Abstract
Bakgrunn
sulindak er en FDA-godkjente ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) som påvirker prostaglandin produksjonen ved å hemme cyklo (COX) 1 og 2. sulindak har også ble interessert i mer enn ti år som en chemopreventive for adenomatøse kolorektale polypper og tykktarmskreft.
hovedfunnene
Forbehandling av menneskelige kolon og lungekreft celler med sulindak forbedrer drepe av et oksidasjonsmiddel som tert-butylhydroperoksyd (TBHP) eller hydrogenperoksyd. Denne virkning innebærer ikke cyklooksygenase (COX) hemming. Men under de betingelser som benyttes, er det en betydelig økning av reaktive oksygenarter (ROS) i kreftcellene, og et tap av mitokondriemembranpotensialet, noe som tyder på at celledød skyldes apoptose, som ble bekreftet ved Tunel assay. I motsetning til dette ble denne forbedrede drap ikke observert med normale lunge og kolon celler.
Betydningen
Disse resultater indikerer at normale celler og kreftceller håndtere oksidativt stress på forskjellige måter og sulindac kan forbedre denne forskjellen. Kombinasjonen av sulindak og et oksidasjonsmiddel kan ha terapeutisk verdi
Citation. Marchetti M, Resnick L, Gamliel E, Kesaraju S, Weissbach H, Binninger D (2009) sulindak Forbedrer Killing av kreft celler eksponert for oksidativt stress. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10,1371 /journal.pone.0005804
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 10 februar 2009; Godkjent: 11 mai 2009; Publisert: 05.06.2009
Copyright: © 2009 Marchetti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et Center of Excellence i Biomedisinsk og marin bioteknologi stipend fra staten Florida (tilskudd 1140-190-43 tildelt DB og HW). Ytterligere støtte levert av National Institutes of Health (1 R15 CA 122001-01A1 tildelt HW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sulindak var en av de tidlige ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs), som påvirker prostaglandin produksjonen ved å hemme cyklo (COX) 1 og 2 [1]. For mer enn et tiår har sulindak også vært av interesse som et chemopreventive behandling for adenomatøse kolorektale polypper og tykktarmskreft [2] – [5], spesielt hos pasienter med familiær adenomatøs polypose [6]. Sulindak har også blitt rapportert som en chemopreventive agent for mus kreft i urinblæren [7]. Den anti-tumorigen aktivitet av sulindac mot tykktarmskreft kan involvere både COX-inhibering [2] og aktiviteter som er uavhengig av COX-inhibering [8] – [11]. Det har blitt rapportert at sulindac induserer apoptose av tykktarmskreftceller, [11], [12], som synes å medføre endringer i genekspresjon [12] -. [18]
sulindac er et pro-medikament som må konverteres til den aktive COX-inhibitor, sulindac sulfid [19]. Vi har tidligere vist at omdanningen av sulindac til sulindac sulfid kan katalyseres ved msrA, et medlem av metioninsulfoksid reduktase (Msr) familien av enzymer [20]. MSR systemet har blitt studert i detalj i de siste årene, etter at det ble vist at Msra kan spille en rolle i aldring og aldersrelaterte sykdommer [21] – [23]. Den åpenbare funksjon av Msr systemet er å redusere metioninsulfoksid (Met (o)) i proteiner tilbake til metionin (Met) (anmeldt i [23]), selv om det også fungerer som en del av en ROS gatefeier system, der Msr slags system Met rester i proteinet til å virke som katalysa antioksydanter [24]. Støtte for den scavenger rolle Msra har kommet fra nylige studier med både PC-12-neuronale celler, hvori Msra ble overuttrykt [25], og humane celler linse, hvori Msra ekspresjon ble nedregulert [26]. Dermed er det betydelige bevis som tyder på at MSR systemet spiller en viktig rolle i å beskytte cellene mot oksidativ skade.
Siden sulindak er et substrat for Msra [20], virket det rimelig at drap av kreftceller ved sulindak kan involvere oksidativt stress. I tillegg har vi ønsket å bestemme hvorvidt normale celler og kreftceller reagerte på lignende måte (e) etter behandling sulindac og oksidativt stress. I en foreløpig studie, viste vi at behandling av en plateepitelkreft cellelinje med sulindak og et oksidasjonsmiddel førte til nesten en 500% økning i intracellulære ROS nivåer og betydelig celledød. I motsetning til dette ble normale humane epidermale keratinocytter ikke viser en økning i ROS-nivåer eller celledød. Disse resultatene førte til en begrenset klinisk studie som viste lovende potensial for å bruke lokal applikasjon av sulindak og hydrogen peroxide for behandling av aktinisk keratose [27].
I dagens studiene vi utvidet disse tidligere resultater ved hjelp av kreftcellelinjer avledet fra lunge og tykktarm vev. Vi gir ytterligere bevis på at den forbedrede drapet observert med sulindak og oksidativt stress innebærer mitokondriell dysfunksjon fører til celledød via apoptose. Disse nye data styrke potensialet for spesifikt å øke den terapeutiske anvendelse av sulindak og dets derivater for behandling av kreft ved å bruke dem i forbindelse med en forbindelse som gir reaktive oksygenarter (ROS).
Resultatene
sulindac forbedrer dreping av tumorceller ved oksidativt stress, men ikke involverer enten COX-inhibering eller Msr system
human lunge og kolon kreftcellelinjer ble preinkubert i nærvær eller fravær av sulindac i 48 timer. Overskudd av sulindac ble fjernet ved vasking før den 2 timers inkubasjon med TBHP som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Sulindac ble anvendt ved 500 pM sluttkonsentrasjon siden preliminære forsøk under anvendelse av sulindac ved denne konsentrasjonen viste ingen signifikant virkning på cellelevedyktighet for noen av kreftcellelinjer.
Hver kreftcellelinjen hadde en markert reduksjon i celleviabilitet i tilstedeværelsen av TBHP etter forbehandling med 500 pM sulindac (figur 1A og 1B). Levedyktigheten for lungecancerceller forbehandlet med sulindak ble redusert med mer enn 80% etter inkubasjon i 2 timer med 240 pM TBHP når sammenlignet med kontrollceller som ikke var forbehandlet med sulindak (figur 1A). Lignende responser på TBHP ble observert med sulindak behandlede tarmkreftceller (figur 1B), selv om en høyere konsentrasjon av TBHP var nødvendig for signifikant dreping av tykktarmskreftceller. Sulindac også forbedret dreping av begge cancercellelinjene når TBHP ble erstattet med hydrogenperoksyd, ved konsentrasjoner mellom 1,0 mM og 6,0 mM (figur 2).
lungekreftceller (A) eller tykktarmskreftceller (B) ble inkubert i nærvær (▪) eller fravær (□) av 500 uM sulindac i 48 timer. Cellene ble deretter vasket for å fjerne den frie sulindac før inkubasjon i 2 timer med den angitte konsentrasjon av TBHP og cellenes levedyktighet ble målt ved bruk av MTS-analysen beskrevet i Materialer og amp; Metoder. Cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke er forbehandlet med sulindac eller er utsatt for TBHP). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som en% av den midlere verdi av fire gjentatte prøver fra et representativt eksperiment. Signifikans av forskjellene mellom celler behandlet med og uten sulindac, men utsatt for den samme konsentrasjon av TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P 0,0001
lungekreftceller (A) eller tykktarmskreftceller (B) ble inkubert i nærvær (▪) eller fravær (□) av 500 uM sulindac i 48 timer.. Cellene ble deretter vasket for å fjerne den frie sulindac før inkubasjon i 2 timer med den angitte konsentrasjon av hydrogenperoksyd. Cellelevedyktigheten ble målt ved bruk av MTS-analysen beskrevet i Materialer og amp; Metoder. Cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke er forbehandlet med sulindac eller er utsatt for hydrogenperoksyd). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som en% av den midlere verdi av fire gjentatte prøver fra et representativt eksperiment. Signifikans av forskjellene mellom celler behandlet med og uten sulindac, men utsatt for den samme konsentrasjon av hydrogenperoksyd: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001
Flere linjer av bevis tyder på at økt drap av kreftceller ved sulindak og oksidativt stress ikke involverer COX-hemming. To andre NSAID, acetylsalisylsyre (aspirin) og ibuprofen, ved 500 pM, klarte ikke å øke følsomheten av kreftceller til oksidativt stress (figur 3A og 3B henholdsvis,). Som nevnt ovenfor, er sulindac et pro-medikament som må omdannes til den aktive COX-inhibitor, sulindac sulfid [19], først og fremst gjennom aktiviteten av Msra [20]. For å bestemme hvorvidt den forbedrede dreping av sulindac-behandlede kreftceller ved TBHP involvert reduksjon av sulindac til sulindac sulfid, den aktive inhibitor av cyklo-oksygenaser, ble eksperimentene beskrevet ovenfor gjentas under anvendelse av sulindac sulfon, som ikke er et substrat for Msra (upubliserte data) eller en COX-inhibitor [28]. På grunn av økt toksisitet av sulindac sulfon en lavere konsentrasjon (250 uM) ble anvendt for disse forsøk. Forbehandling av lungecancerceller med 250 pM sulindac sulfon (figur 3C), etterfulgt av eksponering til TBHP ga resultater tilsvarende de som ses under anvendelse av 500 uM sulindac (sammenlign figur 1A og 3C). Lignende resultater ved bruk av sulindac sulfon ble også oppnådd med de tykktarmskreftcellelinjer (data ikke vist). Således, de kollektive data indikerer at den økte følsomheten av sulindac behandlede kreftceller mot oksidativt stress, under de betingelser som anvendes, ikke innebære enten Msr system eller COX-inhibering.
lungekreftceller ble inkubert i nærvær ( ▪) eller fravær (□) av enten 500 uM acetylsalisylsyre (A), 500 uM ibuprofen (B), eller 250 pM sulindac sulfon (C) i 48 timer. Cellene ble deretter vasket for å fjerne den frie NSAID eller sulindac sulfon før inkubasjon i 2 timer med den indikerte konsentrasjon av TBHP. Cellelevedyktigheten ble målt ved bruk av MTS-analysen beskrevet i Materialer og amp; Metoder. Cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke eksponert for et NSAID, sulindac sulfon, eller TBHP). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som en% av den midlere verdi av fire gjentatte prøver fra et representativt eksperiment. Signifikans av forskjellene mellom celler behandlet med og uten sulindac sulfon, men utsatt for den samme konsentrasjon av TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001
sulindak ikke forbedre drap av normale celler utsatt for oksidativt stress
Det var viktig å finne ut om den forbedrede drepende effekt av sulindak og sulindak sulfone på kreftceller i nærvær av TBHP (figur 1) forekom også med normale, ikke-immortaliserte celler. Figur 4 viser effekten av å forbehandle normale lungeceller med sulindak eller sulindak sulfonet på celleviabilitet etter oksidativt stress ved hjelp TBHP. Inkubasjon av normale lungeceller med 500 pM sulindac i 48 timer før eksponering til TBHP ikke bare ikke forbedre avliving, men sulindac gitt beskyttelse mot oksidativt stress forårsaket av TBHP (figur 4A). Den beskyttende virkning mot oksidativt stress på normale lungeceller ble også observert når cellene ble forbehandlet med sulindak sulfon (figur 4B).
normal lunge-celler ble inkubert i 48 timer i (A) i nærvær (▪) eller fravær (□) på 500 pM sulindac eller (B) nærværet (▪) eller fravær (□) på 250 pM sulindac. Se Materialer og Metoder og legende til figur 1 for ytterligere detaljer. Signifikans av forskjellene mellom celler behandlet med og uten sulindac eller sulindac sulfon, men utsatt for den samme konsentrasjon av TBHP: * p 0,01; ** P 0,001; *** P. 0,0001
Lignende eksperimenter ble utført ved hjelp av normale tykktarmceller. Det var ingen effekt på cellelevedyktighet i nærvær av TBHP når de normale tykktarmceller ble forbehandlet med enten 500 uM sulindac eller 250 pM sulindac sulfon (data ikke vist). Således hverken normal lunge eller normale tykktarmceller viste forbedret dreping av TBHP etter behandling med sulindac eller sulindac sulfon, som ble observert med de to kreftcellelinjer.
sulindac forbehandling av lungekreftceller fører til forhøyede nivåer av ROS og tap av mitokondriemembran potensielle
lungekreftceller ble anvendt for å skaffe mer informasjon om mekanismen av den forsterkede drepende effekt av sulindac i nærvær av TBHP. For å undersøke om økt drap av kreftceller observert med sulindak og oksidativt stress kan innebære mitokondriell dysfunksjon, ble endringer i nivået av intracellulære ROS bestemt. For disse eksperimentene lungekreftceller ble behandlet med sulindak i 48 timer, utsatt for TBHP og deretter den intracellulære ROS-nivået ble visualisert ved anvendelse av en fluorescerende fargestoff som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Resultatene er vist i Figur 5. Sammenlignet med ubehandlede lungekreftceller (figur 5A), celler behandlet med sulindak alene (figur 5B) eller TBHP alene (figur 5C) viste en beskjeden økning (53-58%) i ROS-nivåer på grunnlag av utseendet av grønn fluorescens. Imidlertid lungekreftceller som var forbehandlet med 500 pM sulindac, etterfulgt av en 2 timers inkubering med 80 pM TBHP (figur 5D) hadde en 400% økning i intracellulær grønn fluorescens sammenlignet med ubehandlede celler (sammenlign figur 5A og 5D). Disse data viser tydelig at forbehandling av lungekreftceller med sulindak fører til en stor økning i intracellulær ROS etter eksponering for oksidativt stress, som støtter resultatene på huden cancerceller nylig rapportert [27].
Panelene viser intracellulær ROS fluorescens. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med kun sulindac; (C) celler behandlet med kun TBHP; (D) celler behandlet med både sulindac og TBHP. De inkubasjonsbetingelser er beskrevet i figur 1. Cellene ble fremstilt for fluorescens mikroskopi, og den grønne fluorescens-signalet ble kvantifisert som beskrevet i Materialer og Metoder. Fluorescens nivåer er gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter og ble korrigert for prosentandel av levedyktige celler. SEM var mindre enn 10% for hver prøve. Økningen i fluorescens sammenlignet med kontrollceller i panel A er: B, 53%; C, 57%; D, 401%.
For ytterligere å undersøke mekanismen for å drepe kreftceller utsatt for oksidativt stress etter forbehandling med sulindak, vi undersøkt om det er samtidig tap av mitokondriell membranpotensiale, som er kjent for å initiere apoptotisk celledød. Effekter på mitokondriemembranpotensialet ble evaluert ved hjelp av endringer i fluorescensen av JC-1 fargestoff som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er vist i figur 6. Den øverste panelene viser røde fluorescerende bilder og de nedre paneler grønne fluorescerende bilder. Tap av mitokondriemembranpotensialet vil resultere i redusert rød fluorescens og en tilsvarende økning av grønn fluorescens. I forhold til ubehandlede celler (figur 6A) eller celler behandlet med kun sulindac (figur 6B) eller TBHP alene (figur 6C), sulindac forbehandling av lungekreftceller, etterfulgt av oksidativt stress (figur 6D) resulterte i avbrudd av mitokondriemembranpotensialet som gjenspeiles av nesten en 20-dobling av grønn fluorescens (se forklaring i figur 6 for ytterligere detaljer). I sammendrag, forbehandling av lungekreftceller med sulindak, etterfulgt av behandling med TBHP fører til en markert økning i intracellulær ROS og et betydelig tap av mitokondriemembranpotensialet. Resultatene indikerte at celledød var oppstått via apoptose, som ble bekreftet av Tunel analyse (Supplementary figur S1)
De øvre panelene viser røde fluorescens bilder mens lavere panelene viser grønn fluorescens bilder. Tap av mitokondriemembranen potensiale ble oppdaget av en nedgang på rød fluorescens med en samtidig økning av grønne florescence. Det eksperimentelle oppsettet er beskrevet i sagn i figur 1. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med kun sulindac; (C) celler behandlet med kun TBHP; (D) celler behandlet med både sulindac og TBHP. Cellene ble fremstilt for fluorescens mikroskopi og fluorescens-signalet ble kvantifisert som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. SEM var mindre enn 10% for hver prøve. Kvantitativ analyse av grønn fluorescens er uttrykt på følgende måte i vilkårlige enheter: panel A -1,39; panel B -1,23; panel C -1,29; panel D -25,3.
diskusjon
sulindac og dets metabolitter, for eksempel sulindac sulfid og sulfon sulindac, har vist seg å ha anti-kreft-aktivitet [29]. I samsvar med vår tidligere studie av hud kreftceller [27] har vi vist at dreping av lunge og kolon tumorcellelinjer kan forbedres betraktelig dersom sulindac er kombinert med et oksidasjonsmiddel, slik som TBHP eller hydrogenperoksyd. Vi har også vist at sulindac forbehandling kan forbedre drepingen av huden cancerceller forårsaket av arsentrioksyd (data ikke vist), som dreper kreftceller ved å generere intracellulær ROS, som rapportert andre steder for lungekreftceller [30]. Det synes rimelig at sulindac kan øke effektiviteten av en hvilken som helst anticancer medikament hvor virkningsmekanismen omfatter oksydativ skade. Vellykket bruk av en multippel medikamentell behandling har nylig blitt rapportert for en klinisk studie med nesten 300 pasienter med risiko for tilbakefall av kolorektal adenomer som ble behandlet med en kombinasjon av sulindak og Difluoromethylornithine, en hemmer av polyaminsyntesen [31].
det virker sannsynlig at mekanismen for selektiv dreping av kreftceller sett i disse studiene omfatter mitokondriell dysfunksjon, muligens som et resultat av økt produksjon ROS. Selv om behandling av kreftceller med sulindac eller TBHP hver for seg fører til en beskjeden økning i nivået av ROS (figur 5B og [27], [32]), er det en dramatisk økning i de intracellulære nivå av ROS i celler forbehandlet med sulindak og deretter eksponert for TBHP (figur 5D). I tillegg er det en betydelig forstyrrelse av mitokondriemembranpotensialet under de samme eksperimentelle betingelser (figur 6), noe som tyder på at sulindac forårsaker apoptose i kreftceller eksponert for oksidativt stress. Anticancer virkning av sulindac alene er blitt rapportert å involvere apoptotisk død [33]. Resultatene med sulindak sulfone og andre NSAIDs tyder på at effekten av sulindak i vårt system ikke innebærer COX-hemming eller MSR systemet.
De foreliggende resultatene indikerer en fundamental forskjell i måten normale celler og kreftceller svare på oksidativt understreke. Sulindac og dens metabolitter kan fremheve denne forskjell, noe som fører til økt dreping av kreftceller, men ikke normale celler, av oksidativt stress. Det er godt etablert at kreft og normale celler varierer i sin oksidativ metabolisme og at kreftcellene har et høyere rate av glykolyse enn normale celler, et fenomen som først beskrevet av Warburg [34]. Det er også overbevisende bevis for at kreftceller er vanligvis under større oksidativt stress sammenlignet med normale celler [35]. En forskjell mellom normale celler og kreftceller til oksidativt stress som har blitt rapportert er cytotoksisitet forårsaket av glukose deprivasjon. Studier av Spitz og medarbeidere [36] har klart vist at denne effekten er mediert av mitokondriell ROS produksjon.
Resultatene som beskrives gir ytterligere bevis på at en kombinasjon av sulindac og et oksidasjonsmiddel kan ha klinisk terapeutisk verdi ved behandling av en rekke krefttyper. I en tidligere forstudie rapporterte vi at resultatene av en begrenset proof of concept studie på mennesker ved hjelp av sulindak (1-5%) og hydrogenperoksid (25%) geler brukes daglig i tre uker på aktiniske keratoser (AK) som involverer de øvre ekstremiteter [27]. Ved ferdigstillelse, alle de ti som ble behandlet AKs viste en reduksjon i størrelse som vist ved klinisk fotografering med fem utstilling fullstendig bortfall av forstadier celler etter hudbiopsi. Disse foreløpige resultatene tilsier mer omfattende kliniske studier
Materialer og metoder
Material
sulindak, acetylsalisylsyre (aspirin), (S) -. (+) – Ibuprofen, og tert-butyl-hydroperoksyd (TBHP) ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Sulindak sulfone ble syntetisert ved Custom Synthesis Inc. (Boca Raton, Florida). Alt vev kultur media inkludert føtalt bovint serum og andre kosttilskudd ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
Cell Culture
En tykktarmskreft cellelinje (RKO), en lungekreft cellelinje (A549), og fibroblast-cellelinjer avledet fra normalt humant vev tykktarm (CCD-18Co) og normal human lunge (MRC-5) ble erholdt fra ATCC (Rockville, MD). Alle cellelinjer ble holdt i den anbefalte kulturmediet. Den normale cellelinjer ble ikke immortalisert og tidlig passasje celler ble anvendt for eksperimentene som er rapportert her. Cellelinjer ble bestemt til å være fri for mycoplasma bruke VenorGeM® Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich), som er en svært følsom PCR-basert analyse.
celleviabilitet analysen
Med mindre annet er angitt cellene ble forbehandlet med sulindak, sulindac sulfon eller en annen NSAID i 48 timer før eksponering til TBHP i 2 timer. Cellesuspensjoner (~100,000 celler) inneholdende det angitte supplement ble sådd ut i 96-brønners mikrotiterplater ved anvendelse av 100 ul av den angitte cellesuspensjon. Platene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Dyrkningsmediet ble deretter fjernet og cellene vasket en gang med friskt kulturmedium med serum. Etter fjerning av vaskeoppløsningen, ble friskt kulturmedium med serum som inneholdt den angitte sluttkonsentrasjon på TBHP eller hydrogenperoksyd tilsatt til cellene, og cellene ble inkubert i ytterligere 2 timer. Lignende resultater ble oppnådd når sulindac ble inkludert i løpet av 2 timers behandling med oksidasjonsmidlet
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved CellTiter 96 Aqueous One celleproliferasjonsanalyse. (Promega; Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Analysen anvender en ny tetrazolium-forbindelse som metabolsk aktive celler omdannes til en vannoppløselig formazan ved innvirkning av cellulære dehydrogenaser, som måles ved absorbans ved 490 nm ved anvendelse av en kolorimetrisk mikrotiterplateleser (SpectraMax Plus
384; Molecular Devices) . Bakgrunn Absorbansen ble subtrahert fra hver prøve. Det har blitt rapportert at enkelte anticancer legemidler kan forårsake forandringer i absorbans i MTS-baserte analyser for cellelevedyktighet i fravær av celler [37]. Kontrollforsøk ved bruk av sulindac alene, TBHP alene eller kombinasjoner av sulindak og TBHP over konsentrasjonsområdet anvendt i de angitte eksperimenter viste ingen effekt av hver forbindelse alene eller i kombinasjon på absorbans.
Intracellulær ROS-analysen
Intracellulær ROS-nivåer ble bestemt ved hjelp av reaktive oksygen arter (ROS) Detection reagenser fra Molecular Probes (Eugene, Oregon) som beskrevet andre steder [38]. Forhøyede nivåer av ROS resulterer i økt grønn fluorescens, som ble visualisert ved fluorescens mikroskopi.
JC-1-assay for å måle mitokondriemembranpotensialet
Tap av mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved å bruke JC-1 fargestoff fra Molecular Probes (Eugene, OR). Tap av mitokondriemembran potensielle fører til økt grønn fluorescens i cytosol og en tilsvarende reduksjon i mitokondriell rød fluorescens. Dermed ble endringer i mitokondrienes membranpotensiale bestemmes ved å følge den røde til grønne flekker skift ved hjelp av en FITC filter (Zeiss invertert mikroskop-Axiovert 40 CFL). Kvantifisering av fluorescens signalene som brukes både standard densitometriske metoder og en Photoshop (Adobe Systems, San Jose, California) basert bildeanalyse [39].
TUNEL analyse for å demonstrere apoptose
apoptotiske celler ble oppdaget ved hjelp av blindgaten (Promega) kolo TUNEL analyse som ender etiketter fragmentert DNA. Celler ble fiksert med 4% formaldehyd før den ble permeabilisert med 0,2% Triton-X-100. Cellene ble deretter vasket med PBS før inkubering med rekombinant terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) og biotinylerte nukleotider i 1 time ved 37 ° C, som omfatter de biotinylerte nukleotider ved 3′-endene av fragmentert DNA. Cellene ble vasket med PBS og deretter inkubert med pepperrotperoksidase-streptavidin (HRP-streptavidin) ved romtemperatur i 30 min. HRP-streptavidin merkede celler ble detektert av hydrogenperoksyd og diaminobenzidin (DAB). Apoptotiske celler blir visualisert ved mørk brun nukleær farging.
Statistisk analyse
Resultater av cellelevedyktighetsforsøk er uttrykt som gjennomsnittet av fire replikater av et representativt eksperiment. Feilstolpene indikerer standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Midler ble sammenlignet ved hjelp av standard t-tester og P-verdier er angitt i figuren legender. P-verdiene 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Kvantifisering av fluorescens signalene som brukes både standard densitometriske metoder og en Photoshop (Adobe Systems, San Jose, California) basert bildeanalyse [39].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
celledød på grunn av apoptose. En TUNEL assay ble anvendt for å detektere apoptose av lungekreftceller. (A) ubehandlede celler; (B) celler behandlet med bare 500 mikrometer sulindak; (C) celler behandlet med kun 180 uM TBHP; (D) celler behandlet med både 500 uM sulindac og 180 uM TBHP. Økte nivåer av apoptose er angitt med forbedret dannelse av brun farge. Den eksperimentelle design er beskrevet i legender av figur 1 i manuskriptet. Ytterligere detaljer Tunel analysen er gitt i Materialer og metoder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0005804.s001 plakater (0,22 MB TIF)
Takk
ønsker å takke Dr. Daphna Sagher for hennes assistanse og nyttige diskusjoner. Vi vil også gjerne takke Kelsey Binninger for hennes hjelp med kunstverk.
