Abstract
Den molekylære anstand GRP78 /BIP er en viktig regulator av proteinfolding i det endoplasmatiske retikulum, og det spiller en sentral rolle i kreft celle overlevelse og chemoresistance. Inhibering av dens funksjon har derfor vært en viktig strategi for å inhibere tumorcellevekst i kreftterapi. Tidligere arbeidet for å oppnå dette målet har brukt peptider som binder seg til GRP78 /BiP konjugert til pro-narkotika eller celle-døden-induserende sekvenser. Her beskriver vi et peptid som induserer prostatatumor celledød uten behov for noen konjugering sekvenser. Dette peptid er en sekvens avledet fra cochaperone Bag-1. Vi har vist at denne sekvensen interagerer med og hemmer aktiviteten av refolding GRP78 /BiP. Videre har vi vist at den modulerer den ufoldede protein respons i ER stress som resulterer i PARP og caspase-4 spalting. Prostata kreft celler som stabilt uttrykker dette peptid viste redusert vekst og økt apoptose i
in vivo
xenograft tumormodeller. Aminosyresubstitusjoner som ødela binding av sekken-1 peptid til GRP78 /BiP eller nedregulering av ekspresjonen av GRP78 kompromittert den hemmende effekten av dette peptid. Denne sekvensen representerer derfor en kandidat bly peptid for anti-tumor terapi
Citation. Maddalo D, Neeb A, Jehle K, Schmitz K, Muhle-Goll C, Shatkina L, et al. (2012) En Peptid Ukonjugert GRP78 /BiP Ligand modulerer utbrettet Protein Response og induserer Prostate Cancer Cell Death. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10,1371 /journal.pone.0045690
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 20 januar 2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 01.10.2012
Copyright: © Maddalo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Association for International Cancer Research, Storbritannia; den tyske Science Foundation, EU 6. rammeprogram PRIMA, og oppstart midler fra Karlsruhe Institute of Technology. Danilo Maddalo var en mottaker av et Marie Curie stipendiat CANCURE i EU 6. rammeprogram. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glukose reguleres protein GRP78 (også kjent som BIP immunoglobuling tung kjede bindende protein) er et medlem av heat shock protein familie og spiller en viktig rolle i å opprettholde cellulære homeostase [1]. Det er nøkkelen regulator av den ufoldede protein respons (UPR), en sti aktivert ved akkumulering av utfoldete peptider under stressende forhold som varmesjokk, acidose, nærings sult og hypoksi [2].
GRP78 regulerer UPR ved å binde de transmembrane sensor proteinene Perk (PKR lignende endoplasmatiske retikulum-resident kinase), ATF6 (som aktiverer transkripsjonsfaktor 6) og IRE1α (inositol-krever enzymet α) (oversikt i [3]) fører på den ene side til en økt transkripsjon av molekylære anstand som GRP78 seg selv, GRP94 og protein-disulfid-isomerase (PDI) [4], [5] og på den annen side til proteinsyntesen avslutning av fosforylering av alfa-underenhet av den eukaryote initiering faktor eIF2α [6]. Som en konsekvens av disse to effekter, vinne celler å bli overbelastet med avvikende peptider og de overleve [7]. Imidlertid aktiverer forlenget eIF2α fosforylering transkripsjonsfaktor ATF4 [8], [9] som fører til økte nivåer av de pro-apoptotiske faktor CHOP (C /EBP homologt protein) [10], [11]. Aktivering av ER-stress-mediert apoptose resulterer i spalting av caspsase 4, en ER-spenning spesifikk caspase, og av PARP (poly (ADP) -ribosome polymerase) [12], [13].
GRP78 er overuttrykt i flere typer tumorer så som prostata [14], bryst [15], [16] og tykktarm, og dets ekspresjon korrelerer ofte med dårlig prognose [17], [18], [19]. Imidlertid GRP78 nedregulering av siRNA øker apoptose og sensitizes celler overfor kjemoterapeutiske medikamenter [20], [21]. Generelt transformerte celler oppregulere GRP78 nivå [15] for å overleve de ugunstige forhold med svulsten mikromiljøet [22], [23], [24]. Flere terapeutiske midler har derfor vært rettet mot UPR eller mot GRP78 /BiP å dempe tumor cellevekst [25], [26] men virkelig selektive hemmere er ennå ikke identifisert [15]. I et søk etter ytterligere hemmere av GRP78 /BiP som vil være av terapeutisk relevans, har vi brukt informasjon om reguleringen av ER stress ved cochaperone Bag-1 [27] for å identifisere en sekvens fra Bag-en som binder seg til og hemmer handling av GRP78 /BIP.
Bag-en er en familie på fire polypeptider (Bag-1L, -1 m, -1 og -1S) med multifunksjonelle domener som kommuniserer med og regulerer virksomheten til ulike cellulære proteiner [ ,,,0],28]. Disse proteinene har avvikende N-terminale sekvenser, men et felles sentralt ubiquitin-lignende domene som danner en kobling for Hsc /Hsp70 til proteosomet [29] og en konservert C-terminale Hsp70 bindende domene (også kjent som den BAG domene) som binder til Hsp70 /Hsc70 og fungerer som en nukleotid-utveksling faktor [30], [31]. Bag-1 er også blitt vist å regulere endoplasmatiske retikulum (ER) stress-fremkalt apoptose [27], og til å binde GADD34, en komponent av ER stress [32], men detaljene i sin virkning er ikke kjent.
i denne kommunikasjonen viser vi at Bag-en binder seg til GRP78 /BiP gjennom et peptid overlapp sin ubiquitin-lignende domene. Vi viser videre at GRP78 /BiP bindende peptid av Bag-1 hemmer virkningen av GRP78 /BiP og griper med UPR som fører til induksjon av apoptose. Vi har begrenset dette peptid og identifisert en kjerne motiv av syv aminosyrer som vises avgjørende for binding til GRP78 /BIP og for den negative regulering av prostata svulst cellevekst. Denne kjernen sekvensen kan være utgangspunkt for fremtidige legemiddelselskap rettet mot hemming av GRP78 /BiP handling og av UPR.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig godartet prostatahyperplasi cellelinje BPH-en var dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med glutamin. PC3 og DU145-celler ble også dyrket i DMEM men uten glutamin 22Rv.1, LNCaP og PNT-2-celler ble dyrket i RPMI 1640. Alle de ovennevnte kulturmediet var supplert med 10% føtalt bovint serum. RWPE-1-celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium. Alle dyrkningsmedier ble holdt ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2.
Antistoffer
geit monoklonalt antistoff GRP78 (N20), kanin polyklonale antistoffer mot Bag-1 (C-16), eIF2α og fosfor-PERK ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland. Kanin polyklonale anti-GRP78 (ab21685), anti-GCN2 (ab37674), anti-PERK (ab65142), anti-fosfor-IRE1α (ab124945) antistoffer, kanin monoklonalt anti-phopsho-GCN2 (ab75836) antistoff og mus monoklonalt anti-β aktin (ab8226) antistoff ble kjøpt fra Abcam, Cambridge, UK. Mouse antistoff mot HA-tag (HA.11 klone 16B12) ble kjøpt fra Covance, München, Tyskland. Rat monoklonalt antistoff mot HA (3F10) ble kjøpt fra Roche, Mannheim, Tyskland. Antistoffer mot IRE1α, fosfor-eIF2α CHOP, PARP og ATF4 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, Tyskland. Anti-ATF6 antistoff ble kjøpt fra IMGENEX, Hamburg, Tyskland. Caspase 4 antistoff ble kjøpt fra MBL, München, Tyskland.
ekspresjonsvektorer og Plasmider
ekspresjonsvektor pcDNA3.1-HA-Bag-en koding Bag-en har tidligere blitt beskrevet av [ ,,,0],33]. Konstruksjonen som koder Bag-1Δ68mer (Bag-en mangler aminosyrene 202-269) ble opprettet ved utskifting av Sac II-XbaI fragment av Bag-en cDNA i en pcDNA3-Bag-en konstruksjon. Konstruksjonen pcDNA3-HA Bag-1 peptid (Bag1-L 202-269), N-terminal (bag-1L 202-241), C-terminal (bag-1L 241-269), 19-mer (bag-1L 202 -220), ΔUbi (Bag-1L 220-269) og 19-mer mutant (Bag-1L 202-220) peptider ble opprettet av PCR forsterkning med et HA-sekvens. Som en kontroll, innførte vi HA-sekvensen inn i pcDNA3-vektoren for å generere den tomme ekspresjonsvektoren pcDNA3.1-HA. pcDNA3.1 Bag-1ΔC47 (Bag-1 som mangler de siste 47 aminosyrer) ble klonet inn i BamHI-Xhol-setene av pcDNA3.1-HA-vektoren etter PCR-amplifikasjon ved anvendelse av pcDNA3.1-HA Bag-1 som templat. For GST-pull-down eksperimenter, pGEX4T.1-Bag-en 68mer sekvens, pGEX4T.1-N-terminal peptid, pGEX4T.1-C-terminal peptid, pGEX4T.1 Bag-1Δ Ubi, pGEX4T.1-19mer og pGEX4T.1-19mer mutanter ble laget ved å smelte PCR-amplifiseringsprodukter av den respektive Bag-1L-sekvensen i ramme med GST i vektoren pGEX4T.1. GST plasmider som koder for GST-smeltet GRP78, GRP78-ATPase (GRP78 1-408), ble GRP78-SBD (GRP78 409-651) og Bag-1 isoformer generert ved PCR og klonet inn pGEX4T.1 etter BamHI-XhoI fordøyelsen. Plasmidet pCMV6-GRP78 [34] ble kjøpt fra OriGene Technologies (Darmstadt, Tyskland).
Cell Transfeksjon, siRNA Knock-down og Western blotting
Med mindre annet er angitt, stabil transfeksjon ble utført i 22Rv.1 eller BPH-1-celler med 10 ug av plasmid-DNA ved bruk Fugene 6 ™ (Roche Diagnostics Mannheim, Tyskland) stabilt transfekterte celler ble selektert 22Rv.1 med 0,8 mg /ml, mens BPH-1-cellekloner ble selektert med 1,2 mg /ml G418. LNCaP, PC3, DU145, PNT-2 og RWPE-1-cellekloner ble selektert med 1 mg /ml G418. Spesifikk nedregulering av ekspresjon GRP78 ble oppnådd ved å transfektere siRNA-duplekser (GRP78:5′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 «) to ganger i 72 timer ved bruk av HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Tyskland). siRNA mot GFP (5»-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 «) ble anvendt som en kontroll. Western blot analyse ble utført som tidligere beskrevet [35].
Co-immunoprecipitation
22Rv.1 celler ble brukt for interaksjonsstudier av endogen Bag-en og GRP78 /BiP, mens det for
in vivo
interaksjon av sekken-1 peptid og GRP78 /BiP, HEK-293-celler ble transfektert med et plasmid som koder for HA-merket Bag-1-peptid. Tjuefire timer før eksperimentet ble cellene i begge tilfeller ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og behandlet med 20 mM ditiobis (succinimidyl propionat) (DSP) i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset med 20 mM Tris, og cellene ble lysert i 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,4% NP40 og 1% protease inhibitor cocktail. Immunoutfelling av GRP78 /BiP ble utført over natten ved 4 ° C med anti-GRP78-antistoff koblet til Sepharose A-kuler (Abcam, ab21685). Binding av endogene Bag-en eller av HA-peptid ble bestemt ved Western blotting ved hjelp av en Bag-en eller en HA spesifikt antistoff.
Protein Expression og Prøvepreparering
En TEV protease-spaltbare GB1 -fused Bag-en peptid ble uttrykt i
Escherichia coli
stammen BL21 (DE3) plys S. Uniform merking med
15N for NMR-spektroskopi ble oppnådd ved å dyrke bakterier i minimal medium supplert med 0,5 g /l
15NH
4Cl. Den GB1-His
6-tagget protein ble renset over en Ni-NTA kolonne (Qiagen, Hilden, Tyskland), deretter fordøyd med rekombinant TEV protease og gikk over en andre Ni-NTA kolonne for å fjerne både fusjon tag og hans
6-tagget protease. Til slutt ble protein bufferen byttet til 20 mM kaliumfosfat, 100 mM NaCl, pH 6,8. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved å sammenligne intensiteten av en 1D NMR-spektrum med den til en referansestoff (DSS, 2,2-dimetyl-2-silapentane-5-sulfonsyre).
GST-HA-merket N-terminale og C-terminale peptider ble produsert ved hjelp av standard protokoll. GST-delen ble spaltet av ved fordøyelse med trombin i henhold til produsentens protokoll (Roche, Mannheim, Tyskland). Det resulterende, urene peptid preparat ble ytterligere renset ved omvendt fase HPLC (C18-kolonne, 250 x 10 mm, Grace) med en vann /acetonitril lineær gradient. Identiteten og renheten av de oppsamlede fraksjoner ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri (Bruker Autoflex III). PH ble nøytralisert før lyofilisering. Peptidet ble oppløst i 20 mM KPO
4, pH 6,8. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet fra den optiske tetthet ved 275 nm ved anvendelse av absorbansen av tyrosiner i HA-taggen.
CD-spektroskopi
CD-spektra av peptidene ble registrert på et Jasco J- 810 spectropolarimeter (Jasco Co., Tokyo, Japan) ved 20 ° C, ved anvendelse av en vann-termostatstyrt kyvetteholder. Konsentrasjonene av Bag-1, N-terminale og C-terminale peptider var 17 uM, 12 uM og 11 uM, respektivt. CD-spektrene er gjennomsnitt av tre skanner ved en scanninghastighet på 10 nm min
-1, 4 s responstid og 1 nm båndbredde, og de ble glattet ved den adaptive utjevning metode som er en del av Jasco Spectra Analysis programvare . Bufferen bidraget ble trukket.
NMR eksperimenter
Protein konsentrasjon for NMR eksperimentet var 0,5 mm. For kjemisk skift kalibrering, og for å sammenligne relative signalintensiteter, ble 0,2 mM DSS (2,2-dimetyl-2-silpentane-5-sulfonsyre) tilsatt.
15N-HSQC spektra ble kjøpt til 23 ° C på et Bruker Avance II 600 spektrometer (Bruker, Karlsruhe) utstyrt med et bredbånd triple resonans føler med 4 skanninger per tilvekst og totalt trinn 128 i indirekte dimensjon. Data ble behandlet med NMRPIPE [36] og analysert ved hjelp av NMR VIEW.
FluorescencePolarization Analyser
FluorescencePolarization analysene ble utført ved hjelp av en Infinite F-200 leser (Tecan) med eksitasjon ved 490 nm og utslipp på 535 nm.
Tumor Xenotransplantat studier
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til europeiske og tyske forskrifter. For generering av xenograft-modeller 5 x 10
6 LNCaP-celler ble resuspendert i en løsning av 50% Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Tyskland) i PBS eller 5 x 10
6 22Rv.1 celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant i begge flanker av 6-8 uker gamle athymiske nakne mus. Tumorstørrelse ble målt med en passer hver uke. Tumorer avledet fra injeksjons av stabile kloner overekspresjon Bag-1 peptidet ble analysert i løpet av en periode på 9 uker mens svulster fra celler transfektert med den tomme ekspresjonsvektoren eller som uttrykker N-terminal, C-terminal og 0,05
A. UPR modulasjon på Bag-en peptid overekspresjon. Sammenslåtte kloner av 22Rv.1 celler transfektert med pcDNA3.1-HA-Bag-en 68 aminosyre peptid eller en tom ekspresjonsvektor ble behandlet med 300 nM thapsigargin (TG) for de angitte tidspunkter. Celler ble lysert og utsatt for Western blot-analyse ved anvendelse av de angitte antistoffer eller fosfo-spesifikke antistoffer. B. Bag-en peptid sensitizes 22Rv.1 celler til ER-stress indusert apoptose. Sammenslåtte kloner av 22Rv.1 transfektert med Bag-1 peptid eller tomt ekspresjonsvektoren ble behandlet med thapsigargin (TG) eller glukose-sultet (GS) i 24 timer. Cellene ble lysert og utsatt for Western blot-analyse ved anvendelse av anti-PARP og caspase 4 spesifikke antistoffer. Anti-HA-antistoff ble anvendt for å påvise HA-Bag-1-peptid. Anti-β-aktin-antistoffet ble benyttet for å vise like lasting av proteinprøvene. C. GRP78 downregulation øker PARP cleavage. Samlede kloner av 22Rv.1 uttrykker HA-merket Bag-en peptid eller et tomt uttrykk vektor ble transfektert med GRP78 /BiP siRNA eller kontroll GFP siRNA. Cellene ble lysert og Western blot ble utført med anti-PARP, anti-GRP78 og anti-HA-antistoffer. β-actin antistoff ble brukt til å bestemme nivået av protein lastet på gelen.
Flere studier har vist at GRP78 /BiP samarbeider med PDI i refolding denaturert protein
in vitro product: [ ,,,0],41], [42]. For å avgjøre om GRP78 /BiP også besitter evnen til å folde denaturerte proteiner
in vivo
, vi vedtatt en refolding analysen brukt tidligere for å bestemme anstand aktivitet Hsp70
in vivo product: [43] I denne assay, HEK-293-celler ble transfektert med et plasmid som koder for en luciferase-gen og et ekspresjonsplasmid for GRP78 /BiP. Cellene ble kortvarig varmesjokk og deretter luciferase-aktivitet av de transfekterte celler som uttrykker GRP78 /BiP ble sammenlignet med den til de ikke-GRP78 /BiP uttrykkende celler. Denne studien viste at overekspresjon av GRP78 /BiP betydelig forbedret luciferase-aktivitet etter varmesjokk (figur 2D), som viser evnen til GRP78 /BiP for å refolde denaturert luciferase
in vivo
. Hvis cellene ble også transfektert med Bag-en eller den 68 aminosyre Bag-1 peptid som binder GRP78 /BiP, refolding aktiviteten av GRP78 /BiP ble redusert til kontrollnivået (figur 2D). Dette var ikke tilfelle når Bag-1Δ68mer som ikke binder GRP78 /BiP ble transfektert. Disse studiene viser at Bag-en peptid forstyrrer refolding aktivitet GRP78 /BIP. Men Bag-en peptid ikke har noen effekt på ATPase aktiviteten GRP78 /BiP selv Bag-en økt denne enzymaktivitet (Tall S2A og S2B). Dette indikerer at Bag-1 peptid fungerer annerledes fra full lengde Bag-en. Vi startet derfor på å karakterisere dette peptid som en ligand for GRP78 /BiP for fremtidig terapeutisk bruk.
A. Stabil kloner av 22Rv.1 cellene vise redusert celleviabilitet
in vitro
. Stabile kloner ble utsådd i en 96-brønns plate og celletallet i hver brønn ble beregnet ved å måle forholdet mellom bølgelengden for eksitasjon og emisjon 560/590 nm ved hjelp av CellTiter-Blue ™ proliferasjonsanalyse. Stolpediagrammet representerer gjennomsnittet av minst fire uavhengige forsøk ± SD (* p 0,05). B. Bestemmelse av nivået av sekken-1 uttrykt i 22Rv.1 kloner. Cellulære ekstrakter av 22v.1 stabile kloner ble underkastet Western blot-analyse. Et anti-HA-antistoff ble brukt til å detektere peptidet og et anti-β-aktin-antistoff for lik belastning kontroll. C-D. Bag-en peptid reduserer 22Rv.1 prostata svulst cellevekst
in vivo
. Seks uker gamle atymiske nakne mus ble injisert subkutant i begge flankene med 5 × 10
6 celler av hver stabil klone. Tumorstørrelse ble målt en gang per uke ved hjelp av en caliper og uttrykt som tumorvolumet i mm
3. Vist er (C) tumorvolumer av kloner transfektert med tom ekspresjonsvektor og (D) kloner som uttrykker Bag-1-peptid. Hvert punkt representerer middelverdien volum og standardavvik av minst 5 til 10 tumorer. E. xenografter av stabile kloner som uttrykker Bag-en peptid viser økt apoptose. Fem-mikron deler av formalinfiksert, parafininnstøpte tumorvev ble utsatt for immunhistokjemi. Kjerner er farget blå-lilla med hematoksylin mens apoptotiske celler oppdages med tunel analysen er farget brun. Representative deler av xenografter innhentet fra hver 22Rv.1 stabil klon ble kjøpt med en Axioscop mikroskop (Zeiss). V: står for tom vektor uttrykke klone og P:. Peptid uttrykke klone
Utnyttelse av en Bag-en Peptide å indusere apoptose og redusere prostatakreft cellevekst
Under ER stress, utfoldet peptider akkumuleres i ER og GRP78 /BiP spiller en sentral rolle for å justere proteinfolding kapasitet ved å aktivere tre signalveier (perk, IRE1α, og ATF6) [44], [45]. Ekstra fordel er autofosforyleres fører til fosforylering av alfa-subenheten av eIF2 og proteinsyntese nedstenging. Fosforylert eIF2α selektivt forsterker translasjon av transkripsjonsfaktor ATF4 som øker UPR target-genekspresjon, for eksempel GRP78 /BiP [44], [45] og IRE1α er også autofosforyleres fører til aktivering av anstand syntese via Xbp1 aktivering. ATF6 er proteolytisk spaltet for å ta del i oppregulering av ekspresjon av UPR målgener [44], [45]. Men apoptose indusert hvis likevekttilstand ikke kan etableres [46]. Vi bestemte derfor om binding av Bag-en peptid til GRP78 /BIP nøkkelkomponent i ER stress, påvirker signalveier i UPR.
A. Skjematisk fremstilling av Bag-en peptid og dets sletting mutanter. Den ubiquitin-lignende domenet er representert i blått og BAG domene i rødt. Tallene refererer til aminosyre-posisjonene til de forskjellige domener. Aminosyrerestene er nummerert følger nummereringen for Bag-1L. B. Prediksjon av den sekundære strukturen av sekken-1-peptidet, og viser en N-terminal β-hårnål fra de ubiquitin-lignende domene (blå) og en C-terminal α-heliks fra BAG domenet (rød). C. Normalisert sirkulærdikroismeanalyse spektra av Bag-1 peptider. 30 mikrometer i Bag-en peptid ble målt i 20 mM KHPO
4 buffer, pH 6,8 (sort linje). Sin α-heliks-innholdet ble anslått til å være ca. 25% ved dekonvolvering av spektrene (rød linje). 12 uM av N-term peptid (grønn linje) og 11 uM av C-sikt (blå linje) ble målt under de samme betingelser. D.
1 H
15 N-HSQC NMR-spektrum av
15 N-merket Bag-1 peptid (202-269) i 20 mm KHPO
4-buffer, pH 6,8, ved 23 ° C. Den smale spektrale spredning indikerer at peptidet ikke viser en foldet globulær struktur. «H
δ og H
iU sidekjede signaler av asparagin og glutamin er forbundet ved hjelp av tynne linjer. E. N-terminale område av sekken-1 peptid er viktig for GRP78-binding. [48].
