Abstract
Menneskelig prostata kreftvaksine og genterapiforsøk ved hjelp av
ex vivo
metoder til prime dendrittiske celler (DCS) med prostata spesifikt membranantigen (PSMA) har vært noe vellykket, men å dato den lange
ex vivo
manipulering av DC har begrenset utbredt klinisk nytten av denne tilnærmingen. Vårt mål var å forbedre kreft vaksinasjon med tumorantigener ved å levere PSMA
via
en CD40-rettet adenovirus vektor direkte til DC som et effektivt middel for aktivering og antigen presentasjon til T-celler. For å teste denne tilnærmingen, har vi utviklet en musemodell av prostatacancer ved å generere klonale derivater av mus RM-1 prostatacancer cellelinje som uttrykker human PSMA (RM-1-PSMA-celler). For å maksimere antigen presentasjon i målceller, ble både MHC klasse I og TAP protein uttrykk indusert i RM-1 celler ved transduksjon med en annonse vektor uttrykker interferon-gamma (
Ad5-IFNy
). Administrering av DC-infiserte
ex vivo
med CD40-rettet
Ad5-huPSMA
, så vel som direkte intraperitoneal injeksjon av vektor, resulterte i høye nivåer av tumorspesifikke CTL-responser mot RM-1- PSMA celler forbehandlet med
Ad5-IFNy
som målceller. CD40 targeting betydelig forbedret den terapeutiske antitumor effekt av
Ad5-huPSMA
koding PSMA når den kombineres med
Ad5-IFNy
i RM-1-PSMA modell. Disse resultater antyder at en CD-målrettet levering av adenovirus PSMA kan være effektive klinisk for prostata cancer immunoterapi
relasjon:. Williams BJ, Bhatia S, Adams LK, Boling S, Carroll JL Li X-L, et al. (2012) Dendritic Cell Basert PSMA Immunterapi for prostatakreft ved hjelp av en CD40-målrettet Adenovirus Vector. PLoS ONE 7 (10): e46981. doi: 10,1371 /journal.pone.0046981
Redaktør: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekniske universitet-Dresden, Tyskland
mottatt: 24 januar 2012; Godkjent: 11 september 2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Williams et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Feist-WEILLER Cancer Center, Louisiana Gene Therapy Forskning Consortium, og tilskudd fra National Institutes of Health-National Cancer Institute (2R42-CA114921) og National Institutes of Health-National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (5R33-AI076096). Disse organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Imre Kovesdi er styreleder av styret og administrerende direktør Office of VectorLogics, Inc., David T. Curiel er Chief Scientific Officer og grunnlegger av VectorLogics, Inc., og Nikolay Korokhov ble ansatt som seniorforsker ved VectorLogics, Inc. under utførelsen av arbeidet. Dette arbeidet bruker teknologi basert på US-patent 6,841,540 med tittelen «Immunmodule ved genmodifisering av dendrittiske celler og B-celler» som innebærer en CD40-rettet rekombinant adenovirus vektor for genetisk manipulering av dendrittiske celler og B-celler. Ingen produkter i utvikling, eller markedsført produkter er knyttet til dette arbeidet. Denne konkurrerer interesse endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft rangerer andre blant de ledende kreftrelaterte dødsfall i USA hos menn , og anslagsvis 240,890 nye tilfeller og 33,720 dødsfall vil ha oppstått i 2011 [1]. Selv behandlinger er tilgjengelig for organ begrenset karsinom av prostata, er det ingen effektiv måte å behandle tilbakevendende sykdom etter androgen deprivasjon terapi svikter. Dette krever utvikling av nye strategier for å bekjempe denne sykdommen. Nyere rapporter tyder på undertrykkelse av prostata tumorvekst er mulig etter vaksinasjon strategier bruker vaksiner som koder tumorantigener [2], [3]. Prostata spesifikt membran antigen (PSMA) er et type II membranprotein med folat-hydrolase-aktivitet uttrykt primært i prostata epitel og et begrenset antall andre celletyper. Dette veldefinert prostata uttrykk er signifikant forhøyet i prostatakreft, særlig i avanserte stadier [4]. Således er PSMA en gunstig potensielt mål for prostata cancer immunoterapi. Flere PSMA-baserte vaksiner hadde blitt utviklet og kliniske studier tyder på at disse immunterapi tilnærminger kan trygt administreres og kan indusere immunresponser hos pasienter med avansert karsinom av prostata [5], [6]. Men begrensede kliniske respons observert så langt garanterer en alternativ vaksinasjons paradigme.
dendrittiske celler (DCS) er profesjonell APC som spiller en potent rolle i initiering av immunrespons ved å aktivere T-celler. Det er kjent at interaksjonen av CD40 med DC gjennom T-hjelperceller som uttrykker CD40-ligand (CD40L) kan hjelpe til med deres modning som i sin tur utløser CTL-respons. Tidligere rapporter har vist at
ex vivo
DC-baserte vaksiner kan indusere spesifikke anti-tumor T-celle responser hos pasienter [7], [8], [9]. Til tross for disse kliniske suksesser, er denne tilnærmingen begrenset fra utbredt klinisk anvendelse fordi manipulere DCs gjennom
ex vivo
kultur og antigen lasting er arbeidskrevende, dyrt og tidkrevende. Likeledes
ex vivo
forberedt DCs viser begrenset migrasjon til lymfeknutene for påfølgende aktivering av T-celler [10]. Dette problemet har blitt løst ved å
in situ
lasting av DC med tumorassosierte antigener ved hjelp av viral og ikke-virale vektorer [11]. Blant de virale vektorer, har rekombinante adenovirale vektorer (ADS) fått mye oppmerksomhet for kreftterapi på grunn av deres høye kapasitet og robust genekspresjon [12]. Likevel, Ad vektorer dårlig infisere DC på grunn av mangel på uttrykk for Coxsackie og adenovirus reseptor formidling smittsomme opptak [13]. Denne begrensning kan overvinnes ved hjelp av et bispesifikt adapter-molekyl som omfatter en blanding av et ekstracellulært domene av det native Coxsackie og adenovirus-reseptor-reseptoren og mus CD40 ligand bundet av en trimerisasjonsmotiv fra T4-bakteriofag fibritin protein 14,15. Mer nylig ble denne adapter brukt med hell for DC-basert immunterapi i en musemodell for melanom [16], [17]. Imidlertid har andre tumor /antigen kombinasjoner ikke testet.
I denne studien har vi undersøkt en dendrittiske cellen målrettet annonse vaksine som uttrykker humant PSMA
in vivo
i en musemodell for prostatakreft . Vi genererte en immunkompetente modellen ved hjelp av RM-1 mus prostatakreft cellelinje som danner svulster i syngene C57BL6 mus [18], av konstitutivt uttrykker det humane PSMA antigen. Heri, viser vi at
in vivo
levering av en CD40-rettet Ad5 vektor fører til økt cytotoksiske T-celle respons og forbedret terapeutisk effekt i denne modellen. Vi viser også at IFNy som et immunologisk adjuvans i vårt vaksine regime øket antigen-presentasjon i målceller og maksimert denne effekten.
er vist en representativ vekstkurve av antall RM-1-celler (•) i kultur med tid sammenlignet med antallet av RM-1-PSMA-klon 1-celler (▾), RM-1-PSMA-klon 3-celler (⧫), og RM-1-GFP klone 2-celler (▪). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± standard feil av tre uavhengige eksperimenter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr som brukes i denne studien fikk human behandling basert på retningslinjer fastsatt av American Veterinary Association samt i samsvar med
guide for omsorg og bruk av forsøksdyr
(institutt for forsøksdyr~~POS=TRUNC Research, Washington, DC). De eksperimentelle protokollene som involverer levende dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité LSU Health Sciences Center på Shreveport (protokoll P-10-040). Alle forsøk ble gjort for å minimalisere dyr lidelse, for å redusere det antall dyr som brukes og for å utnytte alternativer til
in vivo
teknikker, hvis den er tilgjengelig.
Proteinekstrakter (20 ug) ble fremstilt fra hvert cellelinje og fortynnet med RIPA-prøvebuffer. Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulose og probet med et anti-humant PSMA antistoff rettet mot den C-terminale proteinsekvens (A) eller et anti-humant PSMA antistoff rettet mot den N-terminale proteinsekvens (B) , etterfulgt av behandling med tilsvarende anti-art IgG-HRP-konjugater. Vist er representative blotter etter visualisering ved autoradiografi.
Cellelinjer
RM-1, en androgen-insensitive MHC klasse I-mangelfull mus prostatakreft cellelinje, som er syngene i C57BL /6 mus [18], ble hentet fra Dr. Timothy C. Thompson (Baylor College of Medicine, Scott Department of Urology, Houston, Texas). Det humane transform embryoniske nyre HEK-293-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Cellene ble holdt ved 37 ° C og en 5% fuktet CO
2 atmosfære i Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM, Mediatech Inc .; Manassas, VA), inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Gemini Bioproducts, Woodland, CA) og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Mediatech Inc .; Manassas, VA).
(A) Proteinekstrakter ekstrakter~~POS=HEADCOMP (20 ug) ble fremstilt fra dyrkede muse dendrittiske celler etter infeksjon i 24 timer med CD40- målrettet
Ad5-luc1
eller CD40-rettet
Ad5-mPSMA
uttrykker mus PSMA eller
Ad5-huPSMA
uttrykke menneskelige PSMA. (B) Protein ekstrakter (20 mikrogram) ble fremstilt fra dyrkede mus dendrittiske celler etter infeksjon for 0, 24, eller 48 timer med CD40
Ad5-huPSMA
uttrykke menneskelige PSMA. Hver celleekstrakt ble fremstilt ved anvendelse av RIPA-prøvebuffer. Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulosemembraner og probet med et anti-humant PSMA-antistoff etterfulgt av behandling med de tilsvarende anti-mus IgG HRP-konjugater. Vist er representative blotter etter visualisering ved autoradiografi. En lastekontroll ble brukt av co-behandling av membraner med en anti-mus α-tubulin antistoff.
Dyr
Mann C57BL /6 mus på 4-6 ukers alder ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
Evaluering av binding av anti-MHC klasse i (H-2 dB og H-2Kb) antistoffer mot (A) RM-1 parentale celler, (B) RM-1-GFP klone 2-celler, (C) RM-1-PSMA klone 1-celler, og (D) RM-1-PSMA-klon 3-celler. Vist er histogram topper tilsvarende ubehandlede (skyggelagt) og celler infisert med
Ad5-IFNy product: (uten skygge).
Generering RM-1 tumorceller som uttrykker rekombinant humant PSMA og GFP
Menneske forlengelse faktor 1α-subenheten promoter (EF-1α) ble valgt som et transgen promoter. Den menneskelige PSMA og GFP-kodende sekvenser ble klonet inn pEF1 /Myc-His-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). -Konstruksjoner med den korrekte restriksjonsmønster ble valgt ut og sekvensert, og ble anvendt for transfeksjon av RM-1-celler. Cellene ble så valgt ved 0,8 mg /ml G418 (Alexis) i 2 uker for å oppnå enkelt klon. Ekspresjon av rekombinant human PSMA ekspresjon i antibiotika-resistente kloner ble bestemt ved Western blot-analyse (ved anvendelse av metoden beskrevet nedenfor) med en anti-PSMA monoklonale antistoffer som gjenkjenner den N-terminale ende (7E11C5, tidligere renset fra et hybridom erholdt ved ATCC) eller C- -terminalen (YPSMA-en, Abcam, Cambridge, MA). To kloner uttrykte påvisbart nivå av PSMA (RM-1-PSMA-klon 1 og RM-1-PSMA-klon 3). De ble formert og frosset for videre analyse. De RM-1 kloner uttrykker GFP ble identifisert ved fluorescens mikroskopi. En positiv klon (RM-1-GFP klon 2) ble ekspandert og frosset for videre analyse.
Proteinekstrakter (20 ug) ble fremstilt fra hver cellelinje og fortynnet med RIPA-prøvebuffer. Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulose og probet med (A) et anti-mus-antistoff TAP1 eller (B) et anti-mus TAP2-antistoff, etterfulgt av behandling med en tilsvarende anti-mus IgG HRP-konjugater. Vist er representative blotter etter visualisering ved autoradiografi. En lastekontroll ble benyttet ved ko-behandling av membraner med en anti-muse-GAPDH-antistoff.
Vist er en representativ kurve av cellelevedyktighet i (A) RM-1-celler, eller (B) RM-1-PSMA klone 3-celler infisert i kultur med økende konsentrasjoner av
Ad5-IFNy
sammenlignet med uinfiserte celler. Effekt av cellelevedyktigheten ble bestemt på dag 1 (•), dag 2 (▾), dag 3 (⧫), og dag 4 (▪) etter initiering av infeksjon med
Ad5-IFNy
. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± standard feil av tre uavhengige eksperimenter.
adenovirusvektorer
Ad5-huPSMA
ble konstruert ved subkloning av humane PSMA cDNA-kodende sekvens inn i MfeI – BstXI- stedene i pAdenoVatorCMV5 shuttle vektor (QBiogene, Carlsbad, California). Den resulterende pAdenoVatorCMV5-hu-PSMA shuttle vektor ble brukt til å konstruere en adenovirus ved homolog rekombinasjon med pAdEasy1 (som inneholder E1 og E3 slettet Ad5 ryggrad) i
E. coli
ved anvendelse av metoder tidligere beskrevet [19]. Den resulterende rekombinant plasmid ble linearisert med Pac jeg og transfektert i HEK-293 celler til å generere
Ad5-huPSMA
virus.
Ad5-luc1
, et menneske Ad serotype 5 vektor som inneholder en ildflue luciferase uttrykk kassett innenfor E1 slettet regionen ble gitt av Dr. Igor Dmitriev (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO).
Ad5-IFNy
, et menneske Ad serotype 5 vektor, som består av en E1-slettet menneskelig serotype 5 Ad med en kylling β-aktin promoter driver uttrykk for mus IFNy cDNA ble gitt av Dr. Hirofumi Hamada (Institutt for molekylær medisin, Sapporo Medical University, Sapporo, Japan). Adenovirus stocks ble propagert og amplifisert ved å bruke den humane embryonale nyretransform HEK-293 cellelinjen. Høy titer adenovirus stocks ble renset ved anvendelse av en Adenopure rensesett (Puresyn, Inc., Malvern, PA). Etter rensing virus ble kvantifisert ved hjelp av en Adeno-X Rapid Titer Kit (BD Biosciences, Palo Alto, California). Virusene ble dialysert over natten i dialysebuffer (kaliumfosfat-bufret saltoppløsning inneholdende 1 M sukrose og 0,5% β-cyklodekstrin) ved 4 ° C før lagring ved -80 ° C.
Mus ble immunisert som beskrevet i Materialer og metoder med dendrittiske celler infisert med CD40-rettet
Ad5-luc1
eller med CD40-rettet
Ad5-huPSMA
. På dag 24 etter initiering av forsøket ble dyrene avlivet, og CTL-aktivitet ble målt i celler høstet fra milten. Målceller som ble brukt var RM-en foreldre (•), RM-1-PSMA klone 1 celler (▾), RM-1-PSMA klone 3 celler (⧫), og RM-1-GFP klone 2 celler (▪). Målceller var enten ubehandlet (A og C) eller pre-behandlet av infeksjon med
Ad5-IFNy plakater (B og D). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± standardavvik av fire replikate brønner.
CD40 målsiktingsliganden
A rekombinant molekylær adapter protein bestående av det oppløselige ekstracellulære domenet av Coxsackie og adenovirus-reseptor koblet til mus CD40 ligand via en trimerzation motiv (CFm40L) ble konstruert, fremstilt og renset som beskrevet tidligere [14], og som brukes til å målrette videre adenovirale vektorer til mus DC.
mus ble immunisert som beskrevet i Materialer og Metoder med CD40-rettet
Ad5-luc1
eller med CD40-rettet
Ad5-huPSMA
. På dag 24 etter initiering av forsøket ble dyrene avlivet, og CTL-aktivitet ble målt i celler høstet fra milten. Som en kontroll, ble CTL-aktivitet målt i celler høstet fra miltene av naive (ubehandlet) mus. Målceller som ble brukt var RM-en foreldre (•), RM-1-PSMA klone 1 celler (▾), RM-1-PSMA klone 3 celler (⧫), og RM-1-GFP klone 2 celler (▪). Målceller var enten ubehandlet (A, C og E) eller pre-behandlet av infeksjon med
Ad5-IFNy plakater (B, D og F). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± standardavvik av fire replikere brønner.
Western blot-analyse av TAP Expression
Kontroll RM-1-celler og RM-1-celler som var inkubert i 24 timer med
Ad5-IFNy
på mangfaldet av infeksjon (MOI) på 100 IFU /celle ble høstet og lysatene ble utarbeidet i RIPA prøvebuffer. Proteinkonsentrasjoner av prøvene ble normalisert ved Bradford-analysen. Prøvene ble kjørt på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert i 1 time med 5% bovint serumalbumin (BSA) og vasket med TTBS (1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann). Deretter ble membranene inkubert med anti-mus TAP1, anti-mus TAP2, eller anti-muse-GAPDH-antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time. Etter tre etterfølgende vaskinger med TTBS, ble membranene inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert geit-anti-mus-IgG-antistoff i 1 time, og vasket tre ganger i 30 minutter hver med TTBS. Til slutt ble membranene er utviklet ved bruk av ECL substrat (Amersham, Piscataway, NJ), og eksponert for røntgenfilm
(A) cytotoksisk aktivitet av NK-effektorceller på YAC-1 og RM-1 target-celler. ble bestemt av en
51 Cr-release assay på angitte E: T-forhold. Målceller som ble brukt var YAC-1 (•), RM-en foreldre (▾), RM-1 foreldre celler forbehandlet av infeksjon med
Ad5-IFNy plakater (▪), RM-1-PSMA klone 3 celler (⧫), eller RM-1-PSMA klone 3 celler forbehandlet av infeksjon med
Ad5-IFNy plakater (▴). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± standardavvik av fire replikate brønner. (B) Strømningscytometri-analyse av YAC-1 og RM-1-celler farget med PE-merket anti-H60, anti-MULT-1 eller anti-Rae-1-antistoffer, eller med en isotype-matchet kontrollantistoff. Tallene nedenfor histogrammene tilsvarer bety fluorescens intensitet av hver topp.
Antitumoreffekt av CD40-rettet
Ad5-huPSMA
vaksine ble bestemt ved bruk av RM-1-PSMA musemodell . Mus ble immunisert som beskrevet i Materiale og metode med CD40-rettet
Ad5-luc1
eller CD40-rettet
Ad5-huPSMA
. På dag 24 etter initiering av eksperimentet, hver mus mottok 4 x 10
6 RM-1 parentale celler eller 4 x 10
6 RM-1-PSMA klone 1-celler injisert subkutant. Tre dager senere ble de behandlingsgruppene injisert på stedet av tumorcelleinjeksjon med 1 × 10
8 IFU av
Ad5-IFNy
eller med vanlig saltvann. Begynnelsen på tidspunktet for tumorcelle utfordring (dag 0), ble tumorene målt og volumer ble beregnet ved formelen:
tumorvolum =
½ x (
lengde
x
bredde
2), hvor lengden er den lengste avstand av tumoren. Hvert datapunkt representerer den gjennomsnittlige volumet av 15 svulster ± standard feil.
flowcytometrisystemer Analyse av MHC klasse I Expression
RM-1 celler (foreldre samt RM-1- PSMA-kloner som uttrykker human PSMA) ble analysert for celleoverflate-ekspresjon av MHC klasse i (Db og Kb). Kort sagt ble RM-1-celler infisert i 24 timer med
Ad5-IFNy
ved MOI 100. Ved 24 timer etter inkubering, ble cellene høstet og immunostained ved hjelp av et fluorescein isothiocyanat (FITC) merket anti-muse-H -2Kb /H-2db antistoff (BD Biosciences, San Jose, CA). Dette antistoff reagerer med mus H-2Kb MHC klasse I alloantigen haplotype og kryss-reagerer med H-2 dB, men reagerer ikke med andre haplotyper. Celler ble inkubert med antistoff (1:1000 fortynning) i 20 minutter ved 4 ° C og vasket 3 ganger i iskald PBS. En isotype antistoff (mus lgG2a, κ) ble også brukt til å immunfarging av cellene som en negativ kontroll. Deretter ble cellene fiksert i 1% paraformaldehyd i 5 min i mørke, ble vasket to ganger med iskald PBS og resuspendert i 200 pl PBS-buffer for å bli analysert ved flow-cytometri (FACSCalibur; BD Biosciences)
Klar benmargavledede DC
benmargavledede DC ble generert fra 4 til 6 uker gamle C57BL /6 hannmus. DC ble dyrket som tidligere beskrevet [20] med noen modifikasjoner. DC ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS (Atlanta Biosciences), med 10 ng /ml hver av rekombinant granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-4 (IL-4) fra Peprotech Inc. (Rock Hill, NJ). På dag tre av kulturen, ble friskt medium tilsatt til DC-kulturer. På dag 6 av kultur, ble DCs utsatt for 4 timer til CD40-målrettet på nytt
Ad5-huPSMA
på MOI 100. Deretter ble DCs modnet ved inkubasjon med 100 ng /ml lipopolysakkarid (LPS, Sigma, St Louis, MO) over natten. De modne DC ble vasket to ganger med PBS og administreres ved intraperitoneal (ip) injeksjon i C57BL /6 mus.
immunrespons etter vaksinering ved hjelp av DC stimulert
ex vivo
med Ad5-huPSMA
musene ble vaksinert med Ad-infiserte DC (1 x 10
6 celler /mus) suspendert i steril PBS i et totalvolum på 50 ul av ip injeksjon på dag 0 og 14. På dag 24 ble musene avlivet og miltene ble høstet. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt ved maling av milten i serumfritt RPMI-medium med saks og skånsom gjentatt pipettering, etterfulgt ved å føre suspensjonen gjennom 100 pM nylonnetting. De røde blodceller ble lysert med lyseringsbuffer, og de rensede T-celler ble vasket to ganger i serumfritt medium, telles og sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
6-celler per brønn i 24-brønners plater i 500 ul serumfritt medium.
immunrespons etter direkte Vaksinasjon
in vivo
med Ad5-huPSMA
C57BL /6 mus ble immunisert ved direkte ip injeksjoner med
Ad5-huPSMA
. Hver mus ble injisert med 1 × 10
9 IFU av
Ad5-huPSMA
alene eller 1 × 10
9 IFU av
Ad5-huPSMA
kompleks med 1200 ng CFm40L på dag 0. En andre dose ble administrert 14 dager senere. Ved 24 dager etter den første immunisering ble musene avlivet og miltene ble oppsamlet og T-celler dyrket som beskrevet ovenfor.
Generering av CTL og utøvende cytotoksisitetstester
Dyrkede T-celler fra mus miltene ble re-stimulert i 6 dager ved tilsetning av bestrålte HEK-293-celler infisert med
Ad5-huPSMA
til over uttrykke PSMA antigen. Etter re-stimulering, ble T-cellene høstet og separert fra de døde cellene. Cytotoksisiteten ble bestemt i en standard 4-h kromfrigjøringsanalyse ved å bruke de stimulerte T-celler som effektorceller (E) og RM-1-cellelinjer som spesifikke mål (T) ved den indikerte E: T-forhold. RM-en cellelinjer (RM-1-PSMA klone en, RM-1-PSMA klone tre, og RM-1-GFP klone 2) ble brukt direkte som målceller eller tidligere var inkubert i 24 timer med
Ad5 -IFNγ product: (MOI 100). Cellene ble merket med 100 uCi av Na
2
51CrO
4 i 1,5 timer ved 37 ° C. Deretter ble 1 x 10
3 merkede målceller ble ko-dyrket med forskjellige antall effektor-celler i en 96-brønns (V-bunn plater) i 4 timer ved 37 ° C. Ved slutten av dyrkingen, ble 100 ul av supernatantene samlet og radioaktiviteten ble målt i en gamma-teller. Maksimal og spontan frigjøring av
51Cr ble oppnådd fra supernatantene av målcellene i 1% Nonidet P-40, og i medium henholdsvis alene. Alle forsøkene ble utført med kvadruplikat-brønner. Den
51Cr-frigjøring ble målt med en gammateller (LKB Instruments, Gaithersburg, MD), og prosent spesifikk lyse ble beregnet ved følgende formel:
% spesifikk lysis = [(eksperimentell cpm – spontan cpm) /(maksimal cpm – spontan kpm)]
×
100
flowcytometrisystemer Analyse av NKG2D Ligand Expression
RM-1-PSMA. klone 3-celler og YAC-1-cellene ble sådd ut på 100.000 celler /brønn i 24-brønners vevskulturskåler. Cellene ble latt bli koblet ved inkubering over natten ved 37 ° C. Dagen etter ble cellene inkubert i fravær eller nærvær av
Ad5-IFNy
på 100:1 MOI ved 37 ° C i serumfritt medium. Ved 2 timer etter infeksjon, ble virusinneholdende medium erstattet med komplett vekstmedium inneholdende 10% FBS. Etter 48 timer ble den ubehandlede eller
Ad5-IFNy
behandlede celler ble høstet og vasket to ganger med PBS. Cellene ble inkubert i 1 time ved 4 ° C med fykoerytrin (PE) merket rotte-IgG
2A isotype kontroll-antistoff (R La Jolla, California). Data ble ansett som statistisk signifikant når P . 0,05
Resultater
RM-1 Mouse prostatakreft cellelinjer som uttrykker Menneskelig PSMA
full-lengde human PSMA cDNA sekvensen ble klonet inn i pattedyr-ekspresjonsplasmid vektor pEF1 /V5-His nedstrøms for enhancer /promotorelementer fra det humane elongeringsfaktor 1α subenhet (HEF-1α) for ekspresjon på høyt nivå i pattedyrceller. Som en negativ kontroll, grønt fluorescerende protein (GFP) cDNA ble også klonet inn i pEF1 /V5-His ekspresjonsvektor. Musen prostatakreft-cellelinje RM-1 ble transfektert med ekspresjonsvektorene, og individuelle kloner ble isolert ved G418-seleksjon etterfulgt av begrensende fortynning. Tre individuelle kloner ble isolert: RM-en-PSMA klone en og RM-1-PSMA klone tre uttrykke menneskelige PSMA cDNA og RM-1-GFP klone to uttrykker GFP cDNA.
