjer, og for å formidle en høy og spesifikk cytotoksisitet (fig. 3A). Faktisk, både T-kroppen-hPSMA /Fluc og T-body-hPSMA /EGFP populasjoner oppløste hPSMA-transfekterte PC3 celler mens sparsom antigen-negative motstykke; enda viktigere, de var også i stand til å gjenkjenne LNCaP målcellene som naturlig er bærere av hPSMA antigen. Cytotoksisitet ble allerede tydelig, riktignok ved lave nivåer, 3 dager etter transduksjon og økt ved maksimal nivå bare etter en enkelt runde med antigen restimulering, for å holde seg konstant deretter opp til 2 måneder etter infeksjon. Annet enn å utøve et relevant cytotoksisk aktivitet, CAR-transduced T-celler på ulike stadier av differensiering også produserte høye nivåer av IFN-γ i respons til hPSMA-uttrykker tumorceller (Fig. 3B og 3C), men ikke mot hPSMA negative kontrollceller. Som en negativ kontroll, ble uinfiserte T-celler ikke produsere IFN-γ når ko-dyrket med PC3-celler konstruert for å uttrykke overflaten hPSMA antigenet.
(A) Lytisk aktivitet av T-legeme-hPSMA /EGFP og T -body-hPSMA /Fluc. Cytotoksisitet ble analysert på 3, 11 og 60 dager etter transduksjon; PC3, PC3-PIP og LNCaP celler ble brukt som målceller. Untransduced PBMC tjente som negativ kontroll. I øvre venstre hjørne av hvert panel prosenter av c-myc
+ T-celler er rapportert. Figuren viser gjennomsnittet +/- SD av 4 uavhengige forsøk. (B) IFN-γ sekresjon ved antigenstimulering. IFN-γ produksjonen ble analysert på ulike tidspunkter etter PBMC transduksjon ved å stimulere T-body-hPSMA /Fluc med PC3-PIP hPSMA
+ eller PC3 hPSMA
– kreftcellelinjer. T-legemer ikke-stimulerte eller behandlet med PMA /Ionomycin representerte de negative og positive kontroller, henholdsvis. Lignende resultater ble oppnådd med T-legeme-hPSMA /EGFP. (C) c-myc uttrykk i T-kroppen-hPSMA /Fluc populasjoner testet for IFN-γ produksjon.
Analyse av terapeutisk effekt av anti-hPSMA T-body administrasjon mot lokale prostatakreft
In vivo
terapeutisk effekt av CAR-transduced T-celler på ulike stadier av differensiering (72 timer eller 5 uker etter transduksjon) ble først undersøkt ved hjelp av et Winn assay (fig. 4A). Særlig når PC3-PIP-tumorceller ble ko-injisert med T-legeme-hPSMA /EGFP ikke tumorvekst ble observert (fig. 4A,
venstre panel
), uavhengig av differensiering stadium av T-legemer . På den annen side, har T-celleoverføring ikke betydelig innvirkning på veksten av hPSMA-negative PC3 tumorceller (Fig. 4A,
høyre panel
).
(A) Winn-analysen. PC3-PIP (
venstre panel
) og PC3 (
panel riktig
) tumorceller ble inokulert s.c. i SCID-mus, alene eller blandet 01:01 med T-body-hPSMA /EGFP på motsatte flankene av samme dyr. Tumorvekst ble overvåket over tid ved skyvelære måling.
