Abstract
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en viktig regulator av angiogenese. VEGF uttrykk er opp regulert i respons til mikro-miljø-signaler knyttet til dårlig blodtilførsel som hypoksi. Imidlertid er regulering av VEGF-ekspresjon i kreftceller ikke er begrenset til den stressrespons på grunn av økt volum av tumormassen. Lipid meklere spesielt arakidonsyre-avledet prostaglandin (PG) E
2 er regulatorer av VEGF uttrykk og angiogenese i tykktarmskreft. I tillegg økte osmolaritet som er generert i løpet av colonic vannabsorpsjon og avføring konsolidering synes å aktivere kolon kreftceller og markeds PGE
2 generasjon. Slike fysiologisk stimulering kan gi signalering for kreft opprykk. Her undersøkte vi effekten av eksponering for et hypertonisk medium, for å etterligne colonic miljø, på VEGF-produksjon av tykktarmskreftceller. Rollen som samtidig PGE
2 generasjon og MAPK aktivering ble rettet opp av bestemte farmakologisk hemming. Human koloncancer cellelinje Caco-2 utsettes for en hypertonisk miljø reagerte med markert VEGF og PGE
2 produksjon. VEGF-produksjon ble hemmet av selektive inhibitorer av ERK 1/2 og p38 MAPK veier. For å møte den regulerende rolle av PGE
2 på VEGF produksjon, Caco-2 celler ble behandlet med CPLA
2 (ATK) og COX-2 (NS-398) hemmere, som fullstendig blokkere PGE
2 generasjon . De Caco-2-celler ble også behandlet med en ikke-selektiv PGE
2-reseptor-antagonist. Hver behandling økte hyperton stressutløst VEGF produksjon betydelig. Videre tilsetning av PGE
2 eller selektiv EP
2 reseptor agonist til aktiverte Caco-2-celler inhiberte VEGF-produksjon. Den autokrint hemmende rolle for PGE
2 ser ut til å være selektiv til hyperton miljø siden VEGF produksjon indusert ved eksponering for CoCl
2 ble redusert med hemming av samtidig PGE
2 generasjon. Våre resultater indikerer at hypertoni stimulerer VEGF produksjon i tykktarm kreft cellelinjer. Også PGE
2 spiller en hemmende rolle på VEGF produksjon av Caco-2 celler utsettes for hyperosmotisk stress gjennom EP
2 aktivisering
Citation. Gentile LB, Piva B, Diaz BL (2011) Hyperton Stress Induserer VEGF Produksjonen i human Colon Cancer Cell linje Caco-2: Hemmende rolle Autocrine PGE
2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10,1371 /journal.pone.0025193
Redaktør: Ben C. B. Ko, Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 17 desember 2010; Godkjent: 30 august 2011; Publisert: 28.09.2011
Copyright: © 2011 Gentile et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil) og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasil) (til BLD) og en Ministry of Health (Brasil) PhD fellesskap (til LBG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Dannelse av nye blodkar fra pre-eksisterende blodkar er en sentral prosess i utviklingen av de fleste svulster spesielt solid seg. Denne prosessen kalles angiogenese og er regulert av balansen mellom negative og positive biokjemiske signaler. De nydannede blodkar er ansvarlig for å levere oksygen og næringsstoffer for den voksende svulst masse og en rute for formidling av metastatiske kreftceller. VEGF er den mest fremtredende positiv regulator av angiogenese på grunn av sin evne til å rekruttere endotelceller til hypoksiske områder, og for å stimulere proliferasjonen av denne celletypen, å fremme differensieringen av vaskulære strukturer [1]. VEGF uttrykk korrelerer positivt med negativt utfall hos kreftpasienter. I tykktarmskreft, ekspresjon av VEGF korrelerer med økt metastatisk potensiale [2], mens ekspresjon av dets reseptor er en markør for kortere postoperativ overlevelse [3].
VEGF-ekspresjon er regulert opp i respons til mikro- miljømessige signaler knyttet til dårlig blodtilførsel som hypoksi [4], acidose [5] og lave nivåer av næringsstoffer [6]. I tumorer, reduserte nivåer av O
2 fører til HIF-1α stabilisering, en subenhet av den transkripsjonelle faktor HIF-1, og etterfølgende transkripsjonen aktivering av gener som utgjør en hypoksi-reagerende element (HRE) i deres promotere, for eksempel VEGF . Imidlertid er VEGF ekspresjon regulering i kreftceller ikke er begrenset til den stressrespons på grunn av det økte volumet av tumormassen. Flere andre faktorer har blitt vist å indusere VEGF, for eksempel reaktive oksygenforbindelser [7] – [9], vekstfaktorer [10], [11], cytokiner [12], og lipid-mediatorer [13] – [16]. Arakidonsyre-avledet prostaglandin (PG) E
2 er en viktig regulator av VEGF-ekspresjon og angiogenese i flere forskjellige krefttyper og i tykktarmskreft i særdeleshet. Eksogene PGE
2 induserer HIF-1α stabilisering [13] og VEGF uttrykk [17] i tykktarm kreft cellelinjer. VEGF og COX-2 ekspresjon og tumor-angiogenese er positivt korrelert i tykktarmskreftprøvene [18] – [20]
er imidlertid hypoksi ikke den eneste ytre stress stimuli som aktiverer cellulære responser i tykktarmskreft.. De stadig skiftende innholdet i tarmlumen utsette normale og kreft epitelceller til et mylder av stimuli. Slike fysiologisk stimulering kan gi signalering for kreft opprykk. Faktisk, forhøyet osmolaritet som er generert under prosessen med colonic vannabsorpsjon og avføring konsolidering [21] – [23] ser ut til å aktivere kolon kreftceller og fremmer COX-2 ekspresjon og PGE
2 generasjon, men aktiverer ikke normal tarm celler [24]. Vårt mål med denne studien var å bestemme virkningen av hyperton stress på VEGF-produksjon ved Caco-2-colon cancer-cellelinje. Den potensielle rolle autokrint PGE
2 og MAPK signalveier i modulering av VEGF generasjonen ble også analysert.
Metoder
Reagenser
Natriumklorid (NaCl) ble erholdt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) og oppløst i sterilt vann til en stamløsning på 2 M konsentrasjon. IBMs internasjonale bruksbetingelser
2-hemmer, Bromoenol lakton (BEL), er CPLA
2 /IPLA
2-hemmer, arachidonyl Trifluoromethyl Ketone (ATK), og prostaglandin E ble kjøpt
2 fra Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, Michigan) og fortynnet i etanol i henhold til produsentens instruksjoner. Inhibitorene for COX-2, NS-398 (Cayman); p38, SB202190; JNK, SP600125; MEK1 /2, ble U0126 (alt fra BIOMOL, Plymouth Meeting, PA) fortynnet i DMSO (Sigma). Monoklonale antistoffer for Immunoblotanalyse assays ble anti-COX-2-IgG mus (klon 33) fra BD Transduction Laboratories og anti-GAPDH (klon 6C5) IgG mus fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), fortynnet til 0,003 ug /ml. Geita HRP-linked sekundært antistoff anti-mus IgG fra Santa Cruz Biotechnology ble brukt på 0,1 mikrogram /ml.
Cell kultur og behandlinger
Caco-2 (ATCC HTB-37, gave Dr. José Morgado Díaz, Instituto Nacional de kreft, Brasil)-cellelinjen ble opprettholdt i Dulbeccos Modified Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 44 mM NaHCO
3, 1 mM NaH
2PO
4.H
2O, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES, MEM vitaminer løsning, MEM essensielle og ikke-essensielle aminosyrer oppløsning, 2 mM L-glutamin, 55 mM β-merkaptoetanol, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle cellekultur reagenser fra Invitrogen). IEC-6 cellelinje (Rio de Janeiro Cell Bank, Brasil) ble opprettholdt i DMEM supplert med 5% FBS og 100 U /mL penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt i kulturflasker (cellevekstoverflateareal 25, 75 og 150 cm
2). Cellene ble samlet inn med 0,25% trypsin og 0,38 g /l EDTA i HBSS uten Ca
++ og Mg
++ og 5 × 10
5 celler /brønn ble belagt i 6-brønners flatbunnede plater (område på 9,03 cm
2 /brønn, Techno plastprodukter, Sveits). 1,9 ml friskt DMEM supplert kulturmedium ble tilsatt til kulturbrønnene, med eller uten farmakologiske inhibitorer og cellene ble inkubert i 15 min (30 min for MAP-kinaser inhibitorer) ved 37 ° C. Alle celler mottok den samme mengde hjelpestoff, derfor, den endelige konsentrasjonen var under 0,1% DMSO eller etanol og modifiserte ikke-celleaktivering. Celler ble stimulert ved tilsetning av 0-100 pl av 2 M NaCl-løsning. DMEM ble tilsatt til brønnen for å fullføre sluttvolum på 2 ml. Osmolaritet av mediet etter tilsetning av 100 mM NaCl var omtrent 540 mOsm, sammenlignet med 367 mOsm av isosmotisk medium. Medium osmolaritet ble empirisk bestemt ved å fryse metoden å bruke en osmometer (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). For å minimere variasjon i kinetiske eksperimenter den totale tiden i kultur etter plating var den samme for hver gang punktet analyseres.
Fastsettelse av PGE
2 og VEGF på supernatanter
PGE
2 produksjon av Caco-2 cellelinje ble bestemt ved EIA i kultur supernatant i henhold til produsentens instruksjoner (Cayman) og som beskrevet tidligere [25]. I korthet, ble kulturmediet samlet 24 timer etter cellulær aktivering av hypertone stress og sentrifugert ved 250 x g i 5 minutter for å fjerne flytende celler og frosset ved -70 ° C. PGE
2-nivåer ble målt ved å bruke et monoklonalt antistoff PGE
2 EIA Kit. Etter utvikling Platen ble avlest ved 405 nm på en plateavleser (Spectra max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). VEGF produksjon av Caco-2 cellelinje ble bestemt ved ELISA i kultur supernatant i henhold til produsentens instruksjoner (R 0,05 i forhold til styre ikke-stimulert gruppe eller hyperton stresset /CoCl
2-stimulert gruppehenholdsvis
Resultater
Hyperton stresset induserer VEGF produksjon av Caco-2 og PGE
2 modulerer angiogene faktor produksjonen i denne miljøstress
Hyperton stresset stimulerer VEGF produksjon av Caco-2 etter 24 timer med aktivisering ( Figur 1A) ved å følge den samme doserespons og tidsforløpet (data ikke vist) av PGE
2 generasjon under de samme stimulerende betingelser [24]. Som PGE
2 har blitt beskrevet å spille en rolle i angiogenese, og VEGF produksjon vi fastslått om PGE
2 ble regulere VEGF produksjon av Caco-2 i løpet av stimuleringen med hypertonisk medium. Inhibiton av PGE
2 produksjon ved behandling med CPLA
2 (ATK) (figur 1B) eller COX-2 (NS-398) hemmere (figur 1C) økt VEGF produksjon. Dette fenomenet ble reversert ved tilsetning av PGE
2 til cellekulturmediet (figur 1D) som indikerer en spesifikk rolle for PGE
2.
(A) Caco-2-celler ble stimulert med 10 -100 mM NaCl under 24 timer før VEGF produksjonsanalyse. VEGF-produksjon ble bestemt ved hjelp av ELISA i supernatanter av Caco-2-celler stimulert med hyperton spenning (100 mM NaCl) i løpet av 24 timer etter forbehandling med inhibitorer av CPLA
2, ATK (B); COX-2, NS-398 (C) eller PGE
2 (D). HCT116-celler ble stimulert med 100 mM NaCl i løpet av 24 timer etter forbehandling med inhibitorer av CPLA
2, ATK (E); COX-2, NS-398 (F). +, *
p 0,05
, til ikke-stimulerte celler eller stimulerte celler, henholdsvis. **
p 0,05
, sammenlignet med NS-398-behandlede celler. Grafsøylene viser gjennomsnitt ± SEM fra triplikatprøvene.
For å verifisere om hemming av VEGF produksjon av Caco-2 stimulert med hyperton stresset var en konsekvens av PGE
2 handling og ikke en konsekvens av nonespecific virkningen av farmakologiske stoffer som brukes i forsøkene, utførte vi det samme eksperiment i HCT116, en tykktarmskreft cellelinje som ikke uttrykker COX-2 og gir ingen påvisbare nivåer av PGE
2 under hypertonisk stress. Vi observerte ikke noen endringer i VEGF produksjon, unntatt muligheten for forstyrrelser av de farmakologiske hemmere (Tall 1E og F). Disse resultatene viste at PGE
2 fremstilt ved Caco-2 aktiveres av hypertone spenning har en autokrin inhiberende virkning på VEGF-produksjon.
EP
2-reseptoren spiller en rolle i reguleringen av VEGF-produksjon gjennom PGE
2 i Caco-2 stimulert med hyperton stresset
for å finne ut hva som er virkningsmekanismen av PGE
2 i reguleringen av VEGF produksjon i hyperton stress, Caco-2 celler ble aktivert med hyperton medium i løpet av 24 timer og behandlet med AH6809, en EP-reseptor-antagonist. Vi bekreftet ved inhibering av EP-reseptorsignalisering forårsaket en økning av VEGF-produksjon (figur 2A). Deretter, for å identifisere hvilken spesifikk reseptor er involvert i fenomenet Caco-2 ble stimulert med hypertonisk medium og behandlet med ATK og EP-reseptorer agonister. Den CPLA
2-hemmer (ATK) fjernet forstyrrelser av PGE
2 produsert av kolon kreftceller og EP-reseptorer ble aktivert bare ved eksogent lagt agonister. Følgelig viser figur 2B at behandling med ATK øker VEGF-produksjon, og når PGE
2 eller 16,16-dimetil PGE
2, en panne EP-reseptoragonist, ble tilsatt til mediet denne effekten ble reversert, forsterkende at EP reseptoraktivering har en hemmende effekt på VEGF-produksjon. Økning i VEGF-produksjon ved inhibering av endogen PGE
2 ble også reversert ved butaprost, et spesifikt EP2-reseptor agonist (figur 2B). Aktivering med EP1, 17-fenyl-Trino-PGE
2, eller EP3, sulproston, agonister hadde ingen effekt på økning VEGF-produksjon. Siden EP4 uttrykk synes å være fraværende i Caco-2 celler [26], våre resultater tyder på at endogen PGE
2 modulerer VEGF produksjon indusert av hyper stress gjennom aktivering av EP2.
(A) Caco-2 cellene ble stimulert med hypertone spenning (100 mM NaCl) i løpet av 24 timer etter forbehandling med EP og DP-reseptorene antagonist, AH 6809 (A); med inhibitor av CPLA
2, ATK (10 mm); PGE
2; EP-reseptorene agonist, 16,16-dimetyl-prostaglandin E
2; EP1 og EP3-reseptorene agonist, 17-fenyl-trinor Prostaglandin E
2; EP2-reseptor-agonist, butaprost og EP3 reseptor-agonist, sulproston (B); eller med PKA-inhibitor, H-89. PGE
2 og dets analoger ble anvendt ved 0,1 pM. VEGF-produksjon ble bestemt ved hjelp av ELISA i supernatanter av Caco-2-celler. +, *
p 0,05
, sammenlignet med ikke-stimulerte celler eller stimulerte celler, henholdsvis. **
p 0,05
, sammenlignet med ATK-behandlede celler. Grafsøylene viser gjennomsnitt ± SEM fra triplikatprøvene.
EP2 er en rhodopsin typen reseptor koplet til Gs og formidler økninger i leiren [27]. Dermed har vi testet om PKA spilt en rolle i PGE
2 effekter mediert gjennom EP2 under hyperton stress. Hemming av PKA av H-89 økte VEGF produksjon av Caco-2 celler eksponert for hyper medium (figur 2C). Armering potensialet hemmende vei som involverer PGE
2-EP2-cAMP-PKA.
Role of endocrine PGE
2 på CoCl
2-indusert VEGF produksjon
Vi har også verifisert om PGE
2 hadde en rolle i reguleringen av VEGF produksjon under en standard simulatory tilstand. For å aktivere Hypoksi-Induced Factor (HIF) sti og simulere hypoksi, ble Caco-2 celler aktiveres med CoCl
2. Etter 24 timers stimulering med CoCl
2, Caco-2 presentert markert produksjon av PGE
2 (figur 3A) og økt ekspresjon av COX-2 (Figur 3B). Ytterligere eksperimenter ble utført etter tilsetning av 1 mM CoCl
2 til mediet etter 24 timer etter aktivering. Videre CoCl
2-stimulert PGE
2 generasjon er avhengig av COX-2 som det ble fullstendig hemmet av NS-398 (figur 3C).
Caco-2 celler ble stimulert med 0.1- 1 mM CoCl
2 i løpet av 24 timer før PGE
2 og VEGF produksjon (A og D, henholdsvis) og COX-2-proteinet uttrykket (B) analyse. PGE
2 og VEGF produksjon av Caco-2-celler stimulert med 1 mM CoCl
2 i løpet av 24 timer etter forbehandling med inhibitor av COX-2, NS-398 (C og E, respektivt). VEGF produksjon av Caco-2-celler stimulert med 0,1-1 mM CoCl
2 i løpet av 24 timer (D). PGE
2 og VEGF produksjon ble bestemt ved ELISA i supernatanter av Caco-2 celler. COX-2 og GAPDH ekspresjon i cellepelletene ble analysert ved Western blotting. +, *
p 0,05
, sammenlignet med ikke-stimulerte celler eller stimulerte celler, henholdsvis. Grafsøylene viser gjennomsnitt ± SEM fra triplikatprøvene.
I likhet med hyperton stresset stimulering, CoCl
2-aktivert celle også produsert VEGF (figur 3D). Men autokrint PGE
2 ser ut til å ha en motsatt effekt i denne tilstanden da NS-398 behandling hemmet VEGF produksjon (Figur 3E). Disse resultatene tyder på at PGE
2 har en stimulerende autokrint rolle på VEGF produksjon i CoCl
2 aktivering.
Rolle MAPKs i VEGF produksjon av Caco-2 celler
For å finne ut hvis VEGF produksjonen ble forskjellig regulert i Caco-2 celler utover potensialet autokrint rolle PGE
2, snudde vi til identifisering av MAPK veier involvert. Siden vi har vist før en rolle for ERK 1/2, JNK og p38 i PGE
2 generasjon [24], og for å unngå potensielle problemer dette kan medføre for å tolke resultatene, ble eksperimenter utført i nærvær av 1 uM av NS-398. Farmakologisk hemning av ERK 1/2 og p38 trasé indikerte en felles rolle i aktivering av enten hypertone stress eller CoCl
2 (figurene 4A og B). JNK rolle var mer begrenset, som SP 600125 markert hemmet VEGF produksjon indusert av CoCl
2 aktivisering mens det ikke påvirke VEGF produksjon indusert av hyperspenning (4A og B).
hemmere av JNK, SP600125 ; p38, SB202190; og MEK 1/2, U0126 ble tilsatt før stimulering med hyperton spenning (100 mM NaCl) (A) eller 1 mM CoCl
2 (B) i 24 timer. Caco-2-celler ble forbehandlet med 1 uM av NS-398 for å hindre at endogen PGE
2 produksjon i alle prøver. VEGF-produksjon ble bestemt ved hjelp av ELISA i supernatanter av Caco-2-celler. +, *
p 0,05
, sammenlignet med ikke-stimulerte celler eller stimulerte celler, henholdsvis. Grafsøylene viser gjennomsnitt ± SEM fra triplikatprøvene.
Diskusjoner
Rollen PGE
2 i kreftutvikling er vanligvis beskrevet som en autokrin faktor stand til å modulere mange aspekter av kreftcellebiologi, spesielt av epitelisk opprinnelse [28], [29]. PGE
2 har vist seg å øke spredning, metastatisk kapasitet og produksjonen av pro-angiogene faktorer [17], [30], [31]. Men slike undersøkelser vanligvis manglende informasjon om de stimuli som vil drive arachidonsyrekaskaden og til slutt PGE
2 generasjon utover indusert ekspresjon av COX-2. Vi har nylig vist at en hyperosmotisk miljø kan indusere COX-2 uttrykk og PGE
2 generasjon i Caco-2 tykktarmskreftceller [24]. Først og fremst kan hyperosmolaritet utløse begrensende trinnet i PGE
2 generering ved å aktivere CPLA
2-α og indusere frigivelse av fri arachidonsyre. Normale intestinale epitelceller viste ingen produksjon av PGE
2 under samme hyperosmotisk stimulus. Etter å ha identifisert et relevant fysiologisk stimulans for tykktarmskreftceller, undersøkte vi effekten av hypertonisk medium på fremstilling av de store pro-angiogene faktor, VEGF, og potensialet autokrine påvirkning av PGE
2.
Eksponering av Caco-2 celler til hyper medium førte til en betydelig produksjon av VEGF. Som vist før denne VEGF produksjon skjedd parallelt med PGE
2 generasjon. PGE
2 er beskrevet som en potent induser av VEGF basert på eksperimenter hvor COX-2 overekspresjon økte VEGF produksjon av tykktarm og brystkreft cellelinjer. Videre ble dette VEGF produksjon hemmet av selektive COX-2-hemmere. Vi søkte derfor å undersøke autokrint påvirkning av PGE
2 generasjon på Caco-2 celler stimulert av hyperton medium. Overraskende, hemming av enten CPLA
2 eller COX-2, med ATK eller NS-398 henholdsvis, noe som ytterligere øker produksjonen av VEGF. Denne effekten kan tilskrives inhibering av PGE
2 generasjon som restaurering av PGE
to nivåer ved tilsetning eksogent tilbakestilt VEGF produksjon til det opprinnelige nivå i ATK behandlet Caco-2-celler. HCT116-celler kan også aktiveres ved hypertone medium for å fremstille VEGF. Imidlertid HCT116-celler verken uttrykke COX-2 og heller ikke fremstille PGE
2 [31] til tross for at cellene er aktivert eller ikke. Dermed mangel på effekten av ATK og NS-398 på HCT116 utelukker eventuelle off target effektene av disse hemmere [32].
PGE
2 virker på en gruppe av G-protein-koblede reseptorer ( GPCR). Det er fire GPCRs reagerer på PGE
2 utpekte subtyper EP1, EP2, EP3 og EP4, som fører til tydelig signalveien og generell biologisk effekt [27]. For å bestemme avhengigheten av PGE
2 autokrine effekter på signalisering EP, anvendte vi en ikke-spesifikk antagonist av alle fire EP-reseptorer, AH 6809. Behandlingen med AH 6809 lignet effekten av inhibering av VEGF-produksjon av PGE
2, indikerer at PGE
2 signaler gjennom sine plasmamembranreseptorer å nedregulere VEGF produksjon indusert av hyperton medium. Den spesielle undertype er involvert synes å være EP2 som sin selektive agonist, Butaprost, er i stand til fullt ut erstatte PGE
2. På motsatt, verken EP1 heller ikke EP3 agonister behandlinger presentert av den hemmende virkning på VEGF-produksjon. EP2 synes å par med økt cAMP-nivåer og etterfølgende aktivering av PKA, som hemming av PKA ved H-89 reproduserer effekten av inhibering av PGE
2 generasjon eller handling. Det er viktig å bemerke at forsøkene ble utført med PGE
2 og dets analoger i konsentrasjoner som var forenlige med endogent produserte nivåer. Effekter i VEGF-produksjon etter kolon kreftcellene har blitt tilskrevet PGE
2 under anvendelse av konsentrasjoner opp til 100 uM [13] hva som langt overstiger mengden av PGE
2 faktisk nødvendig for å aktivere dets reseptorer [27], eller hva som er produsert i tumormassen [33].
det er blitt vist at aktiveringen av EP2-cAMP-PKA-GSK-3-signalveien fører til reduksjon av p-catenin fosforylering, slik at dens translokasjon og aktivering TCF /Lef avhengig-transkripsjon (for en oversikt, se [34]) av gener involvert i kreft, slik som COX-2 og VEGF. Men i vår modell av hyperton stress, fører EP2 signalveien aktivering undertrykkelse av VEGF produksjon. For bedre å forstå reguleringen av denne bane i den hypertoniske spenning vi har undersøkt rollen som GSK-3-tommer denne aktivering ved bruk av SB216763, en konkurrerende GSK-3 α og β inhibitor (50-5000 nM, data ikke vist). Behandlingen øket VEGF-produksjon, noe som indikerer at den inhiberende effekt av EP2 på den angiogene faktor produksjonen er ikke avhengig av denne kinase. En mulighet for den distinkte effekten av EP2 aktivering i hyperton stress er at denne reguleringen skjer via cAMP. Noen studier har vist cAMP kan hemme produksjonen av cytokiner ved inhibering av Ras-avhengige signaler ved PKA, inaktive MEK /ERK-signalisering, eller ved å blokkere fosforylering av p38 MAPK [35] – [37]. Som ERK /p38 MAPK veien er involvert i vår modell indusere VEGF produksjon, kan slike funn være en indikasjon på den mekanismen som EP2 signale blokkerer VEGF produksjon i hyperton stress.
For å finne ut om den hemmende rolle PGE
2 kan utvides til andre stimuli, vi brukte CoCl
2 for å indusere HIF-1α stabilisering og mimick responsen på hypoksi [13]. Som vist for hyperstimulering, CoCl
2 indusert PGE
2 generasjon var avhengig av COX-2. PGE
2 generasjonen ble også stadig av VEGF produksjon. Induksjon av VEGF produksjon av CoCl
2 har blitt vist før i humane fibroblaster [38], kreft cellelinje lunge [39], hinnen epitel [40], gliom cellelinjer [41], prostatakreft cellelinjer [42] og i astrocytter [43], men det var ingen forsøk på å undersøke potensialet produksjon av PGE
2 eller dets autokrine effekter. Inhibering av COX-2 inhiberte VEGF-produksjon indusert av CoCl
2, noe som indikerer en stimulerende rolle for PGE
2 og at den autokrine virkningen av PGE
2 er avhengig av typen av stimuli benyttes.
Hyper medium induserer aktivering av flere MAP-kinaser som kan være involvert i regulering av VEGF-ekspresjon [24]. Siden disse MAP kinaser er også involvert i å stimulere CPLA
2-α aktivitet og produksjon av PGE
2, eliminert vi den hemmende effekten av PGE
2 før du prøver å analysere sin rolle på VEGF produksjon. Caco-2-celler aktiveres ved hypertone medium i nærvær av NS-398 viser klart en markert avhengighet av p38 og i mindre grad på ERK 1/2 for å produsere VEGF. CoCl
2-indusert VEGF produksjon av Caco-2-celler viste lignende følsomhetsprofilen til MAP kinase-inhibitorer, med unntak av en markert reduksjon av JNK-inhibitor. De forskjellige roller for JNK veien tyder på at forskjeller i hyperton medium og CoCl
2-indusert produksjon av VEGF gå utover følsomhet for autokrint hemmende effekter av PGE
2. Det er for tiden under etterforskning dersom slike signalforskjeller kan være ansvarlig for de ulike effektene av PGE
2 på hver type stimuli.
Et av kjennetegnene i dagens modell for regulering av angiogenese i svulsten masse, spesielt i tykktarmskreft, er regulering av endotelial cellefunksjonen av kreftcellene. Følgelig, er rollen til PGE
2 i angiogenese begrenset til en autokrin stimulering av pro-angiogene faktorer produksjon av tumorcellen. Selv interessant, denne modellen verken omfatter de mulige eksterne stimuli som er involvert i COX-2 og VEGF-produksjon eller situasjoner der den celle som uttrykker COX-2 og produserende PGE
2 er annet enn kreftcellen. For eksempel, ektopisk vekst av HCT116 og HT29, celler som ikke uttrykker COX-2 eller produsere PGE
2, er avhengig av COX-2 ekspresjon av endoteliale og stromale celler [44]. COX-2 uttrykk i musemodeller av familiær adenomatøs polypose,
Min product: [33], [44] og Apc
Δ716 [45] mus, er begrenset til stromal og interstitielle celler. Forskjeller i avhengighet JNK og autokrin PGE
2 hemmende virkning på VEGF-produksjon av den samme tykktarmskreft cellelinje er en klar indikasjon på hvordan modellen må også ta hensyn til at disse cellene er utsatt for ulike microenvironmental stimuli.
takk
forfatterne ønsker å takke dr Karen A. Bell for hennes kommentarer til manuskriptet.
