Abstract
B-lymfocytt-indusert modning protein 1 (Blimp1) er en mester regulator av B celledifferensiering, og kontroller migrasjon av primordial kjønnsceller. Nylig har vi observert avvik Blimp1 uttrykk i brystkreftceller som følge av en NF-kB relB til Ras signalveien. For å ta opp spørsmålet om det uventede uttrykk for Blimp1 er sett i andre epiteliale-avledet svulster, valgte vi lungekreft som de er ofte drevet av Ras signalering. Blimp1 ble påvist i alle fem lunge kreft cellelinjer undersøkt og vist seg å fremme lungekreft celle migrasjon og invasjon. Avhør av microarray datasettene vist forhøyede
BLIMP1
RNA uttrykk i lunge adenokarsinom, bukspyttkjertel duktale karsinomer, hode og nakke svulster samt i glioblastomas. Involvering av
Ras Hotell og dens nedstrøms kinase c-Raf ble bekreftet ved hjelp av mutant og siRNA strategier. Vi neste adressert spørsmålet om mekanismen for Blimp1 aktivering i lungekreft. Ved hjelp av knockdown og ektopisk ekspresjon, rollen av aktivatoren protein (AP) -1 familie av transkripsjonsfaktorer ble demonstrert. Videre kromatin immunoutfellingsstudier analyser bekreftet binding til identifiserte AP-1 elementer i
BLIMP1
formidler av ectopically uttrykt c-Jun og av endogene AP-1 subenheter følgende serum stimulering. Propeptidet domene av lysyl-oksidase (LOX-PP) ble identifisert som en tumor suppressor, med evnen til å redusere Ras signalisering i lungekreftceller. LOX-PP redusert ekspresjon av Blimp1 ved binding til c-Raf og inhibering av aktivering av AP-1, for derved å dempe den vandrende fenotypen til lungekreftceller. Dermed er Blimp1 en formidler av Ras /Raf /AP-1 signale som fremmer cellemigrasjon, og blir undertrykt av LOX-PP i lungekreft
Citation. Yu Z, Sato S, Trackman PC, Kirsch KH , Sonenshein GE (2012) Blimp1 Aktivering av AP-1 i humane lungekreftceller Fremmer en trekkfugl Phenotype og hemmes av lysyl oxidase Propeptid. PLoS ONE 7 (3): e33287. doi: 10,1371 /journal.pone.0033287
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 26 oktober 2011; Godkjent: 10 februar 2012; Publisert: 15 mars 2012
Copyright: © 2012 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gir R01 CA143108 og PA1 ES011624. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
B-lymfocytt-indusert modning protein 1 (Blimp1) eller Positive-Regulatory Domain jeg Binding Factor 1 (PRDI-BF1) er en sink finger protein kodet av
PRDI-BF1 og RIZ domene en
(
PRDM1
) eller
BLIMP1
genet [1], [2], som i utgangspunktet ble isolert som en transcriptional repressor av
IFNβ
promoter [3]. Flere mekanismer for Blimp1-mediert represjon av gentranskripsjon er belyst: rekruttering av histon metyltransferaser (HMTs) [4], histon deacetylases (HDACs) [5] eller corepressors [2] eller ved konkurranse med transkripsjonelle aktivatorer [6]. Blimp1 ble identifisert som en hovedregulator av B-celledifferensiering terminal [7], som fremmer differensiering av B-lymfocytter til plasmaceller [8]. Flere faktorer har vært innblandet i aktivering av transkripsjon av
Blimp1
genet under differensiering av B-celler, inkludert NF-kB, AP-1, IRF4, STAT3 og STAT5, selv om deres nøyaktige virkningsmekanismer er ikke fullt forstått [9]. Blimp1 ble senere vist å regulere T-celledeling og homeostase [10]. Under utviklingen styrer Blimp1 primordial bakterie celle (PGC) spesifikasjon og migrasjon som Blimp1-mangelfull mus embryoer generere PGC-lignende celler som ikke viser karakteristiske PGC migrasjon [11], [12]. Noe uventet, Blimp1 ble påvist i ikke-hematopoetiske kreftceller. Vårt laboratorium observert Blimp1 uttrykk i brystkreftceller, og viste det trykt transkripsjon av
ESR1
genet som koder for østrogen reseptor alfa (ERα), og dermed fremme en mer vandrende fenotype [13]. Transcriptional induksjon av BCL-2 nivåer av NF-kB relB subenheten rekruttert Ras til mitokondriene [14]. Den resulterende Ras-signalisering førte til en avvikende induksjon av Blimp1 i brystkreftceller [13]. Den nøyaktige transkripsjonsfaktor (e) nedstrøms for Ras at mediert aktivering av Blimp1 i disse kreftceller forble å bli identifisert. Men involvering av Ras signalering i Blimp1 aktivering fører oss til hypoteser som uttrykk for Blimp1 kan være mer utbredt i kreft enn tidligere realisert. Kolorektal kreftceller ble også funnet å uttrykke Blimp1, som undertrykt
TP53
genet og dermed opprettholdt cellevekst [15].
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i vestlige land . Omtrent to tredjedeler av pasientene er diagnostisert på et avansert stadium, og av de gjenværende pasientene som gjennomgår kirurgi, 30-50% utvikler tilbakefall med metastatisk sykdom [16], [17].
RAS
onkogen er mutert i opp til ~ 30% av lungekrefttilfellene, med flertall av mutasjoner funnet i
KRAS
genet [16], [17]. Onkogene K-Ras predisponerer transgene mus til lunge tumorigenesis [18]. Ras signaler via flere veier, inkludert mitogen aktivert protein kinase (MAPK). Som atom akseptorer for MAPK signaleringskaskader, aktivatoren protein (AP) -1 familie av transkripsjonsfaktorer har blitt implisert i den vandrende fenotypen til lungekreftceller [19], [20], [21].
lysyl oxidase product: (
LOX
) genet ble isolert som
ras recision genet product: (
RRG
) på grunn av sin evne til å gå tilbake Ras-mediert transformasjon av NIH 3T3 fibroblaster [22]. Vår gruppe viste ektopisk Pro-LOX uttrykk redusert ekstracellulære signalregulert kinase (ERK) og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalisering og aktivering av NF-kB i Ras-transformerte NIH 3T3 celler [23]. Tap av
LOX
genekspresjon ble sett i mange cancervev og avledede cellelinjer inkludert de fra lunge [24], [25], [26], tykktarm [27], prostata [28], gastrisk [29 ] og hode og nakke plateepitel kreft [30]. Ektopisk
LOX
genuttrykk redusert koloni dannelsen av dyrkede mage kreftceller og tumordannelse i en xenograft modell [29]. Lysyl- oksidase syntetiseres og utskilles som et pro-enzym (Pro-LOX), og bearbeidet til et funksjonelt enzym (LOX) og aminoterminale propeptid (LOX-PP) [31].
RRG
aktivitet av Pro-LOX ble uventet kartlagt til LOX-PP domene, som bedømmes av hemming av den transformerte fenotype av NIH 3T3-Ras celler [32]. Deretter ble LOX-PP vist seg å redusere den vandrende fenotypen til mus brystkreftceller som drives av Her-2 /Neu, som signaliserer via Ras og deres evne til å danne tumorer i en naken mus xenograft modell [33], [34]. I H1299 lungekreftceller, som inneholder en mutant
NRAS
gen, LOX-PP redusert aktivering av ERK og Akt, og muligheten for forankringsuavhengig vekst og invasiv kolonidannelse i Matrigel [25]. LOX-PP også svekkede fibronektin-mediert aktivering av fokal adhesjonskinase i brystkreftceller [34], [35], og fibroblast vekstfaktor (FGF) -2-indusert proliferasjon av prostata kreftceller [36]. Her spurte vi om Blimp1 er uttrykt i lungekreftceller gitt den viktige rollen Ras signalisering i disse kreftcellene. Blimp1 ble påvist i alle lungekreft linjer undersøkt og fremmet sin migrasjon og invasjon. Videre
BLIMP1
RNA ble påvist i andre primære svulster drevet av Ras signalering. I lungekreftceller, ble luftskip 1-ekspresjon indusert av en Ras /c-Raf /AP-1-veien, noe som kunne bli inhibert av LOX-PP via interaksjon med c-Raf. Dermed disse studiene identifisere Blimp1 som en kritisk formidler av lungekreft celle vandrende fenotype av trans Ras /c-Raf /AP-en kaskade.
Materialer og metoder
Cells og kultur forhold
Den ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) A549 og H1299 cellelinjer ble vennlig levert av Zhi-Xiong Jim Xiao (Boston University School of Medicine, Boston MA). Den Calu-en, H23 og H441 cellelinjer ble sjenerøst gitt av Hasmeena Kathuria og Maria Ramirez (Boston University School of Medicine). A549, Calu-en, H23 og H441 celler uttrykker mutant K-Ras [37], [38] og H1299 express mutant N-Ras [39]. Bosc23 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Alle cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos minimale essensielle medium, bortsett fra H441 som ble opprettholdt i RPMI-1640. Kulturmediet var supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), som anbefalt av ATCC. H1299 kloner uttrykker mus LOX-PP i en doksycyklin (DOX) induserbar vektor ble etablert og total RNA isolert som beskrevet tidligere [25]. Induserbare stabile A549-celler som uttrykker V5-merket human eller mus LOX-PP ble etablert som tidligere beskrevet [33], [34]. Kort, PCL-Ampho retrovirus emballasje vektor (IMGENEX, San Diego, California) var co-transfektert inn BOSC 23 celler ved hjelp Fugene 6 (Roche Diagnostics Co, Indianapolis, IN) med enten tom effektor vektor pC4
bsrR (TO) (EV) eller vektor bærer DNA-fragmenter av menneskelig eller mus LOX-PP med C-terminal V5 tag og regulator vektor PCX
neoTR2 (både vennlig levert av Tsuyoshi Akagi, KAN, Kobe, Japan). Etter 48 timer ble supernatanter inneholdende virale partikler høstes og ført gjennom et 0,45 um filter (Corning Inc., Corning, NY). A549 lungekreftceller var dobbeltkrum infisert i 48 timer med supernatant fra BOSC 23 celler inneholdende virus som bærer regulator og effektor-vektorer supplert med 6 ug /ml polybrene (Sigma, St. Louis, MO). Infiserte celler ble utvalgt med 10 ug /ml blasticidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1,4 mg /ml geneticin (Sigma) for å generere separate bassenger av stabile A549-EV, A549-human LOX-PP og A549-mus LOX-PP-celler .
plasmider og transfeksjon analyse
pcDNA3 /Blimp [2] og 7-kB
Blimp1
-pGL3 luciferase reporter (
Blimp1
-luc ) [40] vektorer ble vennlig levert av Tom Maniatis (Columbia University, New York) og Kathryn Calame (Columbia University), henholdsvis. C-Jun, c-Fos, Fra-en og Fra-2 AP-1 konstruksjoner i PCI ekspresjonsvektor ble som tidligere rapportert [41]. For transient transfeksjon av ekspresjonsvektorer, ble kulturer i 12-brønners plater inkuberes i 48 timer i nærvær av 1 ug DNA og 3 pl Fugene 6 eller 2,5 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen). Co-transfeksjon av MSV-β-gal vektor som uttrykker β-galaktosidase (β-gal) ble anvendt for å normalisere for transfeksjonseffektivitet. Alle transient transfeksjon rapportør analyser ble utført in triplo, to ganger som tidligere beskrevet [42], og standard feil av gjennomsnittet (SEM) beregnet.
BLIMP1
siRNA og
juni
,
FRA-1 Hotell og
FRA-2
siRNA duplex sekvenser ble som tidligere beskrevet [15], [43 ]. SiRNA rettet mot menneskelige
KRAS
genet (sc-35731) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). RNA tomannsboliger som brukes til målretting
c-RAF
var som beskrevet av Chadee og Kyriakis [44] og kjøpt fra Qiagen (Valencia, California). For transient transfeksjon av enkelt sirnas ble kulturene i 6-brønns plater inkuberes i 24 timer i nærvær av siRNA dupleks (10 nM sluttkonsentrasjon) og Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. I tilfellet av ko-transfeksjon av to AP-1 sirnas, sluttkonsentrasjonen av hvert siRNA var 10 nM, noe som gjør den totale siRNA-konsentrasjon 20 nM. Hvor nevnte ble kulturen supplert med en negativ kontroll siRNA (Qiagen) ved en sluttkonsentrasjon på enten 10 eller 20 nM, som er hensiktsmessig. Ras S186 ekspresjonsvektor ble vennlig levert av Mark Phillips (NYU School of Medicine, New York, New York). For bygging av N-terminalt glutation
S
-transferase (GST) merket LOX-PP og dets delesjonsmutanter cDNA som koder full lengde LOX-PP (WT, aminosyre 1-162) og sletting av aa rester 26-100 (ΔM3) ble amplifisert fra full-lengde Pro-LOX-cDNA [33] og innsatt i BamHI /Clal side pEBG-GST pattedyr-ekspresjonsvektor, en generøs gave fra Dr. Bruce Mayer (University of Connecticut Health Center, Farmington, CT). For konstruksjon av C-terminalt GST-merket LOX-PP, ble cDNA som koder for GST og LOX-PP forsterket og ført inn pcDNA3.1 (+). pBabe-puro-MEK1 S217E /S221E konstitutivt aktiv (CA-MEK) mutant ble vennlig levert av Dr. Geoffrey M. Cooper (Boston University, Boston, MA). CDNA som koder MEK1 S217E /S221E ble innsatt i pcDNA3.1 (+).
immunoblotanalyse
Nuclear ekstrakter (NE) og hel celleekstrakter (WCE) ble fremstilt og utsatt for immunblotting, som tidligere beskrevet [33]. For påvisning av utskilt, rekombinant LOX-PP-V5, kulturmedium (40 ul fra 2 ml kulturmedium) ble immunoblottet ved bruk av et anti-V5-antistoff (R960-25, Invitrogen). Antistoffene mot Blimp1 (ingen 9115s.), C-Jun (ingen 9165.), Fosfor-c-Jun (ingen 9261s.), MEK1 /2 (L38C12;. No 4694) fosfor-ERK1 /2 (fosfor-Thr202 /Tyr204, ingen 9101s) og ERK1 /2 (9102) ble erholdt fra Cell Signaling (Danvers, MA).. Antistoffer mot GST (B-14), K-Ras (F234), B-Raf (F-7), Fra-1 (N-17), Fra-2 (Q-20), og c-Fos (H-125 ) var fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mot β-aktin (AC-15) og α-tubulin (DM1A) var fra Sigma. Hsp70 /Hsc70 (SPA-820) og HSP90 (SPA-830) antistoffer ble kjøpt fra Stressgen (Victoria, BC, Canada). Antistoff mot c-Raf (klon 53) og Ras (klon 18 /Ras) var fra BD Transduksjon (Franklin Lakes, NJ). Kanin polyklonale antistoffer mot LOX-PP ble fremstilt som tidligere beskrevet [45]. Resultatene fra minst to uavhengige eksperimenter ble utsatt for densitometry og normalisert til en β-aktin lasting kontroll og gjennomsnittsverdiene i forhold til å kontrollere tom vektor (EV) celler (satt til 1,0) gitt.
Migrasjon og invasjon analyser
utestengelse av 1 × 10
5 celler ble lagvis, i tre eksemplarer, i de øvre kamrene Costar Transwells (Corning, Lowell, MA) på en 8-mm diameter polykarbonat filter (8 mikrometer pore størrelse), og inkubert ved 37 ° C i 16 timer. Migrasjon av celler til den nedre side av filteret ble evaluert med fosfatase enzymatisk analyse ved bruk av p-nitrofenylfosfat og OD
410 nm bestemmelse, slik som tidligere beskrevet [13] eller ved farging med krystallfiolett og OD
570 nm bestemmelse (63). Den gjennomsnittlige migrasjon fra tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist i forhold til kontrollgruppen EV, som ble satt til 1,0.
P
verdiene ble beregnet ved hjelp av en student
t
-test. For invasjon analyser, ble filtre-belagt med 10 mikrogram av Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California). Migrasjon av celler til den nedre side av filteret ble bestemt ved farging med krystallfiolett og OD
570 nm bestemmelse. Gjennomsnitt ± SD er vist. Invasion ble utført tre ganger, i tre eksemplarer.
revers transkriptase (RT) -PCR analyse
RNA ble isolert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Invitrogen), og prøver med A
260 /A
280 forholdstall mellom 1,8 og 2,0 ble behandlet med RQ1 RNase-fritt DNase (Promega). Hevet III RT ble brukt for revers transkripsjon med 1 ug RNA i nærvær av 100 ng av tilfeldige primere (Invitrogen). For Realtime kvantitativ PCR (Q-PCR),
BLIMP1
primere ble som tidligere beskrevet [46].
GAPDH
primere var: Spiss 5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3 «; Revers 5»-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3 «. Q-PCR ble utført i tre eksemplarer i en Roche LightCycler 480 system.
Chromatin Immunoutfellingsunder (chip) assay
chip analysene ble utført ved hjelp av en EZ-chip kit (Millipore Corporation, Billerica, MA) , i henhold til produsentens instruksjoner. For analyse av ectopically uttrykt AP-1, var 24 timer etter H441-celler transfektert med en c-Jun ekspresjonsvektor, formaldehyd (1% endelig) ble tilsatt til cellekulturmediet. Helcellelysater ble tatt opp og underkastet sonikering i en Misonix 3000 sonikator (Misnonix, Farmingdale, NY) i 15 sykluser med 10 sek hverandre under dannelse av genomiske DNA-fragmenter av rundt 200 til 1000 bp. Etter preclearing med Chip klasse Protein G agarose, ble 100 ul skåret DNA-proteinkomplekser immunopresipitert med antistoffer mot c-Jun (sc-1694) eller normal kanin IgG (sc-2027) (Santa Cruz Biotechnology). Tverrbinding ble reversert og rensede genomiske DNA-fragmenter ble underkastet PCR. Kryssbindingen ble reversert ved inkubering over natten ved 65 ° C og genomiske DNA-fragmenter ble renset med Qiaquick en PCR-rensesett (Qiagen, nr. 28104). To festeelementer for AP-1, som også er kjent som TPA responsive elementer eller Tres, ble tidligere identifisert ved -1813 og -1647 bp i forhold til
BLIMP1
transkripsjon start stedet [47] og bekreftet ved hjelp TransFac ( genomatix.de) analyse. Regionen over de to Tres ble forsterket av PCR. De primere for -1813 bp TRE: Termin 5′-GCCTTCTTCCCACCTCAAATATCA-3 «, Omvendt 5′-TGGCCTGCTGTTCAAACAGTCT-CA-3′; og for den -1647 bp TRE: Spiss 5»-GTTGCATGATGGTGTATGTGGCCT-3 «, Omvendt 5′-ATCCAGCCTGCTCAAGAGGGTTTA -3». Som en positiv kontroll for AP-1-binding, et fragment av det humane
juni
promoter inneholdende to nært lokaliserte områder TRE (-120 og -1 bp) ble likeledes underkastet til chip-analyse, ved hjelp av de tidligere beskrevne primerne [ ,,,0],48]. Som en negativ kontroll ble primere designet for et oppstrøms område av
BLIMP1
promoter (-5508 til -5366 bp) som inneholder ingen TRE sider: Spiss 5’TCCTTCCCTGTGTTTGGTCCCATT-3 «, Omvendt 5»-ATTGTTTCCTTCAAGCAGGCACCC- 3 «. For binding av endogene AP-1-subenheter, ble A549-cellene inkubert i serumfritt medium i 48 timer og FBS (10% endelig konsentrasjon) ble tilsatt tilbake. Etter 30 min ble WCE fremstilt og underkastet til chip-analyse, som angitt ovenfor, ved hjelp av antistoffer mot normalt kanin-IgG, c-Jun, Fra-1 (sc-183), eller Fra-2 (sc-604) (fra Santa Cruz Biotechnology ).
Immunpresipitasjon og GST trekke ned analysen
H1299 eller A549 cellene ble lysert med Buffer A [25 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM ditiotreitol, 0,5 ug /ml leupeptin, 2 uM pepstatin A, 1 ug /ml aprotinin og 1% Triton X-100]. Lysatene ble sentrifugert i en mikrosentrifuge i 10 minutter ved 13000 rpm ved 4 ° C for å fjerne uoppløselig materiale. For immunoutfelling, 2 ug av enten kanin-anti-LOX-PP [45] eller kanin kontroll IgG ble tilsatt til 500 pg cellelysat, fulgt av inkubering over natten ved 4 ° C. Protein G-Sepharose-kuler (Invitrogen) ble deretter tilsatt til blandingen, etterfulgt av inkubasjon ved 4 ° C i 2 timer med forsiktig risting. Kulene ble vasket fire ganger med buffer A. For GST-pull down-analysen, ble lysatene inkubert med 20 ul glutation-Sepharose 4B (GE Healthcare) i 2 timer ved 4 ° C. Harpiksen ble vasket fire ganger med buffer A. De immunkomplekser eller GST trekke ned-kompleksene ble eluert fra Sepharose-kuler med SDS-PAGE-prøvebuffer, og de utfelte proteiner analysert ved immunblotanalyse.
Resultater
lungekreft celler uttrykker Blimp1
Fem lunge kreft cellelinjer, drevet av mutant K-Ras eller N-Ras, ble valgt ut til å teste for Blimp1 uttrykk: A549, H1299, Calu-en, H23 og H441. Nukleære ekstrakter ble underkastet immunoblotanalyse (Fig. 1A). Som en referanse, er inkludert vi nukleære ekstrakter fra ERα positive MCF-7 og ERα negative MDA-MB-231 brystkreftceller, som vist forholdsvis lavere og høyere Blimp1 nivåer, henholdsvis [13]. Alle fem lungecancercellelinjer uttrykte 100 kDa Blimp1 proteinet gjenkjent av et antistoff mot den N-terminale enden av det humane Blimp1 protein. Som sett tidligere, de ERα negative MDA-MB-231 brystkreft celler uttrykte høye nivåer av Blimp1 enn ERα positive MCF-7-celler [13]. Alle de lungekreftceller uttrykte betydelig høyere mengder av Blimp1 enn MDA-MB-231 linjen. Dermed er Blimp1 uttrykt i lungekreftceller.
(A) Prøver av kjernefysiske ekstrakter (20 mikrogram) av A549, H1299, Calu-en, H23 og H441 menneskelige lungekreft celler og MCF-7 og MDA- MB-231 (MB-231) brystkreft celler ble utsatt for immunblotting for Blimp1 og β-aktin, som en kontroll for lik belastning. Plassering av molekylære markører er gitt i venstre kjørefelt. En representant for to uavhengige eksperimenter med lignende resultater er vist. (B) A549 og (C) H1299 celler ble transient transfektert med 10 nM hver av
siBLIMP1-1
,
siBLIMP1-2
eller en egge negativ kontroll siRNA. Øvre paneler: Førti-åtte timer etter transfeksjon ble WCE (30 mikrogram) utsatt for immunblot for Blimp1 og β-aktin. Båndene ble kvantifisert ved bruk av NIH Image J programvare og Blimp1 uttrykk normalisert p-aktin uttrykk. Normalisert Blimp1 ekspresjon ble bestemt i to uavhengige forsøk, og gjennomsnittsverdier er gitt nedenfor blottene. Nedre paneler: Alternativt, etter 24 timer, ble kulturene trypsinert og 1 x 10
5-celler utsatt for en migrering assay i 16 timer, i tre eksemplarer. Den gjennomsnittlige migrasjon fra tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist i forhold til den negative kontroll siRNA (innstilt på 1,0).
P
verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test. *,
P
0,005; **
P
0,0005. (D) A549 celler ble inkubert i nærvær av 0,5 nM
siBlimp1-2
eller kryptert negativ kontroll siRNA i 16 timer. Cellene ble så transfektert med Blimp1 ekspresjonsvektor (2 ug per brønn i 6-brønn plate) og inkubert i 32 timer. (Innfelt) Hele cellelysater (20 ug) ble underkastet Western blot-analyse ved bruk av antistoffer mot Blimp1 eller β-aktin. Kulturer ble trypsinert og 1 x 10
5-celler utsatt for en migrering assay i 16 timer, i tre eksemplarer. Den gjennomsnittlige migrasjon fra to uavhengige forsøk ± SE er presentert i forhold til den negative kontrollen siRNA og EV (satt til 1,0). Dataene som vises, er et representativt for to uavhengige forsøk med lignende resultater. (E) A549 celler ble transient transfektert med 10 nM hver av
siBLIMP1-1
,
siBLIMP1-2
eller en egge negativ kontroll siRNA. Etter 48 timer ble kulturene trypsinert og 1 x 10
5-celler utsatt for en invasjon assay i 16 timer, i tre eksemplarer. De gjennomsnittlige dataene fra tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist i forhold til den negative kontroll siRNA (innstilt på 1,0).
P
verdier ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test. *, P . 0,01
Blimp1 fremmer migrasjon av lungekreftceller
Fraværet av Blimp1 i museembryoer førte til utviklingen av opprinnelige bakterielignende celler som ikke var i stand til å migrere [ ,,,0],11], [12]. For å teste om Blimp1 uttrykk er involvert i kontroll av lungekreft celle migrasjon, ble en knockdown strategi som brukes. A549 og H1299 celler, som viste relativt høye nivåer av Blimp1 (Fig. 1A), ble inkubert med enten
siBLIMP1-1
eller
siBLIMP1-2
, to uavhengige siRNA arter, eller med en egge negativ kontroll siRNA. Etter 48 timer ble prøver av WCE kastet immunoblotanalyse. Begge
BLIMP1
sirnas resulterte i effektiv knockdown av Blimp1 protein uttrykk i forhold til kontroll siRNA. En mer robust knockdown ble sett med
siBLIMP1-2
i begge cellelinjene, dvs. 93% reduksjon i A549 og 88% i H1299 sammenlignet med 30% i A549 og 48% i H1299 med
siBLIMP1- 1 product: (øverste panelene, fig. 1B og 1C). Effektene av en 24 timers inkubasjon med disse sirnas om migrasjon av A549 og H1299 celler ble testet i Boyden kamre (1 × 10
5 per brønn) med FBS som chemo-tiltrekkende. Cellemigrasjon ble målt 16 timer senere. Knockdown av
BLIMP1
uttrykk førte til redusert migrasjon av A549 (Fig. 1B) og H1299 (Fig. 1C) lungekreftceller. I tre uavhengige forsøk, utført i tre eksemplarer,
siBLIMP1-2
ført til en mer dyptgående reduksjon i migrasjon av A549 (gjennomsnittlig reduksjon på 42% med
siBLIMP1-1
vs 71% med
siBLIMP1-2
) og H1299 celler (gjennomsnittlig reduksjon på 35% med
siBLIMP1-1
vs 54% med
siBLIMP1-2
). Det ble ikke observert signifikante effekter av behandlinger på celleproliferasjon (data ikke vist). Disse resultatene er i overensstemmelse med reduksjonen av luftskip-1-nivå. For å bekrefte at reduksjonen av cellevandring var spesielt på grunn av knockdown av Blimp1 uttrykk, utførte vi en redning eksperiment ved hjelp av
siBLIMP1-2 Hotell og Blimp1 ektopisk uttrykk i A549 lungekreftceller. Kort sagt ble A549-celler inkubert med enten
siBLIMP1-2
eller negativ kontroll siRNA i 16 timer fulgt av transient transfeksjon av en vektor uttrykker Blimp1 eller EV DNA. Etter 32 timer ble cellene underkastet en migreringsanalyse eller prøver av WCE ble underkastet immunoblotanalyse.
BLIMP1
siRNA-2 resulterte i effektiv knockdown av Blimp1 protein ekspresjon sammenlignet med kontrollen siRNA og denne effekten ble overvunnet av Blimp1 ekspresjonsvektoren (Fig. 1D, innfelt). Som sett ovenfor, knockdown av
BLIMP1
uttrykk førte til en reduksjon i cellemigrering 42% sammenlignet med celler transfektert med negativ kontroll siRNA og EV, og dette ble overstyrt av ektopisk Blimp1 ekspresjon (Fig. 1D). En økning 33% i migrering av A549-celler transfektert med cDNA Blimp1 og
siBlimp1-2
ble observert sammenlignet med kontrollgruppen siRNA og EV transfekterte celler. I tillegg ble ingen signifikante effekter på celleproliferasjon bemerket over tidsforløpet (data ikke vist). Deretter testet vi effekten av Blimp1 knockdown på invasjon. En reduksjon i invasjonen av A549 lungekreftceller ble notert med
BLIMP1
siRNA-1, som var enda mer dyptgripende med
BLIMP1
siRNA-2 i forhold til den negative kontrollen siRNA, i samsvar med migrasjon data (fig. 1E). Dermed reduserte nivåer av Blimp1 bly redusert evne til A549 og H1299 lunge kreftceller til å migrere og invadere.
neste utførte converse eksperiment og ectopically uttrykt Blimp1 i A549 og H441 celler som uttrykker høyere og moderate nivåer av Blimp1, henholdsvis. Kulturer ble transient transfektert med en cDNA Blimp1 ekspresjon eller foreldrene tom vektor (EV) i 24 timer og utsatt for migrasjon assays, som ovenfor. I tre uavhengige forsøk, utført i tre eksemplarer, Blimp1 overekspresjon øket vandring av A549 og H441-celler med et gjennomsnitt på 64% (Fig. 2A) og 58% (fig. 2B), respektivt. Western blotting av ekstrakter fremstilt fra tilsvar transfekterte kulturer bekreftet ektopisk uttrykk for Blimp1 (øverste panelene, fig. 2A og 2B). Således fremmer Blimp1 en mer vandrende fenotype av lungekreftceller
(A) A549-celler eller (B) H441-celler ble transient transfektert med 1 jjg Blimp1 cDNA eller EV-DNA ved hjelp av Lipofectamine 2000. Øvre panel:. WCE ble isolert etter 48 timer og underkastet immunoblotanalyse for Blimp1 og β-aktin. Nedre paneler: Alternativt, 24 timer etter transfeksjon, ble cellene underkastet en migrasjon analyse som i fig. 1. Den gjennomsnittlige migrering fra tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist i forhold til den EV (satt til 1,0).
P
verdiene ble beregnet ved hjelp av en student
t
-test. *,
P
0,005. C) Box plot fra kreft microarray datasettet Hou lunge ble åpnet ved hjelp Oncomine Database. Elevens
t
-test for de to gruppene viser en
P
verdi av 0.024. D) Boksplott fra Badea kreft i bukspyttkjertelen, Estilo hode-halskreft og Sun hjernesvulst microarray datasettene ble vist ved hjelp Oncomine Database. Elevens
t
-UNDERSØKELSER sammenligne gruppene i disse studiene viser
P
verdier av 8.67e
-7, 0.001 og 3.28e
-15, henholdsvis.
Flere primære svulster vise overekspresjon av
BLIMP1
RNA
neste spurt om
BLIMP1
RNA påvises i primære lungesvulster. Forhøyet
BLIMP1
mRNA uttrykk ble påvist i lunge adenokarsinom prøvene i forhold til normal lunge vev [49] (Fig. 2C). Konstitutiv Ras-signalisering indusert av enten en mutant
RAS
gen eller oppstrøms aktivator for eksempel vekstfaktor-reseptor har vært implisert i mange andre tumorer.
KRAS
mutasjoner er funnet i 95% av bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer [50], mens overekspresjon av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som induserer Ras signalering, ble funnet i 80-90% menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom [51] og 40% av glioblastomas [52]. Spesielt våre analyser ved hjelp av microarray datasett i Oncomine avslørte forhøyet
BLIMP1
RNA uttrykk i prøver av bukspyttkjertelen adenokarsinom [53], tunge plateepitelkarsinom [54] og glioblastom [55] sammenlignet med tilsvarende normale vev (fig. 2D). Dermed
BLIMP1
RNA er overuttrykt i en mangfoldig gruppe av kreft hos mennesker.
Ras til c-Raf signale induserer Blimp1 uttrykk i lungekreftceller
For å direkte ta rollen av Ras-signal på Blimp1 nivåer i lungekreftceller, ble en dominant negativ mutant først brukt. Ras mutant-S186 opprettholder evnen til å assosiere med effektor proteinkinase c-Raf, men ikke translocate til membranen og inhiberer aktivering av Blimp1 av Bcl-2 [13], [56]. A549-celler, som uttrykker et aktivert Ras mutant K-C12, ble transfektert med EV eller et plasmid som uttrykker Ras S186 og etter 48 timer, WCE og RNA ble isolert. Ektopisk ekspresjon av Ras S186, som ble bekreftet ved immunblotting, redusert Blimp1 protein-ekspresjon ved ~54% (fig. 3A). I to separate forsøk,
BLIMP1
mRNA uttrykk avvist et gjennomsnitt på 48% ved ektopisk uttrykk for Ras S186 (Fig. 3B). Virkningene av dominant negativ Ras på
Blimp1
promoter-aktivitet ble også testet. A549 celler ble ko-transfektert med enten EV eller Ras S186 vektor-DNA, sammen med en 7-kB
Blimp1
promoter reporter konstruere
Blimp1
-luc og en β-gal uttrykk vektor, for normalisering av transfeksjonseffektiviteter. Overekspresjon av Ras S186 førte til en gjennomsnittlig reduksjon på 69% i normalisert
Blimp1
promoter aktivitet (Fig. 3C). Til slutt, en si-
KRAS
strategi ble ansatt (Fig. 3D). Knockdown av K-Ras førte til en reduksjon på 93% av K-Ras-protein ekspresjon og til en betydelig reduksjon i ERK-aktivitet bedømt ved en reduksjon i fosfo-ERK nivåer. Videre ble en gjennomsnittlig reduksjon på 44% i Blimp1 nivåer sett i to uavhengige eksperimenter (Fig. 3D). Sammen indikerer disse resultater at onkogeniske Ras-signalisering i A549 lungekreftceller stasjoner
BLIMP1
genekspresjon.
(A), A549-celler ble transfektert med 5 ug av et plasmid som uttrykker dominant negativ Ras S186 eller EV DNA. Etter 48 timer ble WCE og RNA forberedt. *, P 0,01.
