Abstract
Prostatakreft er en heterogen gruppe sykdommer, og det er behov for mer effektiv og målrettet fremgangsmåter for behandling. I denne studien ble potensialet i genuttrykk data og RNA interferens teknikk kombinert for å fremme fremtidige personlige prostata kreftbehandling. For å skille de mest lovende
in vivo
prevalidated prostata kreft narkotika mål, en bioinformatiske analyser ble utført ved hjelp av genom-wide genuttrykk data fra 9873 menneskelige vevsprøver. I alt ble 295 gener valgt for ytterligere funksjonelle studier i dyrkede prostata kreft celler på grunn av sin høye mRNA uttrykk i prostata, prostatakreft eller metastatisk prostatakreft prøver. For det andre ble RNAi basert celleviabilitet analysen utført i Vcap og LNCaP prostata kreft celler. Basert på siRNA resultater, genuttrykksmønster i menneskelig vev og nyhet, endoplasmatisk retikulum funksjon i forbindelse mål
AIM1
,
ERGIC1 Hotell og
TMED3
, samt mitose regulerende
TPX2
ble valgt for videre validering.
AIM1
,
ERGIC1
, og
TPX2
ble vist å være sterkt uttrykt særlig i prostata kreft vev, og høy mRNA uttrykk for
ERGIC1 Hotell og
TMED3
forbundet med
AR Hotell og
ERG
onkogen uttrykk.
ERGIC1
stanse særskilt regulert spredning av
ERG
onkogen positive prostatakreftceller og hemmet ERG mRNA uttrykk i disse cellene, noe som indikerer at det er en potent medikament mål i ERG positiv undergruppe av prostatakreft.
TPX2
uttrykk assosiert med PSA svikt og
TPX2
lyddemping redusert PSA uttrykk, noe som indikerer at TPX2 regulerer androgen reseptor mediert signalering. I konklusjonen, kombinatorisk bruk av microarray og RNAi teknikker gitt i et stort antall potensielle nye biomarkører og terapeutiske mål for fremtidig utvikling av målrettede og tilpassede tilnærminger for prostatakreft forvaltning
Citation. Vainio P, Mpindi JP , Kohonen P, Fey V, Mirtti T, Alanen KA, et al. (2012) høy gjennomstrømming Transcriptomic og RNAi analyse Identifiserer
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3 Hotell og
TPX2
som potensielle narkotika mål i prostatakreft. PLoS ONE 7 (6): e39801. doi: 10,1371 /journal.pone.0039801
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 28 oktober 2011; Godkjent: 31 mai 2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Vainio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært støttet av Marie Curie Canceromics (MEXT-CT-2003-2728), EU-PRIMA prosjektet (kontrakt # LSHC-CT-204-504587), TIME samarbeidsprosjekt, kreft organisasjoner i Finland, Sigrid Juselius Foundation, Academy of Finland og Drug Discovery Graduate School ved universitetet i Turku. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft og den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i den vestlige mannlige befolkningen [1]. Men prostatakreft danne en heterogen gruppe av sykdommer og noen menn er fortsatt diagnostisert med høyverdig sykdom og til slutt mislykkes behandling [1], [2]. Til tross for den fenotypiske og molekylære heterogenitet av sykdommen er det en mangel på sterke og spesifikke prognostiske biomarkører for å skille mellom lat og aggressive kreftformer ved de tidlige fasene av sykdommen. Videre, på grunn av mangel på effektive prognostiske og terapeutiske biomarkører, samt målrettede terapeutiske midler, er den kliniske behandlingen fortsatt langt fra personlig.
I tillegg regulerer utvikling og opprettholdelse av prostata, androgener støtte utvikling og vekst av de fleste primære prostatakreft, og androgenreseptoren (AR) spiller rollen som et onkogen i prostata cancer [3] – [7]. Følgelig er androgen ablasjon for tiden behandling av valget for avansert prostatakreft. Imidlertid, selv om androgen tilstopping opprinnelig resulterer i en god behandlingsrespons, er det nesten aldri kurativ [2]. Androgen-uavhengig kreftceller vanligvis begynner å vises under behandling, til slutt fører til tilbakevendende, hormon refraktær sykdom [8], [9]. I tillegg til de rådende endringer i AR ekspresjon og funksjon, omtrent halvparten av prostatakreft prøvene huse et oncogent genfusjon som kombinerer androgen-regulert transmembrane protease serin 2 (
TMPRSS2
) med onkogene ETS transkripsjonsfaktorer [10]. Oftest er fusjonspartneren
ERG plakater (v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog, avian), etterfulgt av
ETV1 plakater (ets variant 1),
ETV4
, og
ETV5 product: [11] – [13]. ERG mRNA uttrykkes ikke i friske prostata vev, men som et resultat av
TMPRSS2-ERG
genet fusjon tidlig i kreftutvikling, en betydelig økning i ERG transkripsjonsnivåer kan påvises i prostata kreft. ETS Genfusjonene fremme flere signalveier assosiert med kreft dannelse og progresjon, og ektopisk
ERG
onkogen uttrykk har vært forbundet med en bestemt molekylær signatur i prostata kreft [14] – [19]. Selv
ERG
aktiverings mediert onkogene prosesser kan omgås ved avansert prostatakreft, hormon-regulert uttrykk for
ERG
har blitt beskrevet å vedvare også i kastrering resistent prostatakreft, som støtter viktigheten av dette omorganisering også i avansert sykdom [15], [20], [21]. Til sammen ETS fusjoner er viktige molekylære forandringer som driver utvikling og progresjon av en distinkt klasse av prostatakreft, og kan derfor dra nytte av målrettet terapi.
I de senere årene avanserte molekylærgenetiske teknikker kombinert med utviklingen av romanen bioinformatiske analyse verktøy har tilbudt effektive måter å undersøke tumor genekspresjonsprofiler, noe som letter biomarkører, samt identifikasjon av potensielle nye drug targets. Genuttrykk profilering muliggjør forbedret diagnostikk og iscenesettelse av sykdommen, gir informasjon om behandlingstiltak og fører til reduserte bivirkninger [22], [23]. RNA interferens (RNAi) teknikk gjør det mulig for utforskning av den funksjonelle virkningen av individuelle gener på kreftcellekarakteristikker, slik som vekst og overlevelse, ytterligere å fremme utvikling av målrettede og tilpassede terapeutika [24] – [26]. I denne studien ble potensialet i disse teknikkene kombinert med forhånds velge genene for RNAi funksjonelle analyser ved hjelp av genuttrykk data. For å identifisere potensielle sårbarheter som finnes i prostata kreft, ble en bioinformatiske mRNA uttrykk analyse først utført basert på 9873 menneskelige vevsprøver, inkludert 349 prostatakreft og 147 ikke-maligne prostataprøver, for å skille prostata og prostatakreft vev spesifikke gener. For det andre, en RNAi high-throughput (HT) funksjonell profilering av de valgte
in vivo
prevalidated mulige narkotika mål ble utført i Vcap og LNCaP prostatakreft cellelinjer for å identifisere gener og stier avgjørende for prostatakreft celleproliferasjon og overlevelse. Resultatene fremhevet potensialet for målretting endoplasmatiske retikulum (ER), oksidasjon, aktin cytoskjelettet og mitose i prostatakreft ledelse, og ytterligere validering identifisert
AIM1 plakater (fraværende i melanom 1),
ERGIC1 product: ( endoplasmatiske retikulum-Golgi mellomliggende protein 1),
TMED3 plakater (trans emp24 protein transport domene som inneholder 3) og
TPX2 plakater (rettet mot protein for Xklp2) som potensielle romanen narkotika mål i prostata kreft.
Metoder
i Silico
data Mining
GeneSapiens database [27] ble brukt til bioinformatically utforske genuttrykk nivåer over 9783 mennesker vevsprøver. Kort, GeneSapiens (https://www.genesapiens.org/) er en samling av 9873 Affymetrix microarray eksperimenter. Alle prøver reannotated og normalisert med et egendefinert algoritme. Dataene er hentet fra offentlig tilgjengelige kilder, inkludert Gene Expression Omnibus og Array-Express og dekker 175 forskjellige typer vev. Bety ekspresjon av hvert gen ble bestemt i prostata cancer (n = 349), sunn prostata (n = 147), og alle normale vevsprøver (n
=
1476). Dataene fra prostatakreft prøvene tilgjengelig i GeneSapiens databasen ble benyttet også i
i silico
koekspresjon analyser. De funksjonelle genet ontologi merknader ble analysert for co-uttrykte gener (R 0,5 og P 0,001) ved hjelp av DAVID funksjonell annotering verktøy [28] og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) Programvare (Oppfinnsomhet Systems Inc., Redwood City, CA, USA).
Cell Kultur
Vcap prostatakreftceller ble mottatt fra Kenneth Pienta (University of Michigan, MI) eller kjøpt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Sverige) og dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP celler ble mottatt fra Dr. Marco Cecchini (Universitetet i Bern, Sveits) og vedlikeholdes i T-Medium (Invitrogen, Carlsbad, California). PC-3, ble DU145 og MDA-PCA-2b celler kjøpt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB), og 22Rv1 celler fra Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). De ikke-maligne EP156T prostata epitelceller ble mottatt fra Dr. Varda Rotter (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) og RWPE-1 celler kjøpt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB). Primære prostata epitelceller (PREC) ble kjøpt fra Lonza (Lonza Group Ltd, Basel, Sveits). Androgen-uavhengig LNCaPs og foreldre kolleger ble mottatt fra Dr. Zoran Culig (Innsbruck Medical University, Østerrike) og ble dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen) som inneholder kull strippet eller normal foster bovint serum, henholdsvis. Syntetisk androgen R1881 ble kjøpt fra PerkinElmer.
Gene Knock-down Bruke RNA interferens
Før screening, celle nummer ble titrert for både Vcap og LNCaP celler separat for å sikre at celleproliferasjon forble i en lineær -exponential fase gjennom hele eksperimentet. For RNAi studiene, ble fire sirnas pr gen (HP GenomeWide, Qiagen) sådd ut på 384-brønners plater (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland), etterfulgt av tilsetning av transfeksjon middel (siLentFect lipid-reagens; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i Opti-MEM-medium (Invitrogen) og en passende mengde av celler (1500 til 2000 per brønn), ved hjelp av automatisert væskehåndteringsrobot (Hamilton) og væskedispenser (ThermoFisher). Den endelige siRNA konsentrasjon var 13 nM. AllStars negativ kontroll (egge siRNA, Qiagen) og lipid bare ble brukt som negative kontroller, sirnas mot
KIF11 plakater (kinesin familiemedlem 11; SI02653770) og
PLK1 plakater (polo-lignende kinase 1; SI02223844) ble anvendt som positive kontroller. For validerings eksperimenter celler ble transfektert med to sirnas per genet (
AIM1
: SI03126704, SI03212846;
ERGIC1
: SI03164763, SI04302872;
TMED3
: SI00746711, SI00746718;
TPX2
. SI00097188, SI00097195) som beskrevet ovenfor i de aktuelle platene
Cell Livskraftig og apoptose analysen
CellTitre-Blue (CTB) og CellTiter-Glo (CTG) celle levedyktighet assays (Promega), og ApoONE apoptose (induksjon av caspase -3 og 7 aktiviteter) assay (Promega) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner som respons på 48 timer eller 72 timer siRNA behandling. Resultatene ble skannet med seg Multilabel platereader (PerkinElmer /Wallac).
Normalisering og Statistisk analyse av siRNA Screen Resultater
Den rå resultatene fra celle levedyktighet og apoptose analyser ble normalisert ved hjelp av
B
-score [29], og sirnas redusere cellenes levedyktighet ved -2 SD fra medianen av kontrollene (svarende til P 0,05) i minst to av skjermene, eller indusering av apoptose av 3 SD (svarende til P 0,01) ble vurdert antiproliferativ eller pro-apoptotiske hit siRNAs.
klinisk prostata vevsprøver
De 33 viktigste prostata tumorprøver (19 ERG onkogen positive og 14 ERG negative) og tre ikke-ondartet prostata prøvene benyttet i denne studien har blitt beskrevet tidligere [30].
kvantitativ revers transkriptase PCR
validering av mRNA uttrykk nivåer ble utført ved bruk av TaqMan kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR) analyse ( finsk DNA Microarray Centre, Centre for bioteknologi ved Universitetet i Turku). RNA prøver ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen) ble omvendt transkribert til cDNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) og PCR-reaksjons prøver ble analysert i 96-brønn eller 384-brønners format. Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) og kvantifisering ble utført ved hjelp av
ΔΔCT metode med RQ Manager 1.2-programvare (Applied Biosystems). Tre gjentatte prøver ble undersøkt for påvisning av mål-mRNA-ekspresjon og β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll. De primere og prober ble utformet og valgt ved hjelp av Universal ProbeLibrary analysen Design Center (Roche Diagnostics) (Støtte Tabell S1).
Western Blot analyse
Hel-cellelysater ble utarbeidet etter lysing -buffer (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-merkaptoetanol 10% glycerol, bromfenolblått). Antistoffer som brukes inkluderte anti-AR (1:1,000, NeoMarkers, Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA), anti-PSA (1:1,000, A0562, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), samt sekundære Alexa Fluor (1: 4000, molekylære prober, Invitrogen) antistoffer. β-aktin (1:5,000, antistoff fra Sigma) ble anvendt som en kontroll lasting. Signalet ble oppdaget ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av t-test (*, P 0,05, **, P 0,01; ***, P 0,001) og Pearson korrelasjonskoeffisient
Resultater
High. -throughput Screening Resultater Marker rolle endoplasmatiske retikulum og Mitosis relaterte gener i Regulering prostate Cancer Cell vekst og overlevelse
Slik velger du
in vivo
prevalidated potensielle narkotika mål og biomarkører for videre studier i helstøpt prostata kreftceller genuttrykket tilgjengelige data i GeneSapiens databasen ble utnyttet. I alt ble 295 prostata og /eller prostatakreft spesifikke gener valgt basert på høy mRNA uttrykk i prostata, prostatakreft eller metastatisk prostatakreft vevsprøver, og en siRNA bibliotek ble konstruert for funksjonelle studier (figur 1). For de RNAi studier 4 sirnas per genet ble kjøpt og plate basert HT siRNA skjermene ble utført med Vcap og LNCaP prostatakreftcellelinjer. Vcap er en modell for TMPRSS2-ERG positive prostatakreft, uttrykker villtype AR, mens LNCaPs havn en mutant
AR plakater (T877A) med utvidet ligand spesifisitet. Å identifisere terapeutisk relevante gener og stier i prostata kreftutvikling, endringer i celle levedyktighet og induksjon av apoptose (caspase -3 og 7 aktivering) ble studert som endepunktene (Støtte Tabell S2).
En heatmap presentasjon av de midlere genuttrykk nivåer av de 295 gener (x-akse) er valgt for ytterligere RNAi utforskning i alle vev (sunne og maligne) som er tilstede i GeneSapiens database (y-aksen). Posisjonen av prostatakreft (øvre stjerne) og sunn prostata (lavere asterisk) er indikert. Fargen illustrerer nivået for ekspresjon i forskjellige vev, og grå manglende verdier. Heatmap trekkes basert på unsupervised hierarkisk clustering.
celleviabiliteten siRNA skjermen ble utført i tre replikater og apoptose analysen en gang i begge cellelinjer. De positive kontroll sirnas rettet mot kjente viktige regulatorer av mitotisk progresjon, samt prostatakreft celleproliferasjon, KIF11 og PLK1 [31], [32], var i stand til å betydelig redusere celleviabilitet (Figur 2A) som bekrefter dermed transfeksjon effektivitet. De replikere Celleviabilitet skjermer positivt korrelert (0,67 R 0,78 i LNCaP og 0,36 R 0,66 i Vcap) i begge cellelinjene som støtter funksjonaliteten til hovedskjermbilder (figur 2B og Støtte Tabell S2).
A. Oversikt over normalisert LNCaP og resultater Vcap celle levedyktighet skjerm (B-score). Resultatene fra de positive kontroll sirnas (KIF11 og PLK1) er angitt i blått, negative kontrollbrønner (AllStars negative egge siRNA og buffer bare) i grønt, og målet genet siRNAs i grått. B. En heatmap presentasjon av resultater cellen levedyktighet skjermen (B-score). Analysen ble gjentatt tre ganger i både LNCaP og VCap prostatacancercellelinjer. Blå farge indikert redusert celle levedyktighet, rød økt celle levedyktighet. Heatmap trekkes basert på unsupervised hierarkisk clustering. C. overlapping mellom RNAi skjermen hit gener (redusert celle levedyktighet i respons til lyddemping) i LNCaP og Vcap cellelinjer. D.
I silico
co-uttrykk analyse av celle levedyktighet hit gener i prostatakreft prøver. Genene er ordnet i samme rekkefølge i både y- og x-aksen, og de korrelasjoner (R) mellom de gener er indikert med farger. Rødt indikerer positiv korrelasjon, blå negativ korrelasjon.
siRNA skjermer resulterte i 94 potensielle spredning fremme (treff i minst to av celle levedyktighet skjermer) og 97 anti-apoptotiske gener i LNCaP celler. Ut av 94 gjengitt celle levedyktighet hit gener 45 (47,9%) var også anti-apoptotiske. I Vcap celler finalen hit rate var 35 itte spredning fremme og 34 anti-apoptotiske hit gener, 9 (25,7%) som fremmet celle levedyktighet og beskyttet mot apoptose. Stanse av 17 gener som resulterte i en anti-proliferativ respons i både LnCap og VCap-celler. (Figur 2B-C og Støtte Tabell S2).
i silico
co-uttrykk analyse av spredning hit gener (n = 112) foreslo tre store prostatakreft undergrupper med ulike mekanismer for cellevekst regulering. Den største sett av gener hadde en rolle i ER og Golgi-apparatet, prostatakjertel utvikling, så vel som i oksydasjon reduksjon. De andre undergrupper av prostatakreft levedyktighet regulerer gener involvert i aktin cytoskjelettet og mitose (figur 2D).
Novel Antatte Prostate Cancer narkotika mål
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, og
TPX2
ble valgt ut for videre validering
RNAi skjermer bekreftet rollen som flere tidligere utgitt prostata kreft narkotika mål som vekst og apoptose regulere gener i kultur prostatakreft celler. Blant annet disse genene inkludert
CLDN3
,
CYP4F8
,
EPHX2
,
FAAH
,
FOXA1
,
MTDH
,
ODC1
,
PLA2G2A
,
PLA2G7
,
SIM2 Hotell og
UBE2C product: [30], [33] -. [41] (Støtte Tabell S2)
Fire nye kandidat narkotika mål,
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, og
TPX2
, ble valgt ut for ytterligere studier basert på høy ekspresjon i prostata kreft sammenlignet med normal prostata og alle andre normale vev inngår i GeneSapiens database (Hjelpemiddel fig S1), så vel som deres nyhet som regulatorer av prostatacancer celleproliferasjon og apoptose.
AIM1
,
TMED3 Hotell og
TPX2
var blant de 17 genene, taushet som induserte antiproliferative effekter i både Vcap og LNCaP celler samt apoptose i minst ett av cellelinjene. Stanse av
ERGIC1
indusert antiproliferativ effekt spesielt i ERG onkogene positive Vcap celler (Støtte tabell S2).
AIM1
,
ERGIC1 Hotell og
TMED3
var co-uttrykt i settet av gener funksjonelt kommenterte til ER og Golgi-apparatet og redoksreaksjoner, mens
TPX2
ble uttrykt blant de som er involvert i mitose (figur 2D) gener.
AIM1 protein er medlem av βγ-krystallinske super. I motsetning til andre p- og y-krystallinske, er kjent for å være spesifikt uttrykkes i forlengelse linse fiber celler som gjennomgår store forandringer i cytoskeletal arkitektur og sammensetning, har AIM1 en ikke-linse rolle. Imidlertid har AIM1 proteinsekvensen en svak likhet med filament eller actin-bindende proteiner, noe som indikerer en mulig rolle i behandlingen av cellemorfologi og formen [42].
AIM1
gen konsentreres i 6 Q21, innenfor den antatte tumor suppressor region for human melanoma, og AIM1 uttrykk har vist seg å endres i forbindelse med tumorundertrykkelse i et humant melanom-modell [43]. Men nyere studier indikerte at
AIM1
er ikke det viktigste tumorsuppressorgenet i del6q21 i naturlige drepe cellemaligniteter [44], [45]. Støtte til mulige rolle
AIM1
som en svulst suppressor har AIM1 metylering vært forbundet med nasopharyngeal carcinoma og primær tumor invasjon av blærekreft [46], [47]. På den annen side har AIM1 ekspresjon er vist å være høy i TRAIL-resistente kreftcellelinjer [48].
ERGIC1 er en sykkelmembranprotein som bidrar til membranen trafikk og selektiv transport av last mellom ER, i mellomliggende rom, og Golgi-apparatet [49], mens TMED3 er en bestanddel av de belagte vesikler som er involvert i transport av last-molekyler fra eR til Golgi-komplekset og fungere som reseptorer for spesifikk sekretorisk last [50]. Selv om den eksakte rolle ERGIC1 og TMED3 i kreft er ikke avklart, er dysfunksjon av proteostasis og ER kjent for å indusere en stressrespons (utbrettet protein respons) som fører til apoptose i kreftceller [51], [52].
TPX2 er utelukkende uttrykt i voksende celler fra overgangen G1 /S til slutten av cytokinese. Mitose er en viktig biologisk prosess deregulert i kreft og den viktigste biologiske prosessen målrettet av cytotoksiske legemidler. Interessant er TPX2 kjent for å være sterkt uttrykt i ulike kreft vev, og det har blitt foreslått som en biomarkør for dårlig prognose [53] – [55]. Som en viktig regulator av cellesyklus og en bindingspartner for Aurora A kinase, og TPX2 også blitt foreslått som en potensiell medikamentmål i flere ondartede sykdommer [56] – [58]. Imidlertid har TPX2 ikke undersøkt hos prostatakreft tidligere. Det har blitt foreslått at TPX2 målrettede terapeutiske midler kan være mer effektiv enn anvendelsen av Aurora A kinase-inhibitorer på grunn av den uspesifikke natur av konvensjonelle kinaseinhibitorer [58]. Videre kombinerer TPX2 og Aurora A kinase målrettede behandlingsformer kunne hemme utviklingen legemiddelresistens [59], [60].
Validering av
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, og
TPX2
Expression og siRNA Induced Target genet Slå i dyrkede prostataceller
mRNA uttrykk for
AIM1
,
ERGIC1
TMED3
, og
TPX2
ble studert i seks prostatakreft (Vcap, PC-3, MDA-PCA-2b, LNCaP, DU145 og 22Rv1) og tre ikke-ondartet prostata epitelcelledifferensiering linjer (RWPE-en, prec, EP156T) (figur 3A). Spesielt
ERGIC1
og
TMED3
ble funnet å være sterkt uttrykt i kreft, men ikke i de ikke-maligne cellelinjer. Blant de ondartede cellelinjer
AIM1
,
ERGIC1
, og
TMED3
ble mest høyt uttrykt i Vcap, og
TPX2
i LNCaP celler. To sirnas per genet, valgt ut fra ønsket stanse effekten, ble valgt for valideringsstudier (figur 3B og Støtte Figur S2). Resultatene fra 72 timer celleviabilitet og apoptose-analyse bekreftet den antiproliferative virkningen av
TMED3
og
TPX2
stanse i begge cellelinjer. Som forventet basert på screening resultater,
ERGIC1
hadde en rolle spesielt i ERG onkogen uttrykke Vcap celle levedyktighet. Men selv om AIM1 sirnas var i stand til å redusere Vcap celle levedyktighet, ble det ikke konsistente effekter observert i LNCaP celler (Figur 3C). Caspase 3/7 aktiviteten ble forsterket i hovedsak som følge av
TPX2 Hotell og
TMED3
stanse i LNCaP celler, mens
TPX2 Hotell og ERGIC1 stanse indusert apoptose i Vcap celler med både sirnas (Figur 3D).
A. MRNA uttrykk av målgener i seks prostatakreft (Vcap, PC-3, MDA-PCA-2b, LNCaP, DU145 og 22Rv1) og 3 ikke-maligne (RWPE-en, prec, EP156T) prostata cellelinjer. For hvert gen relativ mRNA uttrykk i RWPE-en cellelinje ble satt til 1. B. Validering av målet genet stanse. MRNA nivået av hvert gen i kontrollprøve er angitt som 100%. C. Virkningen av target-genet Slå på VCap og LNCaP cellelevedyktigheten ved 72 timer endepunktet. D. Effekten av target-genet Slå på induksjon av apoptose i VCap og LNCaP-celler ved 72 timer endepunktet. Resultatene er sammenlignet til egge siRNA induserte endringer og betydningen av de anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger er indikert. KIF11 siRNA har blitt brukt som positiv kontroll.
AIM1
,
ERGIC1
, og
TPX2
er sterkt uttrykt i klinisk prostatakreft prøver
Validering av målet genuttrykksmønster i kliniske prostata prøver bekreftet at AIM1, ERGIC1 og TPX2 mRNA nivåer ble signifikant forhøyet i prostata kreft vev (n = 33), sammenlignet med ikke-maligne kontroll vevsprøver (n = 3). Alle kreftprøvene uttrykt AIM1 mRNA på et høyere nivå enn noen av de ikke-maligne prøver; mens ERGIC1 ble overuttrykt i 94% (n = 31), og TPX2 i 64% (n = 23) av kreftprøvene. Imidlertid, til tross for de lovende resultatene av TMED3 ekspresjonsmønstre i dyrkede prostata-celler, ble TMED3 mRNA uttrykt ved like nivåer i de ikke-ondartede og kreftvev (figur 4A). For sammenligning ble mRNA-nivåer for nøkkelen prostatakreft onkogener AR og ERG også bestemt i de samme kliniske prøver, og resultatene er presentert som en varmekart i figur 4B. Ut av de fire potensielle nye målgener,
ERGIC1 product: (R = 0,51) og
TMED3 product: (R = 0,69) uttrykk mønstre korrelert viktigst med
AR
uttrykk (Figur 4C). I tillegg, selv ERGIC1 og TMED3 ble sterkt uttrykt i både ERG negativ og positiv prostatakreft, deres mRNA-ekspresjonsnivåer positivt korrelert med ERG-ekspresjonsnivåer i ERG-positive prøver (P = 0,002 og P = 0,007 henholdsvis) (figur 4D). Sammenligning av målet genuttrykk med kliniske parametre avdekket at
AIM1
korrelerte signifikant (P = 0,03) med ung alder ( 60 år) (figur 4E). I tillegg høy
TPX2
uttrykk korrelert med prostata-spesifikt antigen (PSA) svikt (P = 0,02), og forbundet med høy WHO klasse og ung alder (figur 4F). Ingen slike sammenhenger ble funnet med ERG1C1 eller TMED3 mRNA uttrykk.
A. MRNA uttrykk av målgener i 33 primær prostatakreft og 3 ikke-maligne prøver prostata vev. Det betyr uttrykket de ikke-maligne prøvene er angitt som 1. B. Heatmap visualisering av gen-messig skalert i forhold mRNA uttrykk verdier for
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
,
TPX2
,
ERG
, og
AR
i 33 primær prostata kreft vev. Heatmap trekkes basert på unsupervised hierarkisk clustering av uttrykket verdier. Relativt gjennomsnittlig Ekspresjonsnivået i normale kontrollprøver ble satt til 0. C. Ko-ekspresjon mønsteret mellom ERGIC1 og AR mRNA, samt TMED3 og AR mRNA i 33 primærprostatakreft prøver. D. Association of ERGIC1 og TMED3 mRNA uttrykk med ERG mRNA uttrykk i ERG positive primære prostatakreft (n = 19). E. Relativ mRNA uttrykk for
AIM1
i primær prostatakreft prøver i forhold til pasientens alder. F. Relativ mRNA uttrykk for
TPX2
i primær prostatakreft prøvene i forhold til forekomsten av PSA failure, WHO svulst klasse og pasientens alder.
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, og
TPX2
er alle regulert av
ERG
Oncogene og androgener i Cultured Prostate Cancer Celler
å evaluere potensielle rolle ERG og AR i reguleringen av disse prostatakreft cellevekst fremme gener, effekten av
ERG Hotell og
AR
stanse, samt androgen deprivasjon og stimulering på målet genet ekspresjon ble analysert. Overraskende,
ERG
stanse betydelig redusert mRNA uttrykk av alle fire målgener i Vcap celler (figur 5A). Videre
AR
stanse redusert mRNA uttrykk for
AIM1
i LNCaP celler og
TPX2
både Vcap og LNCaP celler, mens uttrykket av TMED3 mRNA ble økt (figur 5B). Overraskende, men
ERG1C1
uttrykket var forbundet med
AR Hotell og AR drevet
ERG
uttrykk i kliniske prostatakreft, ble det ikke observert store endringer i uttrykket av ERGIC1 mRNA uttrykk i respons på AR demping. Til tross for mangfoldige virkninger av AR lyddemping på mål genekspresjon, nedsatt androgen deprivasjon og det syntetiske androgen R1881 indusert ekspresjon av alle de målgener i LNCaP-celler i forhold til uttrykket nivåer påvist i androgen belastede forhold (figur 5C). Uttrykket av målgener ble undersøkt også i LNCaP derivater dyrket i stabil androgen ablasjon forhold ligne kastreringsresistent svulster. Resultatene viser en betydelig økning i AIM1 ekspresjon i ablasjon cellene i forhold til den parentale celler dyrket i normalt medium (figur 5D).
A. Effekten av 48 h
ERG
stanse på uttrykk for målet gener i Vcap celler. B. Effekten av 48 h
AR
Silencing på uttrykk for målet gener i Vcap og LNCaP celler. C. Effekten av 24 timer androgen deprivasjon og sekvensiell 24 h androgen stimulering (10 nM R1881) på uttrykket målet gener i LNCaP celler. D. Nivået av mål-mRNA-ekspresjon i LNCaP-celler dyrket i normalt medium (FBS) og i chargoal-strippet (CS-FBS) androgen ablated media. E. Effekten av 72 h
TPX2
stanse på protein uttrykk for AR og PSA. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Den statistiske signifikans av resultatene i forhold til å kontrollere forsøket er angitt.
Samlet utgjør disse resultatene tyder på at uttrykket av de potensielle romanen narkotika mål
AIM1
,
