Abstract
Bakgrunn
prostatakreft antigen 3 (
PCA3 /DD3)
genet er en svært spesifikk biomarkør oppregulert i prostatakreft (PCA). For å forstå betydningen av
PCA3
ved PCA vi undersøkt organiseringen og utviklingen av
PCA3
genet locus.
Metoder /hovedfunnene
Vi har ansatt cDNA syntese, rtPCR og DNA-sekvensering for å identifisere 4 nye transkripsjon start steder, 4 polyadenyleringsseter og 2 nye forskjellig spleisede eksoner i en utvidet form for
PCA3
. Primere utformet fra disse roman
PCA3
eksoner betraktelig bedre RT-PCR basert diskriminering mellom PCA PCA metastaser og BPH prøver. Sammenlignings genomiske analyser viste at
PCA3
har nylig utviklet seg i en anti-sense orientering i et annet gen,
BMCC1 /PRUNE2
. BMCC1 har vist seg tidligere å samhandle med RhoA og RhoC, determinanter av cellulær transformasjon og metastasering, hhv. Ved hjelp av RT-PCR vi vist at jo lenger
BMCC1-1
isoform – som
PCA3 Anmeldelser – er oppregulert i PCA vev og metastaser og i PCA cellelinjer. Videre
PCA3 Hotell og
BMCC1-1
nivåene er mottakelig for dihydrotestosteron behandling.
Konklusjon /Betydning
oppregulering av to nye PCA3 isoformer i PCA vev øker diskriminering mellom PCa og BPH. Den funksjonelle relevansen av dette spesifisitet er nå av spesiell interesse gitt
PCA3 sin
overlappende tilknytning til et annet gen
BMCC1
, en regulator av Rho signalering. Oppregulering av
PCA3 Hotell og
BMCC1
i PCA har potensial for økt diagnostisering
Citation. Clarke RA, Zhao Z, Guo AY, Roper K, Teng L, fang ZM , et al. (2009) Nytt Genomisk Struktur for prostatakreft bestemt gen PCA3 innen BMCC1: Konsekvenser for Prostate Cancer Detection og progresjon. PLoS ONE 4 (3): e4995. doi: 10,1371 /journal.pone.0004995
Redaktør: Baohong Zhang, East Carolina University, USA
mottatt: 11. november 2008, Godkjent: 05.02.2009; Publisert: 25 mars 2009
Copyright: © 2009 Lavin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiering er levert av Australian National Health and Medical Research Council og Kreft Council of Queensland. Zhongming Zhao er støttet av en NIH stipend (LM009598) fra National Library of Medicine, Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust Fund, and Institutional stipend IRG-73-001-31 fra American Cancer Society. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen indre kreftformen hos menn og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall. Årsakene til PCa er usikkert miljø, hormonelle og arvelige faktorer involvert. Iverksetting av PCa (ie. Dannelsen av et histologisk identifiserbare lesjon) er en vanlig hendelse, blir oppdaget ved obduksjon serien i nesten en tredjedel av menn over 45 år [1]. Heldigvis flertallet av slike lesjoner ikke utvikle seg til klinisk signifikante svulster. Men hos pasienter med klinisk påvist sykdom og som anses å ha sin tumor lokalisert til prostata, mellom 15% og 40% har disseminert sykdom, ikke kan identifiseres av nåværende avbildningsmetoder, som det er i dag ingen helbredende behandling. En diagnose av prostatakreft (fra prostata biopsier) blir initiert typisk etter en økning i serum målinger av prostata spesifikt antigen (PSA), et protein som normalt utskilt spesielt ved prostata epitelceller for å danne en komponent av sæd. PSA er ikke en test for kreft, og det er ikke terskelnivået av dette enzym som gir en høy sensitivitet og spesifisitet med et kontinuum av risiko for alle PSA-verdiene [2]. En hevet serum PSA begår så ofte menn til invasiv og upresis prosedyre for transrectal ultralyd (TRUS) veiledede biopsier [3], [4]. En ytterligere tiltale av begrensningene i PSA ved PCA påvisning er misforholdet mellom trus biopsi funn og de fra radikal prostatektomi med den tidligere under-ringer patologi [5].
For å bedre deteksjon og behandling av PCA undersøkelser har pågått for å identifisere genene som er involvert i initiering og progresjon av sykdommen. Arvelige faktorer er vurdert til å spille en større rolle i tilblivelsen av PCa enn i noen annen malignitet. Genomisk omfattende forening studier og kandidat gen skjermer tyder på at arv involverer flere små foreninger de aller fleste av dem er fortsatt ukjent i tillegg til muligens komplekse epigenetiske eller gen-gen-interaksjoner. [6] – [12]. Differensialskjermteknologi har vært brukt med hell for å identifisere endringer i nivået av genekspresjon i forbindelse med overgangen fra normal til svulst som inkluderer gener involvert i lipid signalering og metabolisme; fettsyrer; cellesyklusregulering; celle adhesjon og stromal regel; angiogenese; ionekanal regulering, og signaltransduksjon [13], [14]. Bruke differensialskjerm Bussemakers et al [15] identifisert en cDNA, senere kalt prostatakreft antigen 3 (
PCA3 /DD3
), som ble oppregulert i 53 av 56 prostatakreft sammenlignet med ikke-ondartet prostatavevet.
PCA3
genet (25 kb – figur 1A), som er forskjellig skjøtes, har en høy frekvens av terminerings kodoner i alle leserammer som antydet at det var et ikke-kodende RNA (ncRNA). I tillegg var det ingen bevis for uttrykk for en PCA3 protein [16]. Oppregulering av de store ~ 2 kb
PCA3
transkript, som utelukker exon 2 (figur 1 A), ble vist å være en sensitiv og spesifikk markør for diagnose av PCa [15], [16]. Ekspresjonen av polyadenylerte transkripsjoner av
PCA3
foreslått at det kan ha en funksjonell rolle som er understøttet i noen grad av dens lokalisering til kjernen og unnlatelse av å bli detektert i cytoplasma [16]. Til dags dato ingen rolle i kreft har blitt beskrevet for
PCA3
men det har vært antydet at det kan fungere i regulering av gen-ekspresjon eller delta i genet spleising [16]. ncRNAs har nylig blitt funnet i overraskende overflod, med nye klasser og uventede roller medierende evolusjon, organisering kromosomale domener, kromatin remodellering og transkripsjonsregulering (både aktivisering og undertrykkelse) [17], [18]. I tillegg til
PCA3
, sammenligninger mellom benign prostata Hypoplasia (BPH) og PCA prøvene viste 14 av de 51 andre ncRNAs som ble forskjellig uttrykt ble også oppregulert ved PCA [19], [20]. Det er også vel etablert at en klasse av meget liten ncRNAs kjent som microRNAs endres i forskjellige tumortyper, og kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [19], [21], [22].
(A ) Delvis
PCA3
genet struktur som opprinnelig rapportert av Bussemakers et al. [15] med 4 eksoner (åpne bokser ~ ikke i målestokk) med alternativ spleising av ekson 2 og tre alternative transkripsjonsterminerings områder i ekson 4. 5 «RACE eksperimenter (Supplementary Fig. S1) identifiserte fire roman
PCA3
transkripsjonsinitieringsseter nettsteder (isoformer 1-4 markert med vertikale piler som peker ned med nukleotidsekvensen under ligger 1150 bp, 699 bp, 640 bp og 136 bp oppstrøms av den opprinnelige initiering nettstedet (omdøpt her isoform 5). 3 «RACE identifisert fire roman polyadenylation områder (7 totalt *) lokalisert i exon 4. størrelsen av ekson 1 er utvidet fra det opprinnelige 120 bp til 1270 bp. Isoform 4 (
PCA3-4
) er den mest høyt uttrykt av de fire nye isoformer. Fire overlapp ORF starte fra en enkelt «ATG» start hotellet (vertikal pil som peker opp) i løpet av
PCA3-4 Hotell og opphøre innen en av de alternativt spleisede eksoner (2a eller 2b eller 2c) eller innen ekson 3 . (B) RT-PCR forsterkning av BPH, PCA og PCA metastase prøver ved hjelp av en fremover primer fra i romanen
PCA3-4
transkripsjon start stedet og en revers primer fra romanen ekson 2a. (C) Komplett strukturen i
PCA3
genet. Shading identifiserer de nylig identifiserte områder av
PCA3
gen som har 6 eksoner med alternativ spleising av ekson 2a (93 bp) og ekson 2b (93 bp) og ekson 2c (original ekson 2, 165 bp). og (D) RT-PCR-amplifisering av PCA3 ved å bruke den samme fremover primer og en revers primer fra roman ekson 2b og (E) RT-PCR-amplifisering av PCA3 ved hjelp av en forover primer fra
PCA3-5F
(innenfor opprinnelige transkripsjon start stedet) og en revers primer spenner eksoner 1 og 3 [15].
for å forstå videre viktigheten av
PCA3
genet ved PCA vi foretok en mer detaljert undersøkelse av dette genet og dets kromosom locus. Denne undersøkelsen peker på en betydelig mer kompleks transkripsjonsenhet for
PCA3
enn opprinnelig rapportert [15], [16] inkludert ekstra romanen eksoner. Vi beskriver en rekke roman
PCA3
spleise varianter med mer spesifikke uttrykk i PCA vev og metastaser. Vi viser også at
PCA3
er innebygd i intron av et andre gen,
BMCC1
, et gen involvert i kontroll av onkogene transformasjon [23], og at begge genene viste økt ekspresjon i PCa og metastaser .
Resultater
Identifisering av nye PCA3 utskrifter og erfaring ved PCA
fraværet av en TATA-boksen element i et menneskelig gen promoter har vært forbundet med promiskuøse transkripsjonsstart.
PCA3
genet inneholder ikke en oppstrøms TATA sekvens, og det var derfor av interesse å finne ut om noen ekstra transkripsjonsinitieringen nettsider eksistert i
PCA3 plakater (figur 1A, øvre del). Vi gjennomførte 5 «RACE hjelp PCa vev uttrykker
PCA3
å se etter flere startsider.
Denne tilnærmingen viste at exon 1 er 1150 bp lengre enn tidligere rapportert (nå 1270 bp) og inneholder 4 nye transkripsjon start steder (Supplementary fig S1 . fig. 1A, nedre del). Disse roman transkripsjonsstartsider ligger 1150, 699, 640 og 136 bp (betegnet
PCA3
isoformene 1-4, henholdsvis) oppstrøms av tidligere rapportert start stedet for
PCA3 product: [15]. Den opprinnelige transkripsjon er referert til her som
PCA3
isoform 5 (
PCA3-5
). Tilstedeværelsen av disse lengre transkriptene i tumorer var ikke-reversibelt relatert til transkripsjon lengde (resultater ikke vist). Transkripsjon fra roman initieringssete 4 (
PCA3-4
), sammenstilt umiddelbart nedstrøms for FP2 regionen inneholdende 3
SRY
konsensus-bindingsseter (Tilsetnings fig. S2), var signifikant høyere sammenlignet med de tre andre oppstrømsinnvielses områder som bedømt ved qPCR (resultater ikke vist). Transkripsjon fra start for 1. (
PCA3-1
) ble oppdaget av 5 «RACE i bare noen få eksempler.
Vi har gjennomført 3′ RACE å undersøke ytterligere kompleksitet ved 3 «enden av karakterutskriften. Fire ekstra polyadenyleringsseter ble påvist ved anvendelse av 3»-RACE og det totale antallet polyadenyleringsseter til syv, som ligger ved nukleotidene 411, 542, 873, 1583, 1600, 2146 og 3545 henholdsvis i exon 4 (fig. 1A, nedre del). Av de 4 ekstra polyadenyleringsseter, bare to ble forbundet med definert polyadenyleringssignal sekvenser, henholdsvis AATAAA og ATTAAA. Vi observerte at en fremover primer basert på den nye sekvensen (
PCA3-4)
sammen med en omvendt primer for exon 2 meget effektivt forsterket
PCA3
ved PCA (7/8) og metastaser prøver (7/8), men ikke klarte å oppdage
PCA3
i BPH prøver (0/8) (figur 1B). Klinisk informasjon om disse pasientene er gitt i Utfyllende Tabell S1. Disse primere ikke bare amplifisert et cDNA-fragment av den forventede størrelse (265 bp), men også to høyere molekylstørrelse bånd i enkelte prøver (figur 1B, Supplementary fig. S3). De ytterligere bånd ble skåret ut fra gelen og sekvensert for å avsløre tilstedeværelsen av to nye
PCA3
eksoner begge 93 bp i størrelse (figur 1C). Disse to forskjellig spleisede eksoner (2a og 2b) som har bona-fide konsensus spleiseseter i endene hadde sitt uttrykk bekreftet av RT-PCR forsterkning ved hjelp av romanen exon spesifikke primere Forsterkning av
PCA3
bruker PCA3-4F primer sammen med en primer som tilsvarer ekson 2a påvises 5/8 PCa og 4/8 metastatiske prøver og igjen ga oss utmerket diskriminering med BPH (fig 1D). Lignende resultater ble demonstrert ved hjelp av PCA3-4F og en revers primer for ekson 2b (resultater ikke vist). Dette forbedrer på bruken av den opprinnelige primersett som anvendes ved Bussenmakers et al [15] som også oppdaget at en mindre intens signal i de fleste tilfeller BPH som er tydelig fra data oppnådd her (fig. 1E). Identifiseringen av eksoner 2a og 2b fører til seks antal
PCA3
eksoner (Fig. 1C). Disse dataene indikerer at flere nye transkripsjoner for
PCA3
er forskjellig uttrykt ved PCA.
Nukleotidsekvensanalyse identifisert fire mulige ORF initiere fra en enkelt ATG ligger 54 nukleotider i romanen
PCA3- 4
isoform (fig 1A, nedre del). Den første av disse, 70 aminosyrer (aa) i lengde, utvides gjennom eksoner 1 og 4 aa inn i en ny ekson 2a. Den andre, 82 aa i lengde, utvides gjennom ekson 1, hoppet ekson 2a, og utvidet 16 aa til exon 2b. Den tredje, 76 aa i lengde, også utvides gjennom ekson 1, hoppet eksoner 2a og 2b og utvidet 10 aa til exon 2c. Den fjerde, 73 aa i lengde, også utvidet gjennom exon 1, hoppet eksoner 2a og 2b og 2c og utvidet 7 aa i ekson 3. Disse ORF initiere 83 nukleotider oppstrøms av den opprinnelige karakterutskrift (
PCA3-5
) beskrevet av Bussemakers et al. [15] og kunne ikke ha blitt spådd i tidligere analyser av den opprinnelige karakterutskriften som avdekket ingen vesentlige ORF. Det vil være av interesse å finne ut om disse ORF koder for proteiner.
PCA3
er integrert i intron 6 av
BMCC1
genet
For å forstå bedre den nære sammenhengen mellom
PCA3
genuttrykk nivåer og prostatakreft vi undersøkt utviklingen og organiseringen av
PCA3
genet locus (fig 2A). Vi brukte
PCA3
mRNA sekvens (3923 bp, AF103907) for å søke homologe sekvenser i andre genomer. Ved hjelp av en cutoff E-value 1 x 10
-4 i BLAST søk, betydelige treff ble funnet bare i pattedyr genomer. Exon 4 er den mest konserverte regionen i genet. Ett segment (403 bp) i ekson fire ble funnet i alle de tilgjengelige pattedyr genomer (evolusjonære konservert region (ECR_ex4c arrowed «B» i figur 2B og 3A . 3B) Dette segmentet, sammen med den menneskelige
PCA3
gensekvensen, ble brukt til å trekke ut de genomiske sekvenser for
PCA3
homologer i andre arter. Som et resultat, fikk vi menneskelig
PCA3
homologer i 14 pattedyr, inkludert 4 ikke-menneskelige primater .
(A)
PCA3
genet (over) er integrert i intron 6 av
BMCC1 product: (
PRUNE2
) isoform 1 (
BMCC1-1
). Grå bokser betegne eksoner av
BMCC1 Hotell og svarte boksene betegne eksoner av
PCA3.
de to genene er i motsatt retning (NCBI Bygg 36). Tre andre isoformer av
BMCC1
har også blitt beskrevet, men ingen av dem inkluderer komplett sett av eksoner stede i
BMCC1-1
. (B) VISTA tomt på
BMCC1
genet . Peak høyder indikere grad av bevaring mellom arter av eksoner (blå) og evolusjonære konserverte regioner (ECR innenfor introner – rosa) sammenlignet med humant. Legg merke til at genet orientering er forskjellig i figur 2A, øvre og nedre paneler. Vi har beregnet den mutasjonshastigheten ved DNA-sekvensen som nivået ved sammenligning av humane og sjimpanse-sekvenser og anvendelse av en divergens på 6 millioner år (Myr). Mutasjonsraten i
PCA3
genet ble estimert til å være 1,26 × 10
-9 per nucleotide per år, høyere enn (1,00 × 10
-9 per nucleotide per år) i den ikke –
PCA3
del av
BMCC1
genet, noe som tyder på
PCA3
region kan ha en moderat høyere mutasjonsraten. Tre svært konservert ECRs innenfor
BMCC1
er arrowed (A, B Arrow «A» (ECR_in1, 277 bp) er en ekstremt konservert ikke-kodende sekvens med 91% likhet mellom mennesker og pungrotte som er plassert i intron 1 av
PCA3
; Arrow «B» (ECR_ex4c, 403 bp) en ECR posisjonert innenfor
PCA3
ekson 4 som er bevart i alle pattedyr, og ser ut til å ha vært arnested for den lineære utviklingen av
PCA3
-genet (se fig. 3); Pil «C» (361 bp) blir mest mulig sterkt konservert ECR (en konservert ikke-kodende sekvens med 99% likhet mellom human og opossum) i
BMCC1 plakater (intron 6) umiddelbart nedstrøms for
PCA3
.
To mRNA-sekvenser (AB050197 og BC019095) ble først kommenterte oppstrøms og nedstrøms
PCA3
. Disse to mRNA sekvenser var nylig fusjonert og kommentert som to isoformer av
BMCC1
genet (også kalt
PRUNE2
, NCBI Gene ID: 158471). Ifølge disse kartlegging steder,
PCA3
genet ligger i intron 6 av de lengre
BMCC1
isoform 1 (
BMCC1-1
). For å bekrefte dette vi søkte på
PCA3
sekvenser andre steder i det menneskelige genom og oppnådde bare en hit som nøyaktig kart til
BMCC1
genet locus.
BMCC1
genet er ~295 kb i lengde og har en motsatt gen orientering til
PCA3
. Nyere uttrykk studier indikerer at
BMCC1
behandling er mer komplisert enn først trodde, og består av fire variant isoformer som ikke var fullt kommenterte på NCBI (Build 36.2). Fig. 2A illustrerer det strukturelle forholdet mellom
PCA3 Hotell og
BMCC1
gener.
BMCC1
isoform-2 (
BMCC1-2 /PRUNE2-2 Twitter /BC019095 /NM_138818) omfatter de første 6 eksoner av
BMCC1
som kommenterte på NCBI (Build 36.2) .
BMCC1-2
opphører umiddelbart oppstrøms for
PCA3
genet. Isoform-3 (
BMCC1-3 /BMCC1 Twitter /ABO50197) rapportert av Machida et al. [23] ikke overlapper
BMCC1-2
men heller består av 13 forskjellige eksoner (eksoner 7-19) plassert umiddelbart nedstrøms
PCA3
. Transkripsjonsstart stedet for isoform-4 (
BMCC1-4 Twitter /KIAA0367 /BNIPXL /AY43213) rapportert av Soh og Low [24] ligger ytterligere nedstrøms innenfor andre exon av
BMCC1-3
. Isoform-en (
BMCC1-1 /PRUNE2-1 Twitter /NM_015225) på den annen side, er en ny beregnings generert referanse genet montasje bestående av 19 eksoner (NM_015225) stammer fra sammenslåing
BMCC1-2
og
BMCC1-3
og som hadde til nå manglet fullstendig transkripsjon støtte. Her har vi brukt RT-PCR primere spenner
BMCC1-2 Hotell og
BMCC1-3 plakater (Fig. 2A) og nukleotidsekvens analyse (resultater ikke vist) for å bekrefte eksistensen av
BMCC1-1
transkripsjon og bekreftet sitt uttrykk i PCA vev (se fig. 4A). Den større størrelse av
BMCC1-1
er også konsistent med den ~12 kb mRNA-transkript identifiseres ved Machida et al. [23].
PCA3
lokaliserer innen intron 6 (~110 kb) av
BMCC1-1
.
PCA3
representerer ca 25 kb av denne intron, men det er i motsatt retning til
BMCC1
. Tre av BMCC1 protein isoformene BMCC1-1 (3088 aa – NM_015225), BMCC1-3 (2724 aa) [23] og BMCC1-4 (769 aa) [24] har forskjellig koding startsider, men alle tre er in- ramme og inneholder nedstrøms BCH koding domene.
(A) Vista plottet viser bevarte strukturer i
PCA3 genet
. Bare primater synes å ha en komplett
PCA3
genet. De to evolusjonære konserverte regioner som deles av
BMCC1 Hotell og
PCA3 plakater (se Fig. 2B)
er arrowed plakater (pil A ~ ECR_ex4c og pil B ~ ECR_in1). Begge ECRs vises konservert hos pattedyr (identitet 90%). ECR_in1 er også til stede på dette området i kylling og øgle, men ikke i fisk, frosk, eller virvelløse dyr. (B) ECR_ex4c vises fokus til lineær utvikling strukturen i
PCA3
. (C) Sammendrag av pattedyr
PCA3
eksoner deler høy verne i forhold til menneske. Genet struktur annotering var basert på Bussemakers et al. [15]. Nivået av bevaring av
PCA3
eksoner i løpet av evolusjonen pattedyr øker 3 «→ 5» basert på nærværet av betydningsfulle ECR-enheter i hvert exon. Den nøyaktige sekvensen identitet for hele ekson mellom menneskelige og andre arter er vist i Tilleggs Tabell S2. Det er viktig å merke seg at ingen ECR fra
PCA3
eksoner ble funnet i noen ikke-pattedyr-arter i denne analysen.
cDNA ble fremstilt fra pasient vevsprøver inkludert åtte BPH, PCa eller PCA metastaser, henholdsvis for anvendelse i de følgende PCR-reaksjoner. (EN). RT-PCR utføres på BPH, PCA og metastaser (MET) med ulike sett av primere for
PCA3 Hotell og BMCC1 Øvre rad;
BMCC1-2
RT-PCR ved hjelp av en fremover primer for
BMCC1
ekson 5 (BMCC1-Ex5F) og en revers primer spesifikk for den utvidede form av ekson 6 (BMCC1-Ex7R) unik for
BMCC1-2
andre rad;
BMCC1-1
spesifikke RT-PCR bruker primere for
BMCC1
ekson 6 (BMCC1-Ex6F) og ekson 7 (BMCC1-Ex7R). Tredje rad;
BMCC1
-BCH region spesifikke RT-PCR ved hjelp av primere BCHF og BCHR. Fjerde rad;
PCA3
ble forsterket (35 sykluser) med primere som er spesifikke for
PCA3
isoform 5 ekson 1 (PCA3-5F og Ex1 /3R primer). 5
th rad; β
2microglobulin kontroll PCR (B). RT-PCR komparativ uttrykk analyse av
PCA3
,
BMCC1-1 Hotell og
BMCC1
-BCH region for ALVA41, DU145, LNCaP og PC3 prostatakreft linjer, RPWE1 en normal prostata cellelinje, JHP en styre lymfoblastoid cellelinje, RM654 en lymfoblastoid cellelinje fra en pasient med AOA2 og MCF7 brystcancercellelinje. RT-PCR ble utført med primer setter spesifikke for
PCA3
isoform 5 (PCA3-5F) og Exon 1/3 (Ex1 /3R) og for
BMCC1-1
og
BMCC1
-BCH region som angitt ovenfor. (C) Semi-kvantitativ PCR-analyse av
PCA3 Hotell og
BMCC1-1
uttrykk i LNCaP cellelinje som svar til dihydrotestosteron. Resultatene var normalisert i forhold til nivåer av β
2microglobulin. Fire cellekulturer ble sultet for serum i 2 dager før inkubasjon med dihydrotestosteron (ug /ml). Resultatene ble normalisert og uttrykt som midlere gangers økning i forhold til nivået av ekspresjon før behandling. Feilfelt er standardavvik og p-verdiene ble bestemt fra sammenligning med ubehandlede prøver ved hjelp av en t-test.
Har BMCC1 genet vært under valget?
Siden
PCA3
er integrert eller nestet i
BMCC1
det var av interesse å studere evolusjonære endringer i dette genet. BLAST søk avdekket at
BMCC1
homologer er til stede hos pattedyr, kylling og øgle, men ikke i afrikanske frosk, fisk eller invertebrater (Fig 2B). Vi brukte VISTA programvare for å utføre globale justering av
BMCC1
homologe gener. Justeringen i figur 2B viser at
BMCC1
bare er konservert fra menneske til hund /mus med unntak av en rekke svært konservert ECR som strekker seg fra menneske til øgle (inkludert de som er indikert med pil A og C på fig. 2B ).
Disse ECR ligger stort sett mellom
BMCC1
intron 6 og ekson 9 (også innenfor
PCA3
). Vi sammenlignet aminosyresekvenser basert på menneskelige og sjimpanse
BMCC1-1
CDS sekvenser. Den totale aminosyre lengde er 3088 (human) og 3089 (sjimpanse). Etter at vi justert menneske- og sjimpanse sekvensene, fant vi 40 ikke-synonyme mutasjoner og 21 synonymt mutasjoner. For hele regionen, er forholdet mellom ikke-synonyme løpet synonymt substitusjon rente (DN /DS) 0,90. En dN /dS-forhold større enn 1 i et kodende område antyder ofte positiv seleksjon. Exon 8 er den lengste ekson i
BMCC1 Hotell og har 6598 bp, som koder for 2199 aminosyrer. Vi har funnet at mesteparten av ikke-synonyme mutasjoner er i ekson 8, og antallet av ikke-synonyme mutasjoner [25] er nesten tre ganger høyere enn for synonyme mutasjoner [12]. DN /DS forholdet var 1,38, noe som tyder på en nylig positiv utvelgelse på dette region. Videre fant vi at 39 av de 40 ikke-synonyme erstatninger i
BMCC1
genet var i eksoner 8 og 9, som hadde bare 14 synonymt erstatninger. Det var bare en substitusjon, som er synonymt, i ekson 7. Når vi undersøkte eksoner 8-9 eller eksoner 7-9, vi konsekvent funnet at dN /dS forholdet var større enn 1 (eksoner 8-9, 1.30; eksoner 7 -9, 1,22), noe som tyder på en positiv utvelgelse i naboregionen
PCA3
.
PCA3
dukket opp hos pattedyr og nylig utviklet seg i primater
PCA3
er ikke så godt bevart hos pattedyr som
BMCC1 Hotell og ble ikke oppdaget tidligere i gnagere [15]. For å fastslå opprinnelsen på
PCA3
vi sammenlignet
PCA3
gensekvenser på tvers av arter. Vi utførte en global innretting av de 15 pattedyr
PCA3
ortologer. Fig. 3A viser en VISTA plott av konserverte regioner i
PCA3
genet regionen. En mer detaljert VISTA tomt med fokus på
PCA3
eksoner 2-4 er gitt i fig. 3B. Som beskrevet, er
PCA3
genet høyt konservert hos primater. For eksempel, sammenlignet med det menneskelige
PCA3
sekvens, alle fire ekson-sekvenser og de fleste av intronsekvensene i de fire primater har høy identitet med human (fig. 3A).
Sammenligning av sekvenskonservering blant disse 15 pattedyr, avslørte et lineært mønster av endring i forhold til disse fire exoner i løpet av evolusjonen pattedyr. Exon 4 er den desidert største ekson (3454 bp) og for sammenligningsformål ekson 4 ble delt (5 «→ 3») inn i 3 regioner [a, b og c tilsvarende de tre terminerings nettsider beskrevet av Bussemakers et al. [15]. ECR_ex4c, den konserverte delen av exon 4c som er beskrevet tidligere (se pilen «B» i fig. 2B og fig. 3) vises i alle 15 pattedyr, inkludert opossum, som er en ut-gruppe av de 14 eutherians. Mens opossum har bare denne ene konservert område i forhold til 4
PCA3
eksoner, gnagere har 1-2 små tilleggs ECRs i ekson 4b (Fig. 3A og 3B). Exon 4a dukket opp først i kanin. Exon 3 ble påvist i elefant, trespissmus, ku, hund, gris, hest, og i alle primater, men ikke i kanin, gnagere, eller pungrotte. I henhold til VISTA plottet en meningsfylt ekson 2 er bare til stede i gris, hest og alle primater (Fig. 3B).
Endelig ekson 1 er til stede i primater bare (fig. 3A). Denne lineære evolusjonære mønster av genet formasjonen er oppsummert i fig. 3C hvor resultatene tyder på at: (1) rester av
PCA3
genet dukket opp hos pattedyr; (2) disse restene senere gjennomgikk en lineær mønster av evolusjon: exon 4c → exon 4c /4b → ekson 4c /4b /4a → eksoner 4/3 → eksoner 4/3/2 → eksoner 4/3/2/1; og (3)
PCA3
ser ut til å modnes hos primater med alle deler et komplett utvalg av eksoner (Fig. 3C). Den nøyaktige sekvensen identitet for hver av de helt menneske
PCA3
eksoner sammenlignet med andre arter er vist i Tilleggs Tabell S2.
BMCC1 er oppregulert ved PCA og androgen induserbare
Siden
PCA3
er oppregulert ved PCA, og siden vi viste her at dette genet er innebygd i et annet gen
BMCC1
, innblandet i celleproliferasjon, vi avgjort om
BMCC1
var også forskjellig regulert ved PCA. Vi brukte et sett med RT-PCR primere som spenner den regionen i
BMCC1
genet (eksoner 6 og 7), spesielt for full-lengde
BMCC1-1
transkripsjon. Uttrykk for
BMCC1-1
var tydelig i normal prostata og BPH eksemplarer og ble oppregulert ved PCA og metastaser (figur 4A, Supplementary Fig. S4). Dette ble bekreftet ved anvendelse av primere som tilsvarer den BCH C-terminale område av BMCC1 og for BMCC1-2. Faktisk forsterkning av denne isoformen ga bedre diskriminering mellom PCa og BPH (Fig. 4A, øvre panel). Forløpende disse forsøk til PCa og andre cellelinjer avdekket at begge gener ble sterkt uttrykt, spesielt i PCA-cellelinjen LNCaP (Fig. 4B). I tillegg
BMCC1-1
ble oppdaget i en andre PCa cellelinje DU145 men på lavere nivåer.
PCA3
er også uttrykt i DU145 men krevde ytterligere runder med forsterkning for gjenkjenning. De kortere
BMCC1
isoformer (
BMCC1-3 Hotell og /eller
BMCC1-4
) ble også påvist (ved hjelp av primere spesifikke for BCH region) i en EBV-transformert lymfoblastoid cellelinje (JHP), men jo lenger
BMCC1-1
isoform ble ikke påvist (figur 4B). Tidligere data har vist at nivået av
PCA3
kan induseres i LNCaP-celler etter behandling med dihydrotestosteron, som etterligner virkningene av binding av androgen reseptor (DHT) [16]. Vi avgjort om
BMCC1-1
var også følsomme for hormonell induksjon. Resultatene i fig. 4C viser at både
PCA3 Hotell og
BMCC1
er maksimalt indusert i LNCaP cellelinje ved en konsentrasjon på 0,5 mM DHT.
Diskusjoner
Vi har avdekket her en rekke nye funn for
PCA3
biomarkør genet som er dramatisk oppregulert ved PCA. Bussemakers et al. [15] har tidligere vist at
PCA3
besto av 4 eksoner og at forskjellige transkripter oppsto på grunn alternativ spleising av exon 2 og nærværet av 3 polyadenyleringsseter i exon 4. Våre data indikerer at transkripsjonsenheten for
PCA3
er betydelig mer komplisert enn dette. I tillegg til transkripsjonsstartsetet rapportert av Bussemakers et al. [15] vi har identifisert 4 ekstra transkripsjon start steder strekker seg oppstrøms med over 1 kb som øker størrelsen på ekson 1 til 1,27 kb. Transkripsjonene initierende på disse nye områdene er forskjellig uttrykt med kortere isoform 4 (
PCA3-4
) mer høyt uttrykt ved PCA og metastaser. Schalken et al. [16] etablert som et fragment på 500 bp umiddelbart oppstrøms fra den opprinnelige transkripsjon start hotellet (beskrevet her som
PCA3-5
) har alle de kritiske aktivator og repressor nettsider for å kjøre
PCA3
uttrykk . Vår beskrivelse av tilleggs
PCA3
starte nettsteder videre oppstrøms av de to korte isoformer (
PCA3-4 Hotell og
PCA3-5
) er inne i en større transkriptom og at det er sannsynlig at andre kontrollelementer eksisterer lenger oppe. Denne ordningen av transkriptomet er ikke romanen så mange gener er ordnet i komplekse overlappende og interlaced mønstre i eukaryote genomer [26]. I denne rapporten utenom mekanismer er påberopt for prosessering på 3 «enden av karakterutskriften. Dette kan også være tilfelle ved 5 «enden. Vi beskriver også 2 nye forskjellig spleisede eksoner (eksoner 2a og 2b) for
PCA3
som ligger mellom ekson 1 og den opprinnelige ekson 2 (nå ekson 2c) [15].
