Abstract
Bakgrunn
mirnas kan være potensielt nyttige biomarkører for prediksjon av respons på kjemoterapi, strålebehandling og overlevelse . Målet med denne retrospektive studien var å validere miRNA respons prediktorer i en kohort av pasienter med gastroøsofageal kreft for å forutsi total overlevelse (OS) og sykdomsspesifikk overlevelse (DSS).
Materiale og metode
studie~~POS=TRUNC omfattet 53 pasienter behandlet med kurativ hensikt for lokoregionalt gastroøsofageal kreft. miRNA uttrykket ble kvantifisert fra pre-terapeutiske og diagnostiske, formalinfiksert, parafininnebygd vevsprøver ved hjelp av Affymetrix Genechip miRNA 1,0 Array. Basert på vekst inhibering av NCI60 panel i nærvær av cisplatin, epirubicine og kapecitabin, ble en miRNA basert reaksjon prediktor utviklet. Den Cox modellen ble brukt for å vurdere korrelasjoner av responsen prediktor med OS og DSS.
Resultater
En univariat analyse viste en statistisk signifikant forbedring av OS for pasienter som hadde gjennomgått kirurgisk reseksjon med prediksjon score over medianen prediksjon score (HR: 0,41 (95% KI:. 0,17 til 0,96) Justert for kirurgi og scene, var dette prediktor identifisert til å være uavhengig assosiert med både OS (HR: 0,37 (95% CI: 0.16- 0,87)) og DSS (HR:. 0,32 (0,12 til 0,87))
Konklusjon
miRNA profil prediktiv for følsomhet for cisplatin, epirubicine og kapecitabin viste seg å være uavhengig assosiert med OS og DSS hos pasienter med gastroøsofageal kreft
Citation:.. Winther M, Knudsen S, Dahlgaard J, Jensen T, Hansen A, Jensen PB, et al (2016) kliniske betydningen av en roman mikroRNA Chemo-følsomhet Predictor i . gastroøsofageal Cancer PLoS ONE 11 (2):. e0148070 doi: 10,1371 /journal.pone.0148070
redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES
mottatt: 8 oktober 2015; Godkjent: 12 januar 2016; Publisert: 17 februar 2016
Copyright: © 2016 Winther et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All mikroRNA datafiler er tilgjengelig fra Gene Expression Omnibus database. DOI å finne disse dataene vil bli lagt ut i kommentarfeltet til denne artikkelen
Finansiering: Studien ble finansiert av den danske Kreftforeningen, cirro – The Lundbeck Stiftelsen Senter for Intervensjons Research in Radiation Oncology og den danske. Rådet for strategisk forskning, Karen A. Tolstrups Fond, AP Moeller Foundation for Advancement of Medical Science og Dansk Kraeftforsknings Fond
konkurrerende interesser:. forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesser: SK , PBJ, JD, TJ og AH erklære tidligere eller nåværende primære arbeid eller eierskap i medisinsk Prognose Institute som har et potensial til å dra nytte av disse resultatene. Medisinsk Prognose Institute har en patentsøknad på emnet (WO2011135459: Metoder og enheter for å identifisere biomarkører for behandlingsrespons og bruke disse til å forutsi behandlingseffekt). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
kjemo- og stråleterapi er viktige terapeutiske strategier for kreftbehandling. Men på grunn av indre eller ervervet behandling motstand, kjemo- og stråleterapi mislykkes i å eliminere alle tumorceller [1]. I tillegg er respons på den samme behandling ofte kontrast hos pasienter med tilsynelatende identiske kreft og for pasienter som ikke responderer på behandling, kan den tid som går tapt være ugjenkallelig skadelig.
Precision medisin er en lovende metode for forbedring av behandlingsrespons og overlevelse, tar hensyn til genetisk variasjon i tillegg til variasjon i genuttrykk. Derfor, identifisering av biomarkører prediktive for respons på kjemoterapi og strålebehandling er av stor klinisk verdi. I klinisk kreftforskning, microRNAs (mirnas) er biomarkører med et betydelig potensial på grunn av både vev-spesifisitet og avvikende uttrykk i tumorceller [2]. mirnas er små, endogene, ikke-kodende RNA som fungerer som posttranskripsjonelt regulatorer, målretting mRNA for degradering eller translasjonsforskning undertrykkelse [3]. De er involvert i regulering av en rekke biologiske prosesser, inkludert tumor genese, som virker som tumor-suppressorer eller onkogener [3,4].
I tillegg har miRNA ekspresjonsanalyse blitt vist å være assosiert med tumorprogresjon og respons til terapi, som tyder på deres anvendelse som prognostiske og prediktive biomarkører samt deres viktig rolle i reguleringen av medikamentsensitivitet [5,6]. Identifisering av miRNAs prediktiv for behandlingsrespons tilbyr en svært lovende mulighet til direkte kliniske avgjørelser for valg av behandling og forbedre utfallet av sykdommen.
I denne retrospektive studien av pasienter med gastroøsofageal kreft, en roman bioinformatiske tilnærming har blitt påført . Basert på veksthemming av 60 humane cancercellelinjer (NCI60) som utsettes for cisplatin, epirubicine og kapecitabin, i tillegg til grunnlinjen miRNA ekspresjon av de 60 cellelinjer, en miRNA basert respons prediktor til de tre kjemoterapeutiske midler ble utviklet. Målet med denne studien var å validere responsen prediktor hos pasienter med lokoregionalt gastroøsofageal kreft behandles med kurativ hensikt for å forutsi utfallet i form av total overlevelse og sykdomsspesifikk overlevelse.
Materialer og metoder
pasienter
studie~~POS=TRUNC besto av 53 pasienter med diagnosen lokoregionalt gastroøsofageal kreft (gastro-øsofageal krysset kreft (GEJ) eller magekreft (GC)) med tilgjengelig pre-terapeutisk og diagnostisk, formalin -Fast, parafin innebygd (FFPE) vevsprøver med tilstrekkelig materiale for miRNA microarray analyse (minst 400 ng total RNA). Alle pasientene ble diagnostisert med lokoregionalt gastroøsofageal kreft i perioden 2009-2012 og behandlet med kurativ hensikt ved Institutt for Oncology, Aarhus universitetssykehus, Danmark. Klinisk-patologisk parametre ble hentet fra medisinske poster og patologi rapporter. Bare TNM-etapper var tilgjengelige fra medisinske poster og dermed pasientene ble retrospektivt iscenesatt av forfatterne i henhold til femte-syvende utgaver av AJCC /UICC iscenesettelse retningslinjer. Studien ble godkjent av Region Midtjylland komiteer på helsefaglig forskningsetikk og det danske Datatilsynet og ble gjennomført i henhold til Helsinki deklarasjonen. Dispensasjon fra anskaffelse av informert samtykke fra pasientene i studiepopulasjonen ble gitt av Region Midtjylland komiteer på helsefaglig forskningsetikk som studien ville man ikke fremkalle noen helserisiko eller ville være til noen byrde for deltakerne. Pasientinformasjon ble anonymisert og avidentifisert før analysen.
Alle pasientene hadde blitt behandlet med perioperativ kjemoterapi med cisplatin, epirubicine og kapecitabin. Ikke alle pasienter fikk full dose cellegift. En miRNA prediktor-profil, korrelert til behandling følsomhet i NCI60 av de tre kjemoterapeutiske midler, ble utviklet. Baseline pasient- og kreftegenskaper er oppført i tabell 1.
RNA isolering og kvantifisering av miRNA
Total RNA ble ekstrahert fra fem sammenhengende slides av 12 mikrometer FFPE forbehandling tumorsnitt hjelp den RecoverAll
™ Total nukleinsyreisolering Kit for FFPE (Ambion, Inc., 2130 Woodward St. Austin, TX) i henhold til produsentens protokoll. Verifikasjon av invasiv carcinoma in haematoxylin og eosin farget FFPE- lysbilder ble utført av en erfaren patolog (TT). Den midlere fraksjon av tumorområdet (definert som arealet av invasivt karsinom) ble beregnet til 57% (område: 5-100). Kvantifisering av total RNA ble utført ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Nanodrop Technology, Wilmington, Del). miRNA ble merket ved hjelp FlashTag
™ HSR Biotin RNA Merking Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) og hybridisert til Genechip miRNA versjon 1.0 mikromatriser (Affymetrix, Santa Clara, CA) ifølge manufactorer detaljer. Arrays ble vasket og farget på Affymetrix lufthåndtering Station 450X og skannes på Affymetrix G7 scanner i henhold til produsentens instruksjoner. Normalisering av miRNA microarray data ble utført i R ved hjelp av Robust Multi-matrise Average (RMA). Alle mirnas målbar i alle 53 pasienttumorprøver.
Predictor utvikling basert på in vitro-analysen
For å vurdere sammenhengen mellom miRNA uttrykk og narkotika følsomhet, veksthemming (GI50) vektorer av 60 celle linjer utsatt for cisplatin, epirubicine og kapecitabin ble lastet ned fra DTP nettsted. Sammenheng mellom miRNA uttrykk og narkotika følsomhet ble beregnet for hvert miRNA-medikamentkombinasjon. MicroRNAs med en korrelasjons ovenfor 0,25 (positivt korrelert mirnas) eller under -0,25 (negativt korrelert mirnas) ble beholdt for hver behandling (tabell S1), og deretter kombinert for å forutsi respons på kombinasjonsbehandling. Derfor ble en miRNA respons profil utviklet som uttrykk nivåer ble korrelert til følsomheten av cisplatin, epirubicine og kapecitabin.
Prediksjon av chemo-følsomhet i kliniske prøver
Den normaliserte uttrykk for hver miRNA i et svar profilen ble brukt til å forutsi følsomheten ved å snu miRNA uttrykket nivåer i en enkelt prediksjon poengsum. Derfor for hver pasient, følsomhet for den mottatte behandlingsstrategi ble beregnet som differansen mellom gjennomsnittlig positivt korrelert miRNAs og gjennomsnittlig negativt korrelert mirnas: Tippe poengsum = mean (positivt korrelert mirnas) -mean (negativt korrelert miRNAs). Hver miRNA i profilen ble gitt lik vekt. Deretter ble forutsigelse stillingen normalisert til en skala fra 0 til 100 av en lineær transformasjon av prediksjon score på alle pasientprøver; en poengsum på null ment minst sensitiv og en poengsum på 100 betydd mest følsomme for gitt behandling. For hver pasient ble det en score på spådd følsomhet for den mottatte behandlingsstrategi beregnet.
statistikker
En Statistisk analyse plan, med forhåndsbestemte suksesskriterier, ble utført før oppstart av studien. Resultatet av behandlingen følsomhet for hver pasient ble spådd før avblinding av de kliniske data. Det primære resultatet var total overlevelse (OS), definert som tidsintervallet fra diagnostisering av gastroøsofageal kreft til død uansett årsak eller siste oppfølging (11 august
th 2014) og den sekundære utfall sykdomsspesifikk overlevelse, definert som tiden fra diagnose til død av eller med gastroesoophageal kreft eller siste dagen av oppfølging (11 august
th 2014).
Survival-analyser ble utført ved dichotomizing de prediksjon score ved hjelp av median poengsum som en avskåret. Pasientene ble forutsagt følsomme ovenfor avskåret og bestandig under eller lik avskåret. Estimert overlevelse ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med univariate Cox modell for å vurdere sammenhengen mellom prediksjon score og OS eller DSS. Forutsetningen om proporsjonale farer ble bekreftet med log-minus-log plott og Schoenfeld er rester. Multivariate analyser ble utført for å korrigere for forhold av antatt prognostisk betydning. Hazard ratio (HR) for både uni- og multivariate analysene er presentert på 3 år med 95% konfidensintervall (KI). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Stata, versjon 12 (StataCorp, College Station, TX, USA).
Resultater
Outcome analyse
Median oppfølgingstid for alle pasienter var 23 måneder (variasjon: 4-54 måneder) og 1- års OS rente var 79% (95% CI: 66-88) og 3-års OS sats 44% (95% CI: 30-58). På tidspunktet for evalueringen, hadde 30 pasienter (57%) døde hvorav 24 pasienter hadde dødd av primær kreft. Radiografisk respons ble observert i 30 pasienter (60%) blant 50 pasienter med tilgjengelige behandling evaluerings CT-skanner. Ingen pasienter fått patologisk komplett respons (definert som ingen bevis for vitale resttumorceller igjen i de resected prøven etter neoadjuvant kjemoterapi). Baseline pasient- og kreftegenskaper er oppført i tabell 1.
Association mellom spådd følsomhet og overlevelse
Bruke NCI60 cellelinje panel, følsomhet overfor cisplatin, epirubicine og kapecitabin ble korrelert til grunnlinjen miRNA uttrykk for 1756 humane mirnas og andre små nukleolære RNA-er i de samme cellelinjer. Begge mirnas være positivt korrelert og negativt korrelert med hver av de tre kjemoterapeutika ble identifisert. I S1 tabell, blir mirnas brukes til å forutsi respons oppført. Ved bruk av diagnostiske og pre-terapeutiske FFPE tumorprøver fra studiepopulasjonen, ble miRNA uttrykket nivåer målt. For å kunne forutsi følsomheten, ble miRNA ekspresjonsnivåer av responsprofilen omgjort til en enkelt prediksjon score på en skala fra null til 100, som beskrevet tidligere. En score på null representert lav følsomhet og en poengsum på 100 høy følsomhet
Når stratifisert ved median prediksjon score, trender mot økt OS (HR: 0,53 (95% KI: 0,25 til 1,14)). Og DSS ( HR: 0,57 (95% KI: 0,24 til 1,34)) ble vist for pasienter med prediksjon score over medianen. Kirurgi er hjørnesteinen i denne behandlingsstrategi og ytterligere analyse av kun de pasienter som hadde gjennomgått kirurgisk reseksjon (N = 49) viste en signifikant forbedring av OS (HR: 0,41 (95% KI: 0,17 til 0,96)) og en border betydelig forbedret DSS (HR: 0,40 (95% KI: 0,15 til 1,08)). for pasienter med prediksjon score over median, fig 1.
Tips score er dikotomisert ved median poengsum
i en multivariat analyse ble prediksjon poengsum identifisert til å være en uavhengig prognostisk markør for både OS (HR: 0,37 (95% KI: 0,16 til 0,87)) og DSS (HR: 0,32 (0,12 til 0,87)) etter justering for kirurgi og stadium, Tabell 2.
Diskusjoner
Gastroøsofageal kreft er maligniteter med dårlige responsrater til standard behandlingsregimer, noe som resulterer i en 5-års overlevelse rate på bare 15-25% [ ,,,0],7,8]. mirnas kan være potensielt nyttige biomarkører for prediksjon av respons på kjemoterapi. I denne studien ble en miRNA profil prediktiv for følsomhet for cisplatin, epirubicine og kapecitabin utviklet i 53 pasienter med gastroøsofageal kreft. En univariat analyse inkludert bare pasienter som hadde gjennomgått kirurgisk fjerning viste en statistisk signifikant forbedring av OS for pasienter med prediksjon score over avskåret. I tillegg er en multivariat analyse identifisert prediksjon poengsum som selvstendig korrelert med både OS og DSS. Denne lovende resultat er oppmuntrende og et nytt, større prospektive studier er nødvendig for å validere den potensielle kliniske nytten av prediktor.
Utviklingen av miRNA Predictor profilene var basert på en roman bioinformatiske tilnærming, er tidligere publisert på diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) [9]. Bruke NCI60 panel ble to miRNA profiler utviklet som uttrykket nivåer korrelerte med følsomhet for kombinasjonsbehandlinger CHOP (cyklofosfamid, doxorubicin, vinkristin og prednison) og CHOEP (cyklofosfamid, doxorubicin, vinkristin, etoposid og prednison). I denne studien, miRNA profiler vellykket spådd respons på behandling hos pasienter med DLBCL.
Capecitabine er et prodrug som er enzymatisk konvertert til 5-fluorouracil i kroppen.
in vitro
avledet svarprofiler for de to stoffene har både overlappinger og forskjeller. I denne studien brukte vi den respektive
in vitro
profil for de respektive stoffet som brukes i klinikken.
Prediction of respons på kombinasjonsbehandling ble utført ved å kombinere prediktorer for enkelte legemidler. For en vellykket prediksjon av respons, ble profiler for cisplatin, epirubicine og kapecitabin kombinert. Når du analyserer de enkelte prediktorer i en multivariat analyse, cisplatin og epirubicine prediktorer bidro mest, mens kapecitabin prediktor bidratt minst (data ikke vist).
Therapy svikt er viden observert i klinisk setting på grunn av enten indre eller ervervet resistens mot kjemoterapi eller strålebehandling. mirnas har vist seg å spille en viktig rolle i reguleringen av medikamentet og strålesensitivitet på gastroøsofageal kreft. I spiserørskreft, Hamano et al rapporterte at overekspresjon av MIR-200c var signifikant korrelert med dårlig respons på cisplatin-basert kjemoterapi, potensielt gjennom oppregulering av Akt-pathway (PPP2R1B) [10] og Tanaka et al viste at høy pre -rensing uttrykk nivåer av MIR-200c i serum ble signifikant assosiert med nedsatt respons på cisplatin-basert kjemoterapi [11]. I magekreftcellene, men overekspresjon av MIR-200c har blitt korrelert med redusert tumorvekst og migrasjon [12], i tillegg til forbedret følsomhet cisplatin [13]. Disse motstridende resultater indikerer de ulike konsekvensene av MIR-200c i ulike krefttyper. I denne studien ble MIR-200c inkludert som prediktor for responsen på epirubicine (negativt korrelert).
I likhet med miRNA respons profilen til denne studien, flere andre studier har identifisert mirnas å bli assosiert med kjemoterapeutisk effekt i gastroøsofageal kreft. For eksempel, HSA-la-7c er blitt vist å være assosiert med prognose og for å være en markør for følsomhet overfor cisplatin gjennom regulering av IL-6 /STAT3 vei hos pasienter med kreft i spiserøret [14] og MIR-141 har vært funnet å utøve anti-apoptotiske virkninger som overfører cisplatin motstand i øsofagus kreftcellelinjer, eventuelt gjennom nedregulering av YAP1 [15]. I denne studien har-la-7c var negativt korrelert med kapecitabin og MIR-141 var negativt korrelert med epirubicine. I en annen studie ble forbehandling MIR-505-stjerne og Mir-99b vist seg å være signifikant korrelert med patologisk respons hos pasienter med spiserørs adenokarsinom [16]. I denne studien ble MIR-505-stjerners negativt korrelert med kapecitabin og Mir-99b negativt korrelert med kapecitabin og epirubicine.
I konklusjonen, miRNA profilen prediktiv for følsomhet for cisplatin, epirubicine og kapecitabin ble vist til være uavhengig assosiert med OS og DSS hos pasienter med gastroøsofageal kreft. Denne lovende resultat er oppmuntrende og et nytt, større prospektiv studie er garantert for å validere den potensielle kliniske nytten av prediktor.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Lister over microRNAs for alle narkotika og kombinasjons prediktorer brukt.
For hver behandling listen over Affymetrix probesets på miRNA versjon 1.0 matrise vises med Affymetrix ID. Probesets vist i roman er positivt korrelert, probesets vist i kursiv er negativt korrelert. For kombinasjonsbehandlinger, er individuelle profiler kombinert
doi:. 10,1371 /journal.pone.0148070.s001 plakater (docx)
bekreftelser
Forfatterne takker Mogens Jons Johannsen for utmerket Teknisk assistanse. Studien ble finansiert av den danske Kreftforeningen, cirro-The Lundbeck Stiftelsen Senter for Intervensjons Research in Radiation Oncology og den danske Rådet for strategisk forskning, Karen A. Tolstrups Fond, AP Moeller Foundation for Advancement of Medical Science og Dansk Kraeftforsknings Fond.
