Abstract
18β-glycyrrhetinic syre (18β-GA) er et bioaktivt komponent av lakris. Den anti-kreft aktivitet av 18β-GA har blitt studert i mange krefttyper, mens dens virkninger i lungekreft fortsatt i stor grad ukjent. Vi først viste at 18β-GA effektivt undertrykkes celledeling og hemmet uttrykk samt aktivitet av tromboksan syntase (TxAS) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler A549 og NCI-H460. I tillegg hadde ikke administrering av 18β-GA ikke har noen ekstra hemmende effekt på reduksjon av celleproliferasjon indusert ved transfeksjon med TxAS liten forstyrrelse RNA (siRNA). Videre 18β-GA ikke klarte å inhibere celleformering i de immortaliserte humane bronkiale epitelceller 16HBE-T og en annen NSCLC cellelinje NCI-H23, begge uttrykt minimalt nivå av TxAS i forhold til A549 og NCI-H460. Men 18β-GA avskaffet forbedring av celleproliferasjon indusert av transfeksjon av NCI-H23 med pCMV6-TxAS plasmid. Videre studier funnet at aktiveringen av både ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2 og cyklisk adenosinmonofosfat responselement bindende protein (CREB) indusert ved TxAS cDNA-transfeksjon kan bli fullstendig blokkert av 18β-GA. Til sammen har vi avgrenset det, gjennom å hemme TxAS og dens initiert ERK /CREB signalering, 18β-GA undertrykker NSCLC celleproliferasjon. Vår undersøkelse har fremhevet betydningen av 18β-GA med hensyn til forebygging og behandling av NSCLC
Citation. Huang R-Y, Chu Y-L, Huang Q-C, Chen X-M, Jiang Z-B, Zhang X, et al. (2014) 18β-Glycyrrhetinsyre undertrykker Cell Proliferation gjennom Hemme Tromboksan syntase i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10,1371 /journal.pone.0093690
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 03.12.2013; Godkjent: 09.03.2014; Publisert: 02.04.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 81302799), Kina Postdoktor Science Foundation (nr 2013M531838) og 2012 Utmerket Young Scientist Foundation fra Guangzhou University of Chinese Medicine (No. KAB111133K08). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De urter som brukes i tradisjonell medisin gir en rik reservoar for utvinning av biologisk aktive forbindelser. For eksempel har lakris blitt hyppig brukt i orientalsk medisin for tusen år, og dens hoved bioaktiv komponent glycyrrhizic syre i besittelse av forskjellige biologiske, farmakologiske og medisinske aktivitet, som er lik de av retinoider og steroider [1]. Glycyrrhizic syre lett hydrolyseres til 18β-GA i menneskekroppen, for derved å utøve sin anti-inflammatorisk, anti-virus, og til og med anti-kreft effekt [2] – [4]. Selv chemopreventive potensialet av 18β-GA er dokumentert i mange typer kreftceller, for eksempel menneskelig epitelial ovarialcancer, brystkreft og glioblastom [5] – [7], lite er kjent om effektene av 18β-GA i tumorvekst lunge .
lungekreft er ukontrollert vekst av unormale celler i vev i lungene. Mer enn 1,5 millioner dødsfall på verdensbasis er fra Lungekreft, som overstiger de fra noen andre kreftformer [6]. Blant de mange undergrupper, NSCLC står for 80% av alle lungekreft tilfellene [8]. Till siste var det ingen tilfredsstillende terapeutiske strategier for forvaltning av NSCLC. TxAS har blitt observert å være over-uttrykt i NSCLC-prøver, sammenlignet med normale lungevev [9] – [11]. I kreftvev, er TxAS plassert nedstrøms for cyklo-oksygenaser (COX) -2, og det kan syntetisere tromboxan (Tx) -A2 fra prostaglandin (PG) -H2, som omdannes ved Coxs fra arakidonsyre (AA) [12]. Den biologiske halveringstiden til TxA2 er ca 30 s i in-vitro-modeller, så TxA2 er hurtig og ikke-enzymatisk nedbrutt til en inaktiv form av TxB2 i vandig oppløsning [12], [13]. Således TxA2 fungerer som en parakrin /autokrin hormon med potente effekter av blodplateaggregering, vasokonstriksjon, tumorcelle-proliferasjon og invasjon [12], [14]. Virkningene av TxA2 blir mediert gjennom interaksjon med dets spesifikke reseptor, tromboksan-reseptor (TP), som er et medlem av den G-protein-koblet celleoverflatereseptor familie [12], [13]. I løpet av de siste 5 årene har TxAS og tilhørende TP blitt grundig studert i kreftforskning. Den positive rolle TxAS og TP i tumorpatologi er derfor etablert, og deres inhibitorer /antagonister er blitt foreslått å være lovende antikreftmidler [10], [15]. Nylig ble det rapportert at både TxAS og dens oppstrøms COX-2 er styrt av TP, og TxAS er i stand til å fremme tumorvekst lunge gjennom denne autoregulerende feed-back loop [16]. Forbløffende nok i humane endotelceller, effekter av TP agonist kan etterlignet av 18β-GA med et lignende tidsforløp og effekt [17], noe som tyder på en sammenheng mellom 18β-GA og molekylære TxAS.
Derfor vi har undersøkt mulig en-kreft effekt av 18β-GA i NSCLC celler. Vi rapporterer her at 18β-GA kunne undertrykke celleproliferasjon og indusere apoptose i NSCLC-celler gjennom, i det minste delvis, å inhibere TxAS ekspresjon og aktivitet. Slike effekter kan forventes å være av betydelig klinisk relevans.
Materialer og metoder
Cell Kultur og kjemikalier
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer NCI-H23, NCI-H460 og A549, så vel som en immortalisert human bronkial epitelcellelinje 16HBE-T ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Begge NCI-H23 og 16HBE-T-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), og NCI-H460 og A549-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium. Alle celler ble opprettholdt i dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C.
18β-GA og arachidonsyre ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, og cisplatin ble levert av ALADDIN Chemical Co., Ltd (Shanghai, Kina).
Celleproliferering analysen
celler ble sådd i 5000 celler per brønn i 96-brønners plater og inkubert over natten. Etter passende behandling, ble antallet levedyktige celler kvantifiseres ved de angitte tidspunkter, ved bruk av MTS-analyse, utført i fire eksemplarer, i henhold til den instruksjon av produsenten (Promega, Madison, WI). Absorbansen ble bestemt ved hjelp av en mikroplateleser ved bølgelengde på 492 nm.
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd på 1 × 10
5 celler /10 ml i 6-brønners plater og inkubert over natten. Levende celler ble samlet opp og vasket to ganger med iskald PBS. Cellene ble farget med Annexin V fluorescein fargestoff og propidiumjodid (PI) ved romtemperatur i mørke i 15 min. Cellene ble deretter resuspendert i 400 ul Annexin-bindingsbuffer (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). De fargede celler ble holdt på is og analysert ved Beckman væskestrømsfotometere.
Enzym-immunoanalyse (EIA) assay
TxAS aktivitet ble overvåket ved å analysere nivået av tromboksan B2 (TxB2), et stabilt produkt av den ikke-enzymatiske hydrering av TxA2 [12]. A549 og NCI-H460-celler ble sådd på samme tetthet på 1 x 10
5 celler /10 ml medium i en 6-brønners kulturplate. Kultursupernatanten ble oppsamlet og sentrifugert etterfulgt riktig behandling. TxB2 ble oppdaget av peroksidase-merket TXB2 konjugater ved hjelp av et enzym immunoassay kit i henhold til produsentens instruksjoner (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
Transient transfections
Celler ble sådd på samme tetthet av 1 x 10
5 celler /10 ml medium i en 6-brønners kulturplate. 10 nM TxAS siRNA og ikke-target-siRNA (kontroll) ble transfektert inn i A549 og NCI-H460, mens 2 ug ledig pCMV6 (kontroll) eller pCMV6-TxAS plasmid ble transfektert inn i NCI-H23, ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen , Carlsbad, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner (OriGene teknologier, Rockville, Maryland). Omfanget av den spesifikke genet knockdown eller over-uttrykk ble oppdaget av real-time PCR eksperiment.
Sekvensen av TxAS siRNA er rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. Betingelsene for siRNA trans er som følgende: Cellene ble dyrket ved tetthet på 70% med standard medium. Etter fjerning av medium, ble cellene inkubert med DMEM (uten antibiotika) som inneholder forhåndsblandet siRNA (10 nM) og 7,5 pl av Lipofectamine 2000 reagens, og ble ytterligere inkubert i 72 timer.
Revers transkriptase (RT) -PCR og real-time kvantitativ PCR
RT-PCR og sanntids-kvantitativ PCR ble utført som tidligere beskrevet [16]. De følgende genspesifikke primer-sekvenser ble anvendt: 5′-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 «(sense) og 5′-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3′ (antisense) for humane TxAS; 5»-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 «(sense) og 5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3» (antisense) for human β-aktin. Real-time PCR ble utført ved hjelp av CFX96 Touch Deep Well ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc. Berkeley, CA). Fold endring av kontroll i uttrykket av TxAS mRNA ble beregnet av 2
-ΔΔCT metode.
Western Blot analyse
Totalt protein (20 ug) ble vedtatt med 7% SDS polyakrylamid gelelektroforese og utsatt for western blot analyser ved anvendelse av de mest avanserte kjemiluminescens påvisningssystem (Bio-Rad Laboratories). Western blots ble probet med et mus monoklonalt antistoff mot TxAS (OriGene teknologier), en geit polyklonalt antistoff mot β-aktin (Santa Cruz Biotechnology), og kanin polyklonale antistoffer mot GAPDH, PARP, total og fosforylert ERK1 /2, så vel som total og fosforylert CREB (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). For å sikre lik protein lasting, ble membraner strippet og deretter analysert med anti-GAPDH eller anti-β-aktin antistoffer.
Statistiske analyser
Data er avbildet som betyr ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. Student «s t-test ble anvendt for sammenligninger mellom to grupper, mens One-veis ANOVA, etterfulgt av Dunnetts test ble valgt for å sammenligne forskjellene mellom mer enn to grupper. Statistiske analyser ble utført av SPSS 11.6 statistisk programvare (SPSS, Chicago, IL). En tosidig p-verdi. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant for alle forsøkene
Resultater
18β-GA trykt celleproliferasjon via induksjon av apoptose
Begge A549 og NCI-H460 er NSCLC-cellelinjer. Den tidligere tilhører adenokarsinom, og den sistnevnte er en stor cellelungecancercellelinje. Vurdering av antallet levedyktige celler ved hjelp av MTS-analyse demonstrerte at 24 timers behandling av 18β-GA trykkes celleproliferasjon i begge cellelinjer på en doseavhengig måte (figur 1A). Forrige in vitro studie viste at IC
50 Verdien av 18β-GA for å hemme lungekreft cellevekst var 145,3 mikrometer [18]. Som vist i figur 1A og 1B, 18β-GA 160 uM betydelig redusert prosentandel av levedyktige celler til rundt 40,5 ± 10,5% i A549 og 38,3 ± 4,6% i NCI-H460 (p 0,01 henholdsvis). Når cellene ble behandlet med 320 uM 18β-GA, ble en større hemmende virkning på celleformering er vist, som prosent av levedyktige celler var under 30% sammenlignet med ubehandlede kontroller (p 0,001). Derfor, viste det seg at 160 uM 18β-GA var en optimal konsentrasjon for å oppnå en betydelig undertrykkelse av celleproliferasjon i NSCLC-celler.
A og B, MTS Forsøkene viste at 18β-GA hemmet celleproliferasjon av A549 og NCI -H460-celler på en doseavhengig måte. Videre økte 18β-GA cytotoksisitet av kjemoterapeutisk middel cisplatin. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo. * P 0,05, ** p 0,01. C, Western blot analyse viste øket spaltes PARP (85 kDa) med redusert full lengde PARP (116 kDa) i A549 og NCI-H460-celler ble behandlet med 18β-GA. GAPDH (37 kDa) tjente som lasting kontroll. D, Flowcytometrisk analyse av celle apoptose. Prosent av celler i tidlig eller sent apoptose er gitt i nedre høyre og øvre høyre kvadrant, henholdsvis. Tallene er representativt resultat valgt fra tre uavhengige eksperimenter.
Cisplatin er en del av standarden på omsorg for pasienter med lungekreft. For å bestemme muligheten for at 18β-GA kan ha en additiv effekt til cisplatin på tumorcelleformering, ble begge cellelinjene som ble testet dyrket i nærvær av 5 ug /ml cisplatin alene eller 5 pg /ml cisplatin sammen med 80 pM 18β-GA. Ved behandling med cisplatin alene, ble den prosentandel av levedyktige celler bare redusert med 20,5 ± 6,8% i A549 og 38,7 ± 6,0% i NCI-H460 sammenlignet med kontrollgruppen (p = 0,076 og 0,041 henholdsvis figur 1A og 1B). Men når det kombineres med 80 mikrometer 18β-GA, hadde de en synergistisk effekt i begge cellelinjer. I begge cellelinjene, undertrykkelse sats etter kombinasjonsbehandling var under 40% i kontrollgruppen (p 0,01)., Tilsvarende effekt på 160 mikrometer 18β-GA alene
For å bekrefte dataene observert av MTS analyser og for å bestemme hvorvidt undertrykkelse av celleproliferasjon var delvis på grunn av en økning i apoptose, ble spaltet PARP målt ved Western blotting ved anvendelse av et polyklonalt kanin PARP-antistoff detektere både i full lengde og spaltede former. Som vist i figur 1C, behandling med 18β-GA 160 uM og 320 uM reduserte nivåer av full-lengde PARP og økte nivåer av spaltede-PARP. Dette resultatet ble også støttet ved flowcytometrisk analyse, som ble anvendt for å måle annexin-V merking til fosfatidylserin, en membranfosfolipid eksponert på overflaten av apoptotiske celler [19]. Etter 24 timers behandling med 160 mikrometer 18β-GA, ble cellene farget med annexin-V-fluoresceinisotiocyanat og PI. Som illustrert i figur 1D, er fraksjonen av celler i tidlig apoptose, vist ved PI-positive celler, var signifikant høyere i 18β-GA-behandlede grupper (ca. 3,5 ganger for A549, og omtrent 3,9-fold til NCI-H460, respektivt ; P 0,001). I tillegg ble mer apoptotiske celler funnet i behandling av cisplatin kombinert med 18β-GA enn behandling av cisplatin alene, ytterligere støtte som 18β-GA har en additiv effekt til cisplatin.
18β-GA hemmet TxAS uttrykk og aktivitet
Tidligere studier innblandet en potensiell rolle TxAS i patogenesen av flere ulike typer kreft, inkludert NSCLC [10], [16]. Vi undersøkte derfor om 18β-GA kan påvirke TxAS uttrykk og aktivitet. Western blot analyse viste at 18β-GA redusert TxAS proteinnivået i en tids- og doseavhengig måte (figur 2A og 2B). I samsvar med apoptotisk virkning av 18β-GA vist i figur 1, 12 h behandling av 18β-GA 160 uM og 320 uM dramatisk reduserte nivåer TxAS. Videre 18β-GA (160 pM) hemmet nivået TxAS så tidlig som 3 timer i NCI-H460 og 6 timer i A549 etter behandlingen. mRNA ble også hentet fra celler behandlet med 160 mikrometer 18β-GA i 6 timer, 12 timer og 24 timer, og deretter utsatt for real-time PCR eksperimenter. Figur 2C viser at TxAS mRNA-nivået ble signifikant redusert ved 18β-GA på en tidsavhengig måte, noe som er i samsvar med de data som er observert ved Western blot-analyse.
A og B, Western blot-analyse funnet at 18β -ga hemmet protein ekspresjon av TxAS (60 kDa) i en dose- og tidsavhengig måte. Actin (45 kDa) tjente som lasting kontroll. Figuren er representative for tre uavhengige eksperimenter, og densitometry for blotter ble vist i panelet til høyre for fig.A og den nedre panel av fig.B. * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med kontroll. C, real-time PCR viste at uttrykket av TxAS mRNA kunne bli redusert med 18β-GA i en tidsavhengig måte. Tør er uttrykt som fold av kontroll, som ble beregnet ved 2
-ΔΔCT metode basert på de data som er observert fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * P 0,05 og ** P 0,01. D og E, TxB2 EIA-analyser viste effektene av 18β-GA på TxAS aktivitet i både A549 og NCI-H460-celler i fravær eller nærvær av 0.4μM AA. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo. ** P 0,01 sammenlignet med kontroll, # p 0,01 sammenlignet med AA behandling
I tillegg ble effekten av 18β-GA på TxAS aktivitet målt i ettertid.. Som nevnt ovenfor, er TxA2 kjemisk ustabile in-vitro er TxAS aktivitet derfor overvåkes ved analysering av graden av TxB2, et stabilt produkt av den ikke-enzymatiske hydrering av TxA2 [16]. Både A549 og NCI-H460-celler ble behandlet med 160 uM 18β-GA i 24 timer, og kulturmediet ble samlet opp for å utføre TxB2 EIA-analyse. I disse eksperimentene ble cellene behandlet med 0,4 uM AA, som er forløperen til TxA2 tjente som positive kontroller, og cellene behandlet med spesifikke TxAS inhibitor furegrelate (1 mM) tjente som de ytterligere kontroller. De valgte doser av disse kjemikaliene er sammenlignbare med de konsentrasjoner som anvendes i in-vitro-eksperimenter rapportert i andre studier [16], [20]. Som vist på figur 2D og 2E, i begge cellelinjer, biosyntesen av TxA2 ble signifikant undertrykt av 18β-GA i fravær eller nærvær av AA. 0,4 mikrometer AA indusert TXB
2 produksjonen med 1,8 ganger i A549 celler (p 0,01) og 2,8 ganger i NCI-H460-celler (p 0,01) sammenlignet med kontroll. Men tillegg av 160 mikrometer 18β-GA betydelig svekket AA-indusert TXB
2 produksjonen med nesten 91% i A549 og 89% i NCI-H460 (p 0,001 henholdsvis). Viktigere, 18β-GA 160 mikrometer er tilsvarende i effekt til 1 mm furegrelate. Disse resultatene antyder sterkt at 18β-GA er i stand til å oppheve TxAS aktivitet hos NSCLC celler.
Sammen dataene på den 18β-GA kan hemme både uttrykk og aktivitet av TxAS innebærer at 18β-GA kan undertrykke celle spredning gjennom å hemme TxAS handling.
18β-GA hadde ingen ytterligere effekt på celleproliferasjon når TxAS ble slått ned
for å bekrefte muligheten for at 18β-GA kan undertrykke celleproliferasjon gjennom å hemme TxAS, vi slått ned TxAS uttrykk i A549 og NCI-H460-celler ved hjelp av siRNA transfeksjon og 160 mikrometer 18β-GA ble deretter tilsatt i 24 timer. Ikke-target siRNA ble også transfektert inn i begge cellelinjene for å tjene som kontroll. Real-time PCR indikerte at uttrykket av TxAS i begge cellelinjene ble betydelig undertrykt av 24 h transfeksjon av TxAS-siRNA, med nesten 90% av undertrykkelse effekt (figur 3A). Transfeksjon Effektiviteten ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse (figur 3B). Etter tilsetningen av 160 uM 18β-GA i ytterligere 24 timer, ble MTS analyser utført, og resultatene viste at spredningshastigheter på A549-celler behandlet med 18β-GA, TxAS-siRNA, og kombinasjon av begge var 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% og 35,4 ± 6,4% av kontrollene henholdsvis (figur 3C). I NCI-H460-celler, de var 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% og 28,4 ± 8,0% av kontroller, henholdsvis (figur 3D). Det viser seg at sammenlignet med TxAS-siRNA transfeksjon, ble den ytterligere tilførsel av 18β-GA ikke har noen betydelige tilleggs virkning på celleformering.
A og B, er å undertrykke effekten av siRNA på TxAS ekspresjon ble avslørt ved real -time PCR og Western blot analyse. Real-time PCR data ble observert fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer og beregnet av 2
-ΔΔCT metode. Data er presentert som en fold av kontroll, ** P 0,01. C og D, MTS analyser viste at TxAS-siRNA transfeksjon hemmet celleproliferasjon i A549 og NCI-H460, og den ytterligere tilførsel av 18β-GA hadde ingen additive effekter. Data er presentert som prosentandeler av kontroll og uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. ** P 0,01
Av notatet, slik at siRNA av TxAS betydelig redusert cellevekst, noe som er i tråd med de data som er observert i våre tidligere studier som viser at spesifikke TxAS inhibitor furegrelate kan dramatisk hemme. cellevekst i lungekreftceller [11], [16]. Til støtte for våre data, Cathcart MC et al viste at en annen TxAS inhibitor Ozagrel hemmet celledeling via induksjon av apoptose i NSCLC celler [10], og Moussa O et al viste at TxAS shRNA trykt blærekreft cellevekst [19]. Videre Nie D et al observert at prostata svulst cellemotilitet ble svekket av hemmere av TxAS [21].
Undertrykkelse av celleproliferasjon av 18β-GA var assosiert med TxAS status
Resultatene observert ovenfor understøttet at de inhiberende virkninger av 18β-GA kan skyldes undertrykkelse av TxAS i NSCLC-celler. For ytterligere å bekrefte denne muligheten, ved screenet vi en serie av lungecellelinjer for ekspresjon av TxAS. RT-PCR-eksperimenter viste at, sammenlignet med A549 og NCI-H460, en immortalisert human bronkial epitelcellelinje 16HBE-T og en annen NSCLC cellelinje NCI-H23 uttrykt minimalt nivå av TxAS (figur 4A). Disse to cellelinjer ble behandlet med økende konsentrasjoner av 18β-GA i 24 timer, og MTS analyse ble utført for å påvise celleformering. Som vist i figur 4B og 4C, 18β-GA mislyktes i å avskaffe celle proliferasjon i begge 16HBE-T og NCI-H23, om enn med en svak tendens til undertrykkelse. Undertrykkelsesgraden ved dose på 500 pM var ikke mer enn 20% av kontroll i begge cellelinjer.
A, minimalt nivå av TxAS i 16HBE-T og NCI-H23 og over-ekspresjon av TxAS i A549 og NCI-H460 ble avslørt av RT-PCR. Figuren er representative for tre uavhengige eksperimenter. B og C, MTS vist at mens det var en svak hemmende trend, 18β-GA unnlatt å kontrollere cellevekst i 16HBE-T og NCI-H23. Data er presentert som prosentandeler av kontroll og uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. D og E, TxAS ekspresjon i NCI-H23 ble over-uttrykt ved transfeksjon med pCMV6-TxAS plasmid. Real-time PCR data ble observert fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer og beregnet av 2
-ΔΔCT metode. Data er presentert som en fold av kontroll, ** P 0,01. F, MTS analyser viste at markedsføringen av celleproliferasjon ved transfeksjon med pCMV6-TxAS ble opphevet av 18β-GA. Data er presentert som prosentandeler av kontroll og uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. ** P 0,01 sammenlignet med kontroll, # p. 0,01 sammenlignet med pCMV6-TxAS transfeksjon
Fordi NCI-H23, som tilhører adenokarsinom, er en NSCLC cellelinje med minimal grad av TxAS, vi overuttrykt TxAS i denne cellelinje ved transfeksjon med pCMV6-TxAS plasmid. Ledig plasmid ble også transfektert for å tjene som kontroll. Figur 4D illustrert at TxAS ble over uttrykt om 8,2 ganger enn kontroll etter 24 timer transfeksjon med TxAS cDNA. Western blot-analyse ble også utført for å bekrefte den transfeksjon effekt (figur 4E). Celler ble deretter behandlet med 160 pM 18β-GA i ytterligere 24 timer. MTS-eksperimenter viste at transfeksjon med TxAS cDNA markant fremmet celleproliferasjon ved 181,4 ± 3,6% sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,001), effekten ble opphevet ved tilsetning av 18β-GA. Cellen proliferative hastighet ble signifikant redusert med 18β-GA til 111,2 ± 2,2% av kontroll, nesten selv med kontrollnivå (figur 4F). Disse funnene støtter at effekten av 18β-GA i NSCLC er assosiert med endring av TxAS uttrykk.
ERK /CREB signal var involvert i 18β-GA effekter
I våre tidligere studier, vi demonstrerte at aktivering av både ERK og CREB kan inhiberes av TxAS hemmere eller TP antagonister, og aktivering av CREB undertrykkes av spesifikk ERK-inhibitor [11], [16]. TxAS /ERK /CREB veien er også adressert av andre studier gjort i lungekreft modell [22], [23]. Derfor ble den siste serien av Western blotting eksperimenter gjort for å undersøke om ERK /CREB veien var involvert i tumor-undertrykkelse effekter av 18β-GA. Som vist på figur 5A, blir cellene transfektert med pCMV6-TxAS presenteres de høyere nivåer av fosforylert ERK1 /2 (p-ERK1 /2) og fosforylert CREB (p-CREB), effekten ble dramatisk dempes ved behandling av 160 uM 18β- GA. Resultatet er i tråd med de data som er observert ved MTS-analyser (figur 4F). I tillegg bestemmes vi effektene av 18β-GA for ERK /CREB-aktivering i A549 og NCI-H460, som begge viser høye nivåer av TxAS som vist i figur 4A. Figur 5B viste at nedregulering av TxAS ved siRNA blokkert ERK1 /2 fosforylering i A549 og H460-celler. Konsekvent, 160 pM 18β-GA effektivt undertrykkes de høye nivåene av p-ERK og p-CREB i disse to cellelinjene. Ingen forandring kunne påvises når det gjelder ekspresjon av total ERK eller total CREB i alle cellelinjene som ble testet.
A, Western blotting eksperimenter demonstrerte at aktivering av ERK1 /2 (42/44 kDa) og CREB (43 kDa) indusert av pCMV6-TxAS transfeksjon kan bli avskaffet av 18β-GA i NCI-H23 celler. Figuren er representative for tre uavhengige eksperimenter, og densitometry for blotter ble vist i panelet til høyre. * P 0,05 ** p 0,01 sammenlignet med kontroll; # P 0,05 og ## p 0,01 sammenlignet med 18β-GA behandling i celler transfektert med ledige plasmid. B, undertrykkelse av ERK1 /2 og CREB aktivering av TxAS-siRNA og 18β-GA i A549 og NCI-H460 ble avslørt av Western blot analyse. I disse eksperimentene, total ERK1 /2 (42/44 kDa), total CREB (43 kDa) og Actin (45 kDa) tjente som lasting kontroller. Et monoklonalt antistoff som kan gjenkjenne endogene nivå av p-CREB og den fosforylerte form av CREB-relaterte protein aktiverer transkripsjonsfaktor-1 (p-ATF-1) ble anvendt i denne studien. Figuren er representative for tre uavhengige eksperimenter, og densitometry for blotter ble vist i panelet til høyre. * P 0,05 i forhold til kontroll
Diskusjoner
Som en av urter som brukes ofte i orientalsk medisin med lav toksisitet, er lakris en US Food and Drug Administration (FDA) godkjente. forsupplement anvendes i mange produkter. Som nevnt ovenfor, er glycyrrhizic syre hoved bioaktive komponent, og det er lett hydrolyseres for å være 18β-GA i menneskekroppen for å utøve forskjellige virkninger, inklusive anti-kreft-aktivitet [1] – [4]. Denne studien demonstrerte tumorhemmende virkning av 18β-GA i NSCLC-celler, og TxAS ble funnet å være innblandet i denne effekten.
Vi viste først at 18β-GA doseavhengig redusert celleproliferasjon i NSCLC-celler A549 og NCI-H460. ID50 av 18β-GA i HepG2-celler var 80 pM [24], mens i vår modell dose på 160 uM redusert celleproliferasjon hastighet under 50% av kontroll, noe som er i samsvar med en tidligere rapport som viser at IC
50 verdien av 18β-GA var 145,3 mikrometer i en svært potensielt metastatisk lungekreft cellelinje PGCL3 [18]. 80 mikrometer 18β-GA i kombinasjon med cisplatin gitt en betydelig tumor-undertrykke effekt, på tross av 18β-GA alene på 80 mikrometer hadde ingen effektiv effekt for å drepe kreftceller. Dette resultatet tyder den synergistiske virkning av 18β-GA på kjemoterapeutiske middel. A549 viste høyere motstand mot cisplatin, sammenlignet med NCI-H460-celler, noe som er i samsvar med andre studier som viser at A549 er mer resistent overfor cisplatin, enn noen andre cellelinjer [25], [26]. Western blot-analyse ytterligere presentert den økede spaltet-PARP med redusert full-lengde PARP i celler behandlet med 18β-GA i doser på 160 uM og 320 uM. Dermed blir endringen i total levedyktig celleantall ved 24 timer etter behandling med 18β-GA bemerket i MTS-eksperimenter kan tilskrives økt apoptose, noe som bekreftes av de data som er observert ved strømningscytometrisk analyse. Samlet ser det ut til at 18β-GA er en lovende anti-kreft agent for anvendelse i NSCLC forebygging og behandling.
Vi fortsatte å undersøke de molekylære mekanismene 18β-GA utøver tumor-undertrykke effekt i NSCLC celler. I kraft av å katalysere dannelsen av TXA2 som virker gjennom dens reseptor TP har TxAS vist seg å ha en potensiell rolle i kreft fenotypen [10], [11], [14] – [16]. Viktigere, ble TxAS og dens produkt TxA2 funnet å være overuttrykt i lungekreft vev, sammenlignet med normale lungevev [9] – [11], [27]. En tidligere rapport som viser at 18β-GA er tilsvarende i effekt til en TP agonist i humane endotelceller [17] ledet oss til å spørre om TxAS ble innblandet i 18β-GA virkninger i NSCLC. Denne hypotesen ble også opplyst av en faktum at glycyrrhizic syre, forløperen til 18β-GA, virker til dels ved å hemme COX-2 [28], som gir PGH2 for TxAS for å katalysere dannelsen TxA2 [12], [29]. Sammen med resultatene at 24 timers behandling av 18β-GA doseavhengig undertrykte celleproliferasjon og indusert apoptose, reduksjon av TxAS med 12 h behandling av 18β-GA tyder på at 18β-GA-indusert hemming av TxAS er et oppstrøms tilfelle veksthemming og apoptose i NSCLC, som er videre støttet av følgende tidskurs eksperimenter. I tillegg kunne den mRNA-nivåer av TxAS bli redusert med 18β-GA på en tidsavhengig måte, noe som tyder på at 18β-GA inhibert TxAS uttrykk ved transkripsjonsnivået. Videre TxAS aktivitet, reflekteres av TxB2 nivå utskilt i kulturmediet, ble dramatisk hemmet av 18β-GA. Disse resultatene antyder at TxAS kan være en avgjørende molekylære basis for 18β-GA effekt i NSCLC-celler. Ved transfeksjon med TxAS-siRNA, celle proliferative evne til både A549 og NCI-H460 ble effektivt hemmet, noe som ytterligere støtter positiv rolle TxAS i lungekreft [10], [11], [16]. Viktigere, gjorde den ekstra tilførsel av 18β-GA ikke har additive effekter på TxAS-siRNA transfeksjon. For å bekrefte disse resultatene, vist vi en serie av lungecellelinjer for å bestemme ekspresjon av TxAS. NSCLC er alle typer epitelisk lungekreft annet enn småcellet lungekreft (SCLC), slik at vi brukte 16HBE-T, som er en immortalisert human bronkial epitelial cellelinje for å tjene som kontroll for NSCLC-cellelinjer. I samsvar med andre studier [9] – [11], TxAS nivået ble funnet å være minimal i 16HBE-T, mens det var over-uttrykt i NSCLC-celler A549 og NCI-H460. En annen NSCLC cellelinje NCI-H23 også uttrykt minimal grad av TxAS, noe som gjør den ideell modell for transfeksjon av TxAS cDNA. Som forventet, 18β-GA unnlatt å effektivt undertrykke celleproliferasjon av 16HBE-T og NCI-H23. Det viste seg at de forskjellige virkninger av 18β-GA i alle disse cellelinjene var på grunn av forskjellen i TxAS uttrykk.
