Abstract
Src og mammalian target of rapamycin (mTOR) signale er vanligvis aktivert i ikke- småcellet lungekreft (NSCLC) og dermed potensielle mål for kjemoterapi. Selv om kombinert bruk av Src inhibitor Dasatinib med andre kjemoterapeutika har vist overlegen effekt for kreftbehandling, er de mekanismene som fører til økt følsomhet for Dasatinib ikke helt forstått. I denne studien fant vi at Rapamycin dramatisk forbedret Dasatinib-indusert hemming av cellevekst og cellesyklus G1 arrest i human lunge adenokarsinom A549 celler uten å påvirke apoptose. De synergistiske effekter ble gående korrelert med oppregulering av cyklin-avhengige kinaser inhibitor proteiner, inkludert p16, p19, p21 og p27, i tillegg til undertrykkelse av Cdk4 ekspresjon og nuclear translokasjon. Mekanistiske undersøkelser viste at FoxO1 /FoxO3a og p70S6K /4E-BP1, molekylene på nedstrøms Src-PI3K-Akt og mTOR signalering, ble betydelig undertrykt av den kombinerte bruk av dasatinib og Rapamycin. Besøksforbud Src og mTOR med små interfering RNA i A549 celler ytterligere bekreftet at Src /PI3K /mTOR Pathway spilte en avgjørende rolle i å forbedre anticancer effekten av dasatinib. I tillegg ble dette funnet også bekreftet ved en serie av analyser ved anvendelse av ytterligere to NSCLC-cellelinjer NCI-H1706 og NCI-H460. Sikkert, våre resultater antydet at combinatory anvendelse av Src og mTOR-hemmere kan være et lovende terapeutisk strategi for NSCLC behandling
Citation. Chen B, Xu X, Luo J, Wang H, Zhou S (2015) Rapamycin forbedrer Anti-kreft effekt av Dasatinib ved å undertrykke Src /PI3K /mTOR Pathway i NSCLC Cells. PLoS ONE 10 (6): e0129663. doi: 10,1371 /journal.pone.0129663
Academic Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, USA
mottatt: 27 februar 2015; Godkjent: 11 mai 2015; Publisert: 10 juni 2015
Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Shanghai Municipal Natural Science Foundation (Grant N0.13ZR1434700) og Natural Science Foundation National of China (Grant N0.81301994). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den viktigste patologiske subtype av lungekreft som er den vanligste årsaken til død av kreft på verdensbasis [1]. Blant NSCLC pasienter, Src-familie kinaser (SFKs) er konstitutivt uttrykt eller aktivert [2,3]. Som et potensielt terapeutisk mål for NSCLC, kan Src spiller en viktig rolle i utviklingen av lunge adenocarcinomer via reguleringssignaler fra flere celleoverflatemolekyler, inkludert integrin, vekstfaktorer, og G-protein koblede reseptorer [4,5]. Prekliniske studier har vist at SFKs inhibering kan undertrykke proliferasjon, angiogenese, invasjon, og overlevelse av kreftceller [6-9]. Som spesifikk hemmer av Src har Dasatinib er godkjent for behandling av kronisk myelogen leukemi (KML), og det er nå til vurdering for klinisk bruk i lungekreft [10,11]. Men Dasatinib som monoterapi viste beskjeden klinisk aktivitet som var lavere enn det som vanligvis observeres i NSCLC pasienter som fikk kjemoterapi [11]. I kontrast, kombinasjonen av Dasatinib med cytostatika dukket opp mer lovende enn å bruke som monoterapi. Siden Src kan megle svulst motstand mot cytotoksisk kjemoterapi har Src hemming av Dasatinib vist seg å forbedre responsen av tykktarm og lunge kreftceller til cisplatin in vitro [12,13]. I tillegg oppnådde en fersk klinisk studie av Dasatinib i kombinasjon med erlotinib forbedret gunstig effekt av behandling hos pasienter med tidligere behandlet NSCLC [14]. Videre Dasatinib kan også legge til rette for kreft effekter av strålebehandling [15]. Selv om overlegen effekt har sterkt antydet at kombinasjonen med Dasatinib er av avgjørende betydning for NSCLC behandling, de mekanismene som fører til økt følsomhet for kjemoterapi er fortsatt kompleks og ikke fullt ut forstått. Gitt at Src modulerer signal transductions styrende spredning, invasjon, apoptose,
etc
. av kreftceller, er studier tyde reguleringen av Src aktivering og dets interaksjon med andre signalmolekyler i kreftbehandling særlig berettiget.
I tillegg Src, den mammalian target of rapamycin (mTOR) er også sterkt aktivert i mange lungekreft pasienter og representerer som et annet mål for terapi. Den mTOR signalveien driver mange store cellulære prosesser og er innblandet i et økende antall patologiske tilstander, inkludert kreft [16]. Nylig har foreløpige kliniske data indikerte en viss antitumoraktivitet av mTOR inhibitor Rapamycin og dens analoger ved noen kreftformer, inkludert NSCLC [17,18]. Spesielt, Rapamycin er også blitt undersøkt for sin evne til å gjenopprette sensitivitet av kreftceller til oppstrøms signalise målrettede midler [19]. Akt /mTOR-hemming Rapamycin eller dets derivater har dukket opp for å synergistisk forbedre cytotoksisitet av stråling og kjemoterapi, fremme induksjon av cellesyklus og apoptose [20,21]. På den annen side har det blitt vist at mTOR kunne aktiveres av Src-signalisering gjennom fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt sti [22-24]. Dette førte til den hypotese at kombinasjonen av Rapamycin med Src-hemmere, som Dasatinibs, kan rette anticancer aktivitet, og å være mer effektiv i kjemoterapi. En fersk studie viste at dual hemming av Src og mTOR var svært effektive på tumorregresjon i musemodeller av brystkreft [25]. Men ingen prekliniske data er for tiden tilgjengelig med deres combinatory anvendelse for behandling av lungekreft. Også den potensielle effekten av mTOR i reguleringen av Src signale fortsatt i stor grad uklart.
Her tar vi sikte på å undersøke combinatory terapeutiske effekten av Rapamycin og Dasatinib på lungekreft ved hjelp av menneskelige lunge adenokarcinomceller (A549), lunge plateepitel carcinom-celler (NCI-H1703) og stor-celle lungekreftceller (NCI-H460) som in vitro cellemodeller. I denne studien ble Dasatinibs-indusert hemming av cellevekst og cellesyklus-stans dramatisk forbedret ved samtidig behandling med Rapamycin, parallelt med og deretter oppregulering av cyclin-avhengige kinaser (CDK) inhibitor proteiner. Analyse på signalmolekyler viste at Src deaktivering ble effektivt tilrettelagt av mTOR-hemming via PI3K-Akt veien. Ved hjelp av små interfererende RNA mot Src og mTOR, observerte vi lik undertrykkelse til de fra de inhibitorer for celleproliferasjon, cellesyklusprogresjon, invasjon, migrering og i A549-celler. Videre våre resultater viste den synergistiske samspillet mellom Src og mTOR signalings hos NSCLC-celler, som foreslått lovende terapeutisk nytte av mTOR /Src dual hemming for NSCLC behandling.
Materialer og metoder
reagenser og antistoffer
Dasatinib og Rapamycin ble kjøpt fra Selleck Chemical (Shanghai, Kina). Primære antistoffer mot fosfor-Src (Tyr416), Src, fosfor-mTOR (Ser2448), mTOR, fosfor-PI3K (Tyr458), PI3K P85, fosfor-Akt (Thr308), Akt, fosfor-FoxO1 (Ser256), fosfor-FoxO3a (Ser253), fosfor-4E-BP1 (Thr37 /46), 4E-BP1, Cdk2, Cdk4, CDK6, og Alexa Fluor 555 konjugert antistoff ble hentet fra Cell Signal Technologies (Shanghai, Kina). Primære antistoffer mot CDK hemmer proteiner inkludert p16, p19, p21, p27, og β-tubulin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Shanghai, Kina). Antistoffer mot fosfor-p70S6K (Thr389 /412), p70S6K, ble kjøpt fra SAB Signalway (College Park, MD, USA). Sekundær HRP- eller FITC- konjugerte antistoffer, si-mTOR, si-Src, og transfeksjon reagenser ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Shanghai, Kina).
Cellekultur og behandling
human adenocarcinoma cellelinje A549, human lunge-skvamøs karsinom-cellelinje NCI-H1703, human stor cellelungecancercellelinje NCI-H460 og normal bronkial epitelcelle BEAS-2B ble anskaffet fra ATCC (Beijing, Kina) og dyrket i Dulbeccos modifiserte eagle medium (liv teknologi, Shanghai) supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Cellenummer, og levedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon, med minst 90% levedyktige celler før behandling eksponering. A549-celler ble behandlet med Dasatinibs (5, 10, 25, eller 50 nM) alene eller i kombinasjon med Rapamycin (20, 50, eller 100 nM) i 24 til 96 timer. Celler behandlet med 0,1% dimetylsulfoksyd (DMSO) ble anvendt som bærerkontroll.
celleproliferasjon og cellesyklusanalyser
For celleproliferasjonsanalyse, 10
4 celler per brønn ble sådd ut i 24 -vel plater og inkubert i 24 timer. Cellene ble behandlet med 5, 10, 15 eller 20 nM av Dasatinibs i nærvær eller fravær av Rapamycin (20, 50, eller 100 nM), og høstet ved 24, 48, 72 og 96 timer. Trypanblått eksklusjons analyser ble utført for å bestemme antall celler ved hjelp av en Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA).
For cellesyklusanalyse, celler i 6-brønners plater ble oppsamlet, skyllet og fast over natten i 75% kald etanol ved -20 ° C. Deretter ble cellene behandlet med Tris-HCl-buffer (pH 7,4) med 100 ug /ml RNase A og farget med 25 ug /ml propidiumjodid (PI) (Liv teknologi, Shanghai, Kina). Ti tusen celler ble kjøpt og analysert ved flowcytometri (BD FACSCalibur, CA, USA) basert på DNA innhold.
apoptose analysen
1 × 10
6 celler ble behandlet med DMSO ( 0,1%), Dasatinibs (10 nM) alene eller i kombinasjon med Rapamycin (100 nM) i 96 timer. Cell apoptose hastigheten ble bestemt av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I (BD Biosciences, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens anvisninger. Fluorescent intensitetene av alle probene ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri (BD FACSCalibur, CA, USA).
Sanntids kvantitativ PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens og behandlet med DNase ifølge produsentens instruksjoner. Første cDNA ble syntetisert ved hjelp av M-MLV revers transkriptase og oligo-dT primer (Invitrogen, Shanghai, Kina). Kvantitative real-time PCR-analyser ble utført i 96-brønners optiske plater på en ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Lifetechnology, Shanghai, Kina) med SYBR Grønn qPCR Master Mix (Qiagen, Shanghai, Kina). Uttrykk for P16, P19, P21, P27, Cyclin A /D1 /E og CDC25A mRNA ble normalisert mot at 18s RNA. Primer sekvenser for Real-Time PCR-analyser ble oppført i S1 tabell.
Western blotting
Homogenatprøvene proteiner (20 mikrogram) fra hver behandlede celler ble løst på SDS-polyakrylamidgeler og elektro overført til Immobilon-P polyvinylidenedifluoride membraner. Deretter ble membranene inkubert med spesifikke antistoffer mot CDK-inhibitor proteiner (p16, p19, p21 og P27), cdk2 /4/6, gaffelhodeboks proteiner (FoxO1 og FoxO3a), det fosforylerte eller total Src, PI3K, Akt, mTOR, p70S6K og 4E-BP1, henholdsvis. Beta-tubulin ble brukt for normalisering av protein lasting. Etter inkubasjon med pepperrot (HRP) konjugert IgG antistoff, ble membraner utviklet ved hjelp av ECL Western blotting deteksjonsreagensen (Thermo, Beijing, Kina). Densitometriske målinger av bandene som ble utført med Antall Ett program (Bio-Rad, Beijing, Kina).
Cell immunfluorescens farging
Etter å ha sådd i 12-brønns plate i 24 timer, A549 celler ble behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinibs (10 nM) alene eller i kombinasjon med Rapamycin (100 nM) i 48 timer. Cellene ble vasket og fiksert med 0,4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur, deretter inkubert med primære antistoffer mot fosforylert Src eller Cdk4 over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene inkubert med FITC-merket eller Alexa Fluor 555 konjugert sekundært antistoff. Deretter ble cellekjernen farget med PI og deretter observert med Cytation 3 flere bildesystem (BioTek, VT, USA).
Små interfering RNA (siRNA) transfeksjon
A549 celler ble sådd i en brønns vevskulturplate med 2 x 10
5 celler per brønn i 2 ml antibiotika-fritt medium og inkubert i 24 timer. I henhold til fremstillingen instruksjon, ble celler inkubert med transfeksjon medium inneholdende Si-Src, si-mTOR eller styre siRNA i 8 timer. Deretter ble transfeksjonen ble mediet erstattet med friskt komplett medium normal, etterfulgt av ytterligere inkubering i 24 til 72 timer. Deretter ble cellene samlet opp for assayer på celleproliferasjon, cellesyklus og western-blotting, henholdsvis
celle invasjon assay
celle invasjon analysen ble utført ved anvendelse av trans-brønners kamre (Matrigel-belagte membran. for invasjon, BD Biosciences, Shanghai, Kina). En total av 5 x 10
5-celler ble sådd ut i det øvre kammer med serumfritt medium og behandlet med 0,1% DMSO, Dasatinibs (10 nM) alene eller i kombinasjon med Rapamycin (100 nM). Deretter ble cellene tillatt å invadere mot 10% FBS som en kjemoattraktant i det nedre kammer i 24 timer. Celler i det øvre kammer ble forsiktig fjernet ved hjelp av bomullsdott, og cellene i bunnen membranen ble fiksert og farget med atom fast red. Numrene på invaderte celler ble tellet under mikroskop, og den prosentvise invasjon ble beregnet ved celler invaderer gjennom Matrigel matriksen og membranen i forhold til den invasjon av celler i kontrollgruppen.
sårheling assay
celler ble sådd ut i 24-brønners vevskulturplater, og nådde 70-80% konfluens som et monolag etter 24 timers vekst. Monolaget ble langsomt og forsiktig skrapet med en ny 1 ml pipette over midten av brønnen. Så godt var vask to ganger med medium for å fjerne frittliggende celler. Etter påfylling av godt med friskt medium, ble cellene behandlet og dyrket i ytterligere 18 timer. Monolagcellene ble fotografert under en omvendt fasekontrastmikroskop.
Statistisk analyse
Alle data som representere i det minste tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av en programvarepakke SPSS 16,0 og analysert med enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en post-hoc Dunnetts test der det passer. Den statistiske signifikans ble satt til p-verdiene 0,05 (*), eller 0,01 (**).
Resultater
Rapamycin forbedret hemmende effekt av dasatinib på celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon i A549 celler
Som vist i figur 1A, Dasatinib på farmakologisk relevante nivåer markert redusert celletall på A549-celler i en konsentrasjonsavhengig måte. Bemerkelsesverdig, ko-behandling med Rapamycin (50 og 100 nM) betydelig forbedret Dasatinibs-mediert veksthemming i A549-celler, ved at 10 nM av Dasatinibs pluss 100 nM av Rapamycin kan oppnå like størrelser av anticancer-aktivitet enn Dasatinibs alene ved at konsentrasjonen av 50 nm. Resultater om timelige effektene av Dasatinib med Rapamycin indikerte at A549 celleproliferasjon ble betydelig hemmet av Dasatinib (10 nM) gjennom 96 timer etter behandling (fig 1B). Viktigere, co-behandling med Rapamycin (100 nM) ytterligere redusert celletall på så tidlig som 48 timer, noe som tyder på det markert synergistisk effekt i forhold til behandling av Dasatinib selv. Imidlertid Rapamycin alene viste mindre undertrykkelse på vekstkurven av kreftceller.
(A) Et konsentrasjonsavhengig effekt av Rapamycin på anticancer-aktivitet av Dasatinibs i A549-celler. Som beskrevet i «
Methods
«, A549-celler ble behandlet med vehikkel-kontroll (0,1% DMSO) eller Dasatinibs (5, 10, 25, og 50 nM) i nærvær og fravær av Rapamycin (20, 50 og 100 nM). Levedyktige celler ble analysert etter 72 timer etter ko-behandling. (B) Effekter av Rapamycin på de tidsmessige endringer av Dasatinib-indusert veksthemming i A549 celler. Celler ble behandlet med vehikkel-kontroll (0,1% DMSO), Dasatinibs (10 nM) med eller uten Rapamycin (100 nM). Celletall ble målt ved 0, 24, 48, 72 og 96 timer etter behandlingen. (C) Effekter av dasatinib og Rapamycin på cellesyklus distribusjon. A549-celler ble behandlet med Dasatinibs (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 96 timer og analysert ved flow-cytometri etter PI farging. Resultatene er uttrykt som den gjennomsnittlige prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M fase fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Effekter av dasatinib og Rapamycin på apoptose i A549 celler. Cellene ble behandlet med dasatinib (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 96 timer og de apoptotiske priser ble bestemt ved flowcytometri med Annexin-V og PI farging. Kolonner, mener av tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0.01.
Tidligere studier har vist at både Src og mTOR er ofte konstitutivt aktivert i akutt myelogen leukemi (AML) celler og dermed utgjøre potensielle terapeutiske mål. For eksempel kan den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) inhibitor erlotinib indusere cellesyklus-stans ved G1 fase ved inhibering av onkogene signalisering via Src og mTOR [26]. I overensstemmelse, resultatene fra cellesyklusanalyse på A549-celler viste at Dasatinibs (10 nM) signifikant øket andelen av celler ved G1 fase sammenlignet med kontrollgruppen (figur 1C), som tyder på en direkte arrest av cellesyklusutvikling av Src inhibering i kreftceller. I motsetning til dette, Rapamycin (100 nM) alene oppviste liten virkning på fordelingen av celler i forskjellige cellesyklusfaser. Men tilstedeværelsen av Rapamycin i ko-behandling med Dasatinibs markert øket celleprosent på G1 fase, noe som resulterer i betydelig blokkering av G1 /S overgang og celle mitose. Resultatet var konsistent med den synergized inhibisjon av cellevekst ved Dasatinibs og Rapamycin i kombinasjon. Samtidig ble virkningen av Dasatinibs og Rapamycin på celle apoptose ble også evaluert i A549-celler, men ingen signifikant forskjell fra celle apoptose hastighet observert blant behandlingene med kontroll, Dasatinibs eller Rapamycin (Fig 1 D), noe som tyder på at Rapamycin og Dasatinibs hadde mindre effekt på apoptose i A549 celler.
Rapamycin forsterkes Dasatinib å opp-regulere CDK inhibitor proteiner og ned-regulere Cdk4
G1 cellesyklus arrest styres av flere faktorer, inkludert cykliner, celledeling syklus protein ( CDC), CDK og CDK hemmer proteiner. Vår foreløpige studien viste at de uttrykk for cyclin A /D1 /E og Cdc25A ikke ble vesentlig endret av dasatinib og Rapamycin på mRNA og proteinnivåer (S1 Fig). Som for CDK-inhibitorer, øket Dasatinibs ekspresjon av p16, p19, p21 og både mRNA (figur 2A) og protein (figur 2B) plan, med statistisk forskjell fra kontrollgruppene. Interessant, co-behandling med Rapamycin markant fremmet Dasatinib-indusert oppregulering av p16, p19, p21 og p27, men Rapamycin alene syntes å ha liten innvirkning på uttrykket av disse CDK inhibitor proteiner. Som konsekvens, ble ekspresjonen av Cdk4 dramatisk undertrykt ved kombinasjonen av Dasatinibs og Rapamycin, men hverken Cdk2 eller CDK6 syntes klart reagerer på behandling (Fig 2B).
A549-celler ble behandlet med vehikkel-kontroll (0,1 % DMSO) eller Dasatinibs (10 nM) i nærvær og fravær av Rapamycin (100 nM) i 24 timer. (A) Relativ ekspresjon av CDK-inhibitor proteiner (P16, P19, P21 og P27) på mRNA-nivå. Kolonner, mener av tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Uttrykk for CDK inhibitor proteiner, CDK og FoxOs bestemmes av western blotting. (D) Lokalisering av Cdk4 bestemt ved immunofluorescens farging. Representative bilder indikert farging av Cdk4 (rød), nucleus (blå), og de fusjonerte bilder.
For ytterligere å bekrefte effekten av dasatinib og Rapamycin på CDK hemmer proteiner, uttrykk og distribusjon av Cdk4 i A549 celler ble ytterligere analysert ved immunfluorescens farging. Normalt Cdk4 bindes til cyklin D for å danne et kompleks i cytoplasma, og deretter samler seg på kjernemembranen og translocate inn i kjernen når cellene går gjennom G1 /S-fasen. Vår Resultatet viste at Cdk4 hovedsakelig er lokalisert i kjernen i A549-celler; Men de ble delvis deponeres i cytoplasma under behandling med dasatinib (Fig 2C). Videre er translokasjon av Cdk4 inn i kjernen var betydelig blokkert ved behandling med Dasatinibs og Rapamycin i kombinasjon. Tatt sammen, disse resultatene konsekvent foreslått at inhibering av cellesyklusprogresjon ved Dasatinibs og Rapamycin ble mediert gjennom oppregulering av CDK-inhibitor-proteiner, så vel som nedregulering av Cdk4 i A549-celler.
Tidligere rapporter har vist at p19, p21 og p27 ble transcriptionally regulert av FOXOs, som senere har vist seg som nedstrøms mål for PI3K /AKT [25,27]. Det ble nylig rapportert at p16 kan også regulert av Src-AKT veien i mobilnettet senescence i menneskelige prostata kreft celler [28]. I denne studien vårt resultat indikerte at fosforyleringen nivåene av FOXO1 og FOXO3a ble også markert øket ved ko-behandling sammenlignet med det som blir indusert ved enten Src eller mTOR-inhibitor alene (figur 2B). Dessuten var resultatet parallelt med uttrykket av CDK-inhibitorer. Derfor spekulerte vi at oppregulering av CDK hemmere av dasatinib og Rapamycin ble trolig tilskrives Src og PI3K /AKT sti.
Rapamycin synergized med Dasatinib i å undertrykke PI3K-Akt-mTOR signalering i A549 celler
den siste studien viste at Src fosforylering kan lette aktiveringen av Akt-mTOR signalveien i AML celler [29]. For å undersøke potensialet for interaksjon mellom Src og mTOR trasé, analyserte vi aktivering av Src, PI3K, AKT, og mTOR i rekkefølge. For det første, den immunofluorescens farging av fosfo-Src indikerte at Src-aktivering ble inhibert med Dasatinibs og mer signifikant undertrykt av samtidig behandling med Rapamycin (figur 3A), hvilket antyder at mTOR inhibering av Rapamycin kan virke synergistisk med Dasatinibs undertrykke Src aktivering i A549 cellene . Og dette resultatet ble ytterligere bekreftet ved western-blotting (figur 3B). I tillegg er våre data viste at hemming av Src ved Dasatinib kan også undertrykke aktivering av PI3K-Akt signalisering i A549 celler, noe som var i samsvar med tidligere rapporter [29]. Enda viktigere, inhiberingene av Src, PI3K, og AKT ble enstemmig forsterket ved tilstedeværelse av Rapamycin i sammenligning med Dasatinibs alene, som vist på figur 3B og 3C. Det var verdt å merke seg at resultatet ble godt korrelert med observasjoner vedrørende uttrykk for CDK hemmer og gaffelhode boks proteiner (fig 2B), som avtalt med våre spekulasjoner om sammenhengen mellom cellesyklus arrest og Src-PI3K-AKT deaktivering. På den annen side, farging og Western blotting resultater indikerte at Src-aktivering ble inhibert av Rapamycin, til en mindre grad enn Dasatinibs. Disse data underforstått at mTOR som ble konvensjonelt anerkjent som den responsive målet for PI3K /AKT signalering, kan også spille en viktig rolle i reguleringen av Src aktivering.
A549 celler ble behandlet med kjøretøy kontroll (0,1% DMSO) , Dasatinibs (10 nM) med eller uten Rapamycin (100 nM) i 24 timer. Homogenatet proteiner (20 ug) fra hele cellelysatet ble oppsamlet og anvendt for Western blotting. (A) Aktivering av Src bestemt ved immunofluorescens farging. Representative bilder indikert farging av Src (rød), nucleus (blå), og de fusjonerte bilder. (B) Aktiveringen av Src, PI3K, og Akt bestemt ved western blotting. (C) Densitometry kvantifisering av Src, PI3K og Akt-fosforylering i A549-celler. (D) Aktiveringen av mTOR signale bestemt ved western blotting. (E) Densitometry kvantifisering av mTOR, p70S6K og 4E-BP1 fosforylering i A549 celler. Dataene presentert gjennomsnittlig relativ fosforylering forhold til den ubehandlede kontroll fra tre uavhengige eksperimenter. Kolonner, mener av tre bestemmelser; barer, SD. * P 0,05, ** p 0.01.
Deretter ble aktivering av mTOR fastsatt ved bruk av western blotting på fosforylerte nivåer av mTOR. Som forventet, ble aktivering av mTOR signifikant inhibert av inhibitoren Rapamycin. Selv Dasatinib utstilt moderat effekt i å undertrykke mTOR aktivering, kombinasjonen med Rapamycin bemerkelsesverdig avansert hemming som indusert av Dasatinib alene (Fig 3D og 3E). Videre fosforylering av p70S6K og 4E-BP1, de kjente mål på nedstrøms av mTOR vei, ble både betydelig undertrykt av Rapamycin og de ble også ytterligere redusert med kombinasjonen med Dasatinib. Sammen er disse resultatene antydet at Rapamycin synergized med Dasatinib i undertrykkelse av PI3K-Akt-mTOR signalveien i A549 celler.
Dual undertrykkelse av mTOR og Src av sirnas indusert cellesyklus arrest og veksthemming i A549 celler
for å validere den potensielle interaksjonen mellom Src og mTOR signalering, vi videre undersøkt endring av fosforylering nivåer av PI3K /AKT, og uttrykket nivåer av CDK hemmer proteiner i A549 celler med kunstig knock-down av Src eller mTOR . Som vist i figur 4A, den tilbakeholdende ekspresjon av Src eller mTOR ved sirnas betydelig undertrykt fosforyleringen nivåene av PI3K /AKT og p70S6K /4E-BP1, respektivt. Derimot er ekspresjonsnivåene av CDK-inhibitor proteiner, inkludert p16, p19, p21 og p27, ble alle tilsynelatende forhøyet ved Si-mTOR-eller Si-Src (figur 4B). I avtalen ble uttrykket av FoxO1 også økt, mens Cdk4 betydelig redusert. Enda viktigere, den doble knock-down av mTOR og Src betydelig fremmet inhibering av PI3K /AKT, p70S6K /4E-BP1, og resulterte i opp-regulering av CDK-inhibitor proteiner, sammenlignet med hvert Si-mTOR eller si-Src alene. Resultatene var i overensstemmelse med våre funn i A549-celler behandlet med Rapamycin og Dasatinibs.
(A) Aktiverings nivåene av PI3K, AKT, og mTOR bestemt ved western blotting. A549-celler ble transfektert med Si-Src, si-mTOR, eller kontroll siRNA i 8 timer, etterfulgt av en forlenget inkubasjon på 24 timer. Homogenatet proteiner (20 ug) fra hele cellelysatet ble oppsamlet og anvendt for Western blotting. (B) Ekspresjon av CDK-inhibitor proteiner (p16, p19, p21 og p27), FoxO1, og Cdk4 bestemt ved western blotting. (C) Effekter av Si-mTOR og si-Src på cellesyklusprogresjonen. A549-celler ble transfektert med Si-Src, si-mTOR, eller kontroll siRNA i 8 timer, etterfulgt av en forlenget inkubasjon på 24 timer. Deretter ble cellene samlet og analysert ved hjelp av strømningscytometri med PI farging. Resultatene er uttrykt som den gjennomsnittlige prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M fase fra tre uavhengige eksperimenter. Resultatene ble uttrykt som den gjennomsnittlige prosentandelen av celler i G0 /G1, S og G2 /M fase fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Effekter av si-mTOR og si-Src på de tidsmessige endringer av celleproliferasjon. A549-alen ble transfektert med Si-Src, si-mTOR, eller kontroll siRNA i 8 timer, og deretter inkubert med normal medium i 72 timer. Celletall ble målt ved 0, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0.01.
I tillegg knock-down av mTOR og Src resultert i tilsvarende cellesyklus arrest til at indusert av de spesifikke hemmere rapamycin og dasatinib. Som vist på figur 4C, dual inhibering av mTOR og Src ved sirnas induserte mer signifikant suppresjon av cellesyklusutvikling ved G1 fase i A549-celler i forhold til begge si-mTOR eller Si-Src alene. Videre er celleformering ble også påvirket på tilsvarende måte med det som blir indusert ved de kjemiske inhibitorer (figur 4D). Det var bemerkelsesverdig at si-mTOR alene også indusert moderat G1 arrest og veksthemming i A549 celler, muligens på grunn av sin høyere effekt ved å trykke mTOR enn som pålegges av Rapamycin. Kollektivt, si-mTOR betydelig forbedret cellesyklus arrest og veksthemming som indusert av si-Src i A549 celler, som støttet våre funn om den forbedrede kjemoterapeutiske effekten av Dasatinib i kombinasjon med Rapamycin.
Rapamycin forbedret hemmende effekten av Dasatinib på celle invasjon og migrasjon i A549 celler
for ytterligere å bekrefte forsterke effekten av Rapamycin på anticancer aktivitet Dasatinib, undersøkte vi invasjonen og migrasjon av A549 celler under ulike behandlinger. Som vist i figur 5A, er invasive egenskaper gjennom Matrigel-belagte filtre av celler behandlet med Dasatinibs ble signifikant redusert sammenlignet med kontrollcellene. Den ko-behandling av Dasatinib med Rapamycin ytterligere redusert invasjonen prosent av A549-celler med nesten 50%, mens Rapamycin alene ikke oppviser tydelig undertrykkelse på celle invasjon når sammenlignet med kontrollen.
(A) Representative bilder ( øvre panel) og kvantifisering (nedre panel) av invaderende celler. Som detaljert med «celle invasjon assay» i «
Methods
», ble A549-celler behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinibs (10 nM) alene eller i kombinasjon med Rapamycin (100 nM) i 24 timer. Antallet invaderende celler ble tellet under mikroskop og dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, * p 0,05, ** p 0,01. (B) Representative bilder av sårtilheling forsøk i A549-celler som ble behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinibs (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 18 timer. (C) Ekspresjon av MMP-2/9 og E-cadherin bestemt ved Western-blotting på A549-celler som ble behandlet med DMSO (0,1%), Dasatinibs (10 nM) eller Rapamycin (100 nM) i 24 timer.
i tillegg ble effekten av Dasatinibs og Rapamycin om overgangen evnen til A549-celler som vurdert ved sårheling analyse ved bruk av fysisk skadde celler (figur 5B). Ved 18 timer etter å ha blitt oppskrapet, de ubehandlede A549 cellene effektivt overført inn i snittet, og effekten av Rapamycin alene på cellemigrering først begrenset. I motsetning til dette, ble migrerings åpenbart inhiberes ved behandling med Dasatinibs. * P * P * P
