Abstract
Høyere Lin28 uttrykket er assosiert med dårligere patologiske tumorrespons i lokalt fremskreden ventrikkelcancer pasienter som gjennomgår neoadjuvant kjemoterapi. Men egenskapene til Lin28 og virkningsmekanismen i kjemoterapi motstanden er fortsatt uklart. I denne studien fant vi at transfeksjon av Lin28 i mage kreftceller (MKN45 og MKN28) økte sin motstand mot chemo-narkotika oksaliplatin (OXA), paclitaxel (PTX), doxorubicin (ADM), og fluorouracil (5-FU) sammenlignet med gastrisk kreft celler transfektert med en kontrollvektor. Når knockdown Lin28 uttrykk ved Lin28 små interfererende RNA (siRNA) ble evaluert in vitro, fant vi at motstanden mot chemo-legemidler ble redusert. Videre fant vi at Lin28 opp-regulerer C-myc og P-gp og nedregulerer Cylin D1. Til slutt fant vi at MIR-107 er et mål mikroRNA av Lin28 og at den deltar i mekanismen av kjemoterapi motstand. Våre resultater tyder på at Lin28 /MIR-107 veien kan være en av mange signalveier er regulert av Lin28 og forbundet med magekreft chemo-motstand
Citation. Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J et al. (2015) Overuttrykte av Lin28 Reduserer kjemosensitivitet av Gastric kreftceller til å oksaliplatin, Paclitaxel, doxorubicin, og Fluorouracil i del via mikroRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10,1371 /journal.pone.0143716
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 23 juni 2015; Godkjent: 08.11.2015; Publisert: 04.12.2015
Copyright: © 2015 Teng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støtte ble gitt av Natural Science Foundation Zhejiang Provincial fra KINA: LQ13H160014 [https://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en vanlig klinisk fordøyelsessystemet ondartet svulst med en dødelighet som rangerer tredje i verden [1]. Vårt land er et område som er utsatt for magekreft. I de senere år har neo-adjuvant kjemoterapi blitt administrert til magekreftpasienter for å forlenge overlevelse. Likevel er det 5-års overlevelse for de med avansert magekreft fortsatt lavere enn 30% [2]. Kjemoterapi motstand er den ledende årsaken til svikt i magekreft og andre kreftbehandlinger. Derfor er mekanismen for kjemoterapi motstand av magekreft er i dag et stort problem i magekreft studier.
Lin28 er et sterkt konservert RNA-bindende protein som har blitt vist å delta i indusering av pluripotente stamceller og i å opprettholde stammen celle-liknende celler i kreft. Nyere studier har rapportert at avvikende aktivering av Lin28 korrelerer godt med prognosen av forskjellige kreftformer, inkludert bryst, ovarie, lunge, kolon, og leverkreft [3-6]. Vår tidligere studie viste at Lin28 uttrykket er også assosiert med dårlig overlevelse i magekreftpasienter [7], og en annen undersøkelse viste at ekspresjon av Lin28 er korrelert med paclitaxel motstand i humane brystcancerceller [8]. Videre er Lin28 uttrykk assosiert med patologisk tumorrespons i lokalt fremskreden ventrikkelcancer pasienter som gjennomgår neo-adjuvant kjemoterapi. Men den molekylære mekanismen bak disse funnene er uklar [9].
Lin28 fremmer tumordannelse ved å undertrykke tumorsuppressorgener mirnas eksempel la-7-familien, som er forbundet med medikamentresistens [8]. Men som et mål miRNA av Lin28, MIR-107 er sjelden nevnt som en legemiddelresistens faktor i magekreft. MiR-107 uttrykk er redusert i en rekke forskjellige maligniteter, for eksempel tykktarmskreft, hode- og halskreft, bukspyttkjertelkreft og magekreft [10-13]. MiR-107 regulerer nedstrøms gener som er involvert i celledifferensiering og proliferasjon, metabolisme, stressreaksjoner og dannelse av blodkar [10-14]. I denne studien undersøkte vi Lin28 /MIR-107 veien og dens rolle i magekreft celle motstand mot cellegift. Vi kan ha identifisert en ny potensielt mål for kjemoterapiresistent magekreft.
Materialer og metoder
1. Cellekultur og plasmid transfeksjon
Den menneskelige magekreft cellelinjer MKN-28 og MKN-45 ble oppnådd som en gave fra professor Sung Hoon Noh (Yonsei University School of Medicine, Seoul, Korea). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C. Oksaliplatin, paclitaxel, doxorubicin, og fluorouracil ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Plasmidet pcDNA3.1-Lin28 ble transfektert med Xtreme GENE HP DNA Transfeksjon Reagens (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Stabile Lin28-uttrykkende kloner ble ytterligere selektert og dyrket med det passende neomycin-inneholdende RPMI 1640 medium.
2. Real-time kvantitativ PCR
Sanntids q-PCR-analyser ble utført med ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I korthet ble en 20 pl reaksjonsblanding inneholdende 2 pl av cDNA templat og 1 pl av hver av sense og anti-sense primere (Promega Gotaq q-PCR® Master Mix system, Madison, WI, USA) amplifisert som følger: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter og 40 sykluser av 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 40 sek. Sanntids q-PCR-reaksjoner ble utført i triplikat for hver prøve, og den midlere verdi ble benyttet for å beregne mRNA-nivåer. Kvantitative analyser ble utført ved anvendelse av den komparative CT-metoden. De Lin28 og MIR-107 kopiantall i tumorvev ble normalisert til mRNA kopiere numre av husholdningsgenet glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) for å få verdien 2
-Δ CT. Primersekvensene er som følger i tabell 1.
3. Celle Legemiddelresistens Assay
Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid] assay (Amresco, Solon, OH, USA) henhold til produsentens protokoll. Celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 5 * 10
3-celler per brønn. Etter behandling ble cellene inkubert med 5 mg /ml MTT i 4 timer. Deretter ble mediet fjernet og 150 ml sterilisert DMSO-oppløsning ble tilsatt, etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 4 timer. OD-verdien ble oppnådd ved bølgelengder 570 nm og 630 nm. OD verdien (570 nm til 630 nm), kan indirekte reflekterer det cellenummer og aktivitet i henhold til følgende formel: overlevelsesrate = dosert gruppe OD570-630 /ingen dosegruppe OD570-630. En celle overlevelse /medikamentkonsentrasjonen kurve ble deretter generert.
4. Western blot-analyse
Cellelysater ble separert ved elektroforese på en 4-15% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gradient minigel (SDSPAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) og elektroforetisk overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ). Western blot ble analysert med antistoffer mot Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), caspases og spaltede caspases, cyclin D1, NF-kB (Cell Signaling, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Shanghai) Company, Shanghai, Kina), P-gp, og BCL-2 (Huan bioteknologi, Beijing, Kina). Proteinbåndene ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).
5. Flowcytometriske analysen
Celler (2 * 10
5 per brønn) ble sådd ut i en seks-brønns plate og behandlet med paclitaxel. Etter 72 timer ble cellene fiksert i 70% etanol og farget med propidiumjodid (PI). DNA-innholdet ble analysert med en Epics Profile II flowcytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA) med Multicycle programvare (Phoenix Flow Systems, San Diego, California). Alle forsøkene ble gjentatt minst to ganger. PI ble også brukt i forbindelse med Annexin V (BD Biosciences, San Jose, CA) for å bestemme om cellene var levedyktige, apoptotiske eller nekrotiske.
6. Mirna Transfeksjon og Detection
Celler ble sådd ut i seks-brønns kulturplater og transfektert med 50 nM pre-MIR-107 kjøpt fra Applied Biosystems (Carlsbad, California) eller kontrollere pre-miRNA i henhold til produsentens protokoll. Kvantitativ Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) ble utført ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit og Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoller. The ganger endring i MIR-107 mikroRNA nivåer ble beregnet og normalisert til en HSA-mir-423 lasting kontroll.
7. Dyr
BALB /c mus i alderen 3-4 uker som veier 18-22 g ble kjøpt fra SLAC forsøksdyr selskap (SCXK-2007-004, Shanghai, Kina) og plassert fem per bur i et spesifikt patogen-fri (SPF) miljø. Dyrene ble tillatt å akklimatisere seg til boliger fasiliteter i 7 dager før forsøkene startet. Animal håndteringsprosedyrer ble utført i samsvar med P. R. Kina lovgivning om bruk og stell av forsøksdyr og godkjent av forsøksdyr Etisk komité Zhejiang University (Zhejiang, Kina).
8. Xenograft-analyse og behandling
I korthet ble grupper på seks BALB /c-mus ble injisert subkutant med 1 * 10
6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vektor, eller MKN45 celler i høyre flanke. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen: V = 1/2 *
en product: *
b
2, der
en
og
b
er den lengste og korteste diameteren av tumormassen (i millimeter), henholdsvis. Når tumorene nådde omtrent 80 mm
3, ble musene behandlet med injeksjon av ADM (50 mg /kg) og OXA (5um /kg) hver uke i 2 uker. Kvantitative forandringer i kroppsvekt og tumorvolum ble målt hver tredje dag ved et enkelt individ ved hjelp av en balanse og Vernier calipers. Ingen bedøvelse ble brukt i museforsøk.
9. Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført tre ganger med triplikate prøver. Analyse av varians og t-test ble anvendt for å sammenligne verdiene av test- og kontrollprøver. En P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Statistica 6,1 programvare ble benyttet for alle statistiske analyser. Betydningen ble evaluert av student t-test.
Resultater
1. In vitro testing av kjemoterapi følsomhet endringer i magekreftceller stabilt uttrykker Lin28
To stammer av magekreftceller med negative Lin28 uttrykk (MKN45 og MKN28) ble valgt ut og kultivert. Vi identifiserte mage kreftceller med stabil Lin28 uttrykk fra resistente transfekterte kloner (MKN45 /Lin28 /C2 og MKN28 /Lin28 /C3) med western blotting og q-PCR (fig 1).
(A). Magekreft cellelinje MKN45 og MKN 28 med Lin28 overekspresjon ble etablert via Lin28 plasmid transfeksjon ble Lin28 uttrykk oppdaget av Western-blot. (B). mRNA nivået av Lin28 ble påvist ved QRT-PCR, representerer hvert datapunkt middelverdien ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (** P 0,01). (C). MKN45 med Lin28 overekspresjon viste økt motstand mot OXA, PTX, ADM, 5-Fu. (D). MKN28 med Lin28 overekspresjon viste økt motstand mot OXA, PTX, ADM, 5-Fu.
Den valgte MKN45 /Lin28C2, MKN45 /Vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /Vector, og MKN28 celler ble testet for kjemoterapi resistens. Vi valgt ut følgende fire brukte kliniske kjemoterapi narkotika for behandling av magekreft: OXA, PTX, ADM, og 5-Fu. Behandling med OXA, PTX, og ADM varte i 48 timer, mens 5-Fu behandling varte i 72 timer. Etter Lin28 transfeksjon, MKN45 og MKN28 cellene hadde en redusert følsomhet for OXA, PTX, ADM, og 5-Fu som var mest uttalt for OXA og PTX. IC50-verdiene var mer enn det dobbelte av kontrollgruppen (figur 1).
På grunnlag av MTT-analysen, vi brukte strømningscytometri for å påvise forskjeller i apoptose mellom Lin28-positive og negative celler Lin28- etter kjemoterapi PTX eksponering. Den MKN45 /Lin28, MKN45 /Vektor og MKN45 cellegrupper mottok 0 uM og 0,1 uM PTX behandling i 24 timer, og dobbel-farging ble gjennomført for å detektere celle apoptose. Den apoptotiske frekvensen av transfekterte celler Lin28 var lavere enn for ikke-transfekterte celler (p 0,05). I tillegg western blot av protein oppsamlet fra celler behandlet med 0,1 uM PTX viste at apoptose ble redusert i MKN45 /Lin28 celler, som vist ved reduksjon i aktiveringen av caspase 9 og caspase 3 (figur 2).
( A) og (B). Apoptose frekvensen av MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, MKN45 behandlet med PTX på 0.1um ble vist. Dataene viste MKN45 /Lin28 hadde mindre apoptose rente enn MKN45 /Vector og MKN45. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (* P 0,05). (C). Cleaved- caspase9 og caspase3 ble oppdaget av Western blot. Cleaved- casepase 9 og casepase 3 ble redusert i MKN45 /Lin28.
Transient transfeksjon av siRNA-Lin28 skal hemme Lin28 uttrykk nivåer i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler 48 timer etter overføring i henhold til eksperimentelle retningslinjer reagenser produsent. Lin28 protein ekspresjon ble påvist, og den tilhørende medikamentsensitivitet ble testet. Lin28 RNA uttrykk i magekreftceller ble oppdaget av q-PCR, mens protein uttrykk ble oppdaget av vestlige blotting (fig 3).
(A) .MRNA nivå Lin28 etter Lin28 knockdown ble oppdaget av QRT-PCR på 48t, 72t etter transfeksjon i MKN45 /Lin28 C2 og MKN28 /Lin28 C3. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (** P 0,01, * p 0,05). (B). Protein nivået av Lin28 i MKN45 /Lin28 C2 og MKN28 /Lin28 C3 ble oppdaget av western-blot 72h etter Lin28-siRNA transfeksjon. (C). Chemo-følsomheten MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 til OXA, PTX og ADM av MTT-analyse etter Lin28 uttrykk ble knockdown. (D) og (E) .Apoptosis endring blant MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN45 /Lin28 /si kontroll, MKN28 /Lin28 /si-Lin28, MKN28 /Lin28 /si-kontroll på OXA 3.2ug /ml, PTX 1uM.After Lin28 var knock-down, ble apoptose av MKN45 /Lin28 redusert. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (* P 0,05)
Q-PCR viste at Lin28 mRNA uttrykk i MKN45 /Lin28 /si-Lin28 (48 h) og MKN45 /Lin28 /si-Lin28 (72 h) celler var. mye lavere enn den i MKN45 /Lin28 /Si-kontrollceller (p 0,01). Dette transfeksjon effekten ble også bekreftet i MKN28 /Lin28 celler. Western blotting viste at Lin28 si-RNA betydelig hemmet Lin28 protein uttrykk i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler.
En MTT-analyse ble utført på de fire celletyper (MKN45 /Lin28 /si kontroll, MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN28 /Lin28 /si-kontroll, og MKN28 /Lin28 /si-Lin28 celler) som ble transfektert med Lin28 siRNA i 48 timer for å vurdere kjemoterapi følsomhet. Vi valgte å bruke kjemoterapi narkotika som hadde de største utslagene i den pre-testing: OXA, PTX og ADM. Vi valgte en konsentrasjonsgradient på 5-6 i henhold til de foreløpige resultatene av foreløpige eksperimenter. Forstyrrelser av siRNA redusert uttrykk for Lin28, og Lin28-positive cellelinjer hadde en økt følsomhet for cellegifter (fig 3).
neste oppdaget følsomheten av celler til ulike cytostatika etter nedregulering av Lin28 . Celler ble delt inn i 4 grupper, MKN45 /Lin28 /si-kontroll, MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN28 /Lin28 /si-kontroll og MKN28 /Lin28 /si-Lin28, og ble testet med cellegift OXA og PTX henholdsvis . Kjemoterapimedikamentkonsentrasjoner (OXA 3,2 ug /ml og PTX 1 um) ble valgt i henhold til resultatene av preliminære eksperimenter. Antallet apoptotiske MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler var mindre enn den for MKN45 /Lin28 /si-Lin28 og MKN28 /Lin28 /si-Lin28 celler (p 0,05). Dette resultatet indikerer at nedregulering av Lin28 uttrykk kan øke celle apoptose (figur 3).
2. De molekylære mekanismer som Lin28 endringer i kjemoterapi følsomhet
Vi har oppdaget resistens relaterte genuttrykk nivåer av Q-PCR i MKN45 /Lin28 og MKN45 /vektor cells.P-gp, og C-myc-RNA-nivå var betydelig økt og cyclin D1 RNA nivå ble redusert, mens andre BCL-2, CDK6, NF-kB, TOP II viste ikke signifikant forskjell mellom MKN45 /Lin28 og MKN45 /vektor cells.Also disse legemiddelresistens relaterte genekspresjon ble undersøkt ved western blot i MKN45 /Lin28 og MKN45 /Vector celler, som viste konsistent trend at P-gp og C-myc protein uttrykk økt mens Cyclin D1 redusert. Imidlertid Bcl-2-ekspresjon ble redusert, hadde NF-kB uttrykk ikke endres, og ekspresjon av Cyclin D1 og proteinkinasen CDK6 ble redusert (figur 4).
(A) .Differential ekspresjon av medikament-resistens-assosiert protein mellom MKN45 /Lin28 og MKN45 /Vector. (B) og (C) .P-gp og C-myc ekspresjonen nivå ble redusert i både protein og RNA-nivåer etter Lin28 knockdown i MKN45 /Lin28 celle, mens Cyclin D1-ekspresjon ble øket. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (** P 0,01, * p 0,05).
Etter Lin28 uttrykk ble hemmet av transfeksjon med Lin28 siRNA ble RNA-nivåer av P-gp, C-myc og cyclin D1 revurderes. Etter reduksjon i RNA-nivået av Lin28, P-gp og C-myc var signifikant nedregulert, mens syklin D1-nivåer betydelig øket. Deteksjon av P-gp, C-myc, og Cyclin D1 ekspresjon ved western-blotting viste at etter hemming av Lin28 uttrykk, P-gp og C-myc-protein ekspresjon ble betydelig nedregulert, mens ekspresjonen av Cyclin D1 var signifikant oppregulert ( fig 4).
3. MiR-107 er målet mikroRNA av Lin28
Mens teste Lin28 RNA og MIR-107 nivåer i mage kreft cellelinjer, vi fant gjensidig hemming av Lin28 og MIR-107 i MKN45 og AGS cellelinjer. I tillegg MIR-107 ble nedregulert i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler. Knockdown av ekspresjonen av Lin28 reverseres denne inhibering. I et oppfølgingseksperiment, Lin28-positive celler, MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28, ble transfektert med pre-mir-107 og ble senere omtalt som MKN45 /Lin28 /pre-MIR-107 og MKN28 /Lin28 /pre- MIR-107 celler. Transfekterte pre-MIR-kontrollceller ble kalt MKN45 /Lin28 /pre-MIR-Control og MKN28 /Lin28 /pre-MIR-Control. Anti-MIR-107 eller kontroll transfections inn Lin28-negative celler, MKN45 /Vector, ga MKN45 /Vector /anti-MIR-107 og MKN45 /Vector /anti-MIR-Control celler, henholdsvis. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble RNA samlet og utsatt for q-PCR for å påvise forskjeller i Mir-107 uttrykk i MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /Vector, og MKN28 /Vector celler. Effekten av knockdown av Lin28 uttrykk ved Lin28 siRNA ble også vurdert. Etter transfeksjon med Lin28, Mir-107 uttrykk var signifikant nedregulert, mens etter knockdown av Lin28 uttrykk, et uttrykk for MIR-107 økt. Førti-åtte timer etter transfeksjon av pre-MIR-107, Lin28 RNA-nivåer ble signifikant redusert, og 96 timer etter transfeksjon, Lin28 protein uttrykk fremdeles var lavere enn for de ikke-transfekterte kontrollgruppen. Dette funnet indikerer at MIR-107 kan regulere uttrykket av Lin28 (fig 5).
(A) .RNA nivå Lin28 og MIR-107 ble oppdaget av QRT-PCR i mage cellelinje. (B) .MiR-107 uttrykk nivå ble oppdaget av QRT-PCR etter Lin28 overekspresjon (i MKN45 og MKN28) eller Lin28 knockdown (i MKN45 /Lin28). (C). Pre-MIR-107 transfeksjon nedregulert Lin28 i MKN45 /Lin28 i en tidsavhengig måte. (D). Chemo-drug følsomheten MKN45 /Lin28C2 og MKN28 /Lin28C3 økt etter transfeksjon av pre-MIR-107. (E). Apoptose frekvensen av MKN45 /Lin28 (behandlet med OXA på 3.2ug /ml) økte etter transfektert med pre-MIR-107. (F). Chemo-drug følsomheten MKN45 celle endret etter tilført anti-MIR-107. (G) og (H). P-gp, C-myc uttrykk ble redusert, mens CyclinD1 uttrykk ble økt i MKN45 /Lin28 celler etter transfektert med pre-MIR-107.Each datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. (** P 0,01, * p 0,05).
4. MiR-107 er med i Lin28-mediert chemo medikamentresistens
kjemoterapi følsomhet av 4 cellegrupper, MKN45 /Lin28 /pre-MIR-kontroll, MKN45 /Lin28 /pre-MIR-107, MKN28 /Lin28 /pre-MIR-kontroll og MKN28 /Lin28 /pre-MIR-107, ble testet ved hjelp av MTT metode 48 timer etter transfeksjon med pre-MIR-107. Vi valgte kjemoterapi narkotika som hadde de største utslagene under pre-testing, OXA, PTX og ADM, og valgt en konsentrasjonsgradient av 5-6 ifølge foreløpige resultater fra foreløpige eksperimenter. Resultatene tyder på at innføring av pre-MIR-107 inn i Lin28-positive celler kan øke celle-sensitivitet overfor kjemoterapi. Apoptose testingen viste at antallet MKN45 /Lin28 apoptotiske celler økte etter transfeksjon med forhånds MIR-107 (p 0,05). MTT testing av MKN45 /Lin28 /anti-MIR-kontroll og MKN45 /Lin28 /anti-MIR-107 kjemoterapi følsomhet viste at hemming av uttrykk for MIR-107 i MKN45 redusert følsomhet for PTX (fig 5).
Ved western blotting og q-PCR, vi har oppdaget at legemiddelresistens relaterte gen og protein uttrykk nivåer i MKN45 /Lin28 celler som hadde blitt transfektert med pre-MIR-107, inkludert de av C-myc, P-gp, og Cyclin D1. Resultatene viste at 48 timer etter transfeksjon med MIR-107, RNA og protein ekspresjon av c-myc og P-gp ble redusert (p 0,01), mens ekspresjonen av Cyclin D1 økt (p 0,05) (figur 5).
5. Lin28 forbundet chemo-resistens in vivo
Etter 2 runder med kjemoterapi, fant vi at xenografttumorer av MKN45 /Lin28 celler ikke redusere i volum og ble større enn for andre grupper (MKN45 /Vector og MKN45 ). I både MKN45 /Lin28 og MKN45 /vektor-grupper, en av musene døde, slik kjemoterapi ble stoppet. Tumorene ble skåret ut og deres volumer analysert. Vi fant at MKN45 /Lin28 xenografttumorer var større enn de andre svulster etter ADM og OXA kjemoterapi (p 0,01). (Fig 6)
MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, MKN45 /foreldre celler ble inokulert subkutant i armhulen av hann BALB /c-nu /nu-mus. Tumorvolumet ble målt, og vekstkurve ble konstruert etter injeksjon av ADM og OXA
via
halevenen. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (** P 0,01).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi foreningen av Lin28 uttrykk med cellegift-følsomhet i mage kreftceller. Vi fant ut at transfeksjon med Lin28 reduserer følsomheten av mage kreft cellelinjer MKN45 og MKN28 til fire typer kjemoterapeutiske reagenser (oksa, PTX ADM, og 5-FU). Ved hjelp av siRNA interferens teknologi for å knockdown Lin28 uttrykket kan reversere cellegift-motstand. Vi viste også at MIR-107 kan nedregulerer Lin28 uttrykk, mens serveres også som en av de potensielle mål microRNAs som er regulert av Lin28. Overekspresjon av Lin28 oppregulert C-myc og P-gp, mens nedregulert Cyclin D1, kan dette fenomener reversere ved Lin28 siRNA eller transfeksjon forhånds MIR-107. Dette kan være kritiske mekanismer som Lin28 redusert kjemosensitivitet i magekreftceller. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser Lin28 /MIR-107 signalveien kan være involvert i chemo-legemiddelresistens i magekreft.
Kjemoterapi er en av stor behandling for mage kreftpasienter, men mer enn 50% av pasientene vil utvikle seg til kjemoterapi motstand. De mulige mekanismer for kjemo-resistens i magekreft anses nå å inkludere det transmembrantransport av ABC-transportører, glutation-S-transferase, aktiviteten av DNA topoisomerase, kreft genet p53 mutasjoner og apoptose-relaterte veier. En fersk studie fant at mikroRNA spiller en viktig rolle i magekreft kjemoterapi narkotika motstand [15]. I en tumorcelle motstand modell, ble det observert at kreft stamceller også spille en viktig rolle i resistens mot kjemoterapi. C-myc-genet er en av de overflatemarkører for kreft stamceller, men også et onkogen forbundet med ubestemt spredning, uendelig immortalisering, og fremming av celledelingen [16]. En studie rapporterte at 40% av pasientene med magekreft har C-myc-genet overekspresjon og det høyere C-myc-ekspresjon er assosiert med dårligere prognose [16-18]. Studier har også rapportert en korrelasjon mellom den C-myc-genet og apoptose. C-myc-ekspresjon kan føre til redusert tumorcelle-apoptose. Cellen apoptotiske hastighet og følsomhet overfor induserte faktorer er avhengig av C-myc proteinnivåer [19]. Videre er C-myc-overekspresjon i forbindelse med strålebehandling og kjemoterapi motstand. Videre kan C-myc oppregulert P-gp, som kan indusere effluxing av kjemoterapeutiske reagenser førte til kjemoterapi motstand [20]. Cellesyklus-stans kan påvirke responsen av kreftceller til visse cytostatika (for eksempel PTX), som spiller en rolle i G2 /S-fasen redusert medikamentsensitivitet. Cellecyklusen protein Cyclin D har tre undertyper, D1, D2 og D3, og er en cellesyklusstart faktor. Dens undertrykkelse av transformerende vekstfaktor -β1 (TGF-β1) hindrer cellene i å komme inn i cellesyklusen, slik at de forblir i en hvilende tilstand [21]. Cyclin D kombinerer spesifikt med CDK4 /6 til å fosforylere og inaktivere retinoblastom protein (pRb), og dermed bidra til G1 /S overgang og initiering av DNA-syntese [21]. I denne studien fant vi Lin28 ikke var relevant med BCL-2, NF-kB og TOPO II i magekreftceller. Samarbeidet mellom Lin28 og microRNAs har blitt godt etablert, som la-7, MIR-200c, MIR-143 [4,22]. Lin28 overekspresjon nedregulerer mikroRNA, mens mikroRNA kan også negativt påvirke uttrykket av Lin28. Lin28 sammen med TUT4 utgjør en negativ regulator, som påvirker kjønnsmodning og homeostase av microRNAs [4,22]. Ved å regulere nedstrømsgener, er mikroRNA involvert i celledifferensiering og proliferasjon, cellemetabolisme, stressrespons og dannelsen av blodårer. Cheng et al [23] fant at etter inhibering MIR-107, veksten av HeLa-cervical kreft celler og A549 lungekreftceller ble fremmet. Marijn et al [24] fant at uttrykket av MIR-107 i narkotika-resistente eggstokkreft celler ble nedregulert. Vår studie fant at Lin28 kan også begrense modning av MIR-107, og innføring av MIR-107 øke magekreft celle chemo-følsomhet for OXA, PTX, og ADM. Etter transfeksjon av anti-MIR-107, redusert følsomhet dette. Pre-MIR-107 forårsaket en reduksjon i uttrykket av Lin28, illustrerer at Lin28 /MIR-107 veien kan være involvert i kjemosensitivitet endringer av magekreft.
I sammendraget, vi viste at Lin28 kunne hemme uttrykk for MIR-107, og dermed opp regulerende C-myc, P-gp og nedregulere Cyclin D1, senere resultere i chemo-motstand av mage kreftceller. Den Lin28 /MIR-107 veien kan bli servert som en av mange signalveier som er forbundet med magekreft chemo-motstand. Vår studie kan gi ny innsikt i magekreft chemoresistance mekanisme. Lin28 /MIR-107 kan være noen nye potensielle terapeutiske mål for kjemoterapiresistent magekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Minimal data for alle disse tallene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0143716.s001 plakater (XLSX)
