Abstract
Østrogener og tamoxifen (et anti-østrogen) utøver sine virkninger ved aktivering av østrogenreseptoren (ER) gjennom genomisk og ikke-genomiske mekanismer og er implisert i utviklingen av endometrial cancer. Tidligere rapporter har vist at østradiol og tamoxifen indusere spredning av menneskelige endometrial kreft celler gjennom GPR30 (ikke-genomisk ER) signalveien. Heri viser vi at fosforylering av fokal adhesjonskinase (FAK) er involvert i cellemigrering indusert av østradiol, tamoxifen og G1 (a GPR30 agonist) gjennom den transmembrane ER (GPR30) i endometrial cancer cellelinjer med eller uten ERα (Ishikawa og RL95 -2). I tillegg er GPR30-mediert cellemigrering ble ytterligere opphevet ved administrering av enten spesifikk RNA interferens målretting GPR30 eller en FAK-inhibitor. Videre har vi validert at signalanlegget mellom GPR30 og fosforylert FAK er faktisk formidlet av EGFR /PI3K /ERK veien. Klinisk en signifikant korrelasjon mellom nivåer av GPR30 og phophorylated FAK (pFAK) observert i menneskelige endometriekreft vev med lav eller uten ERα videre foreslått at østrogen-indusert fosforylering av FAK og cellemigrasjon ble mest sannsynlig utløst av GPR30 aktivering. Disse resultatene gitt ny innsikt for å forstå de patofysiologiske funksjoner av GPR30 i humane livmorkreft
relasjon:. Tsai C-L, Wu H-M, Lin C-Y, Lin Y-J, Chao A, Wang T-H, et al. (2013) Østradiol og Tamoxifen Frem Cell migrasjon gjennom GPR30 og Aktivering av Focal Heft kinase (FAK) i livmorkreft med lav eller uten Nuclear østrogenreseptor α (ERα). PLoS ONE 8 (9): e72999. doi: 10,1371 /journal.pone.0072999
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 22 mars 2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Tsai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants NSC-96-2314-B-182-016 og NSC-97-2314-B-182-014-My3 (til HSW) og NSC-99-2321-B-182A-003-My3 (til CLT ) fra National Science Council, Taiwan; og CMRPG381671 (til HMV) fra Chang Gung Memorial Hospital. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Østrogener bind og aktiverer østrogenreseptorer (ER) for å regulere transkripsjon av målgener [1] via genomisk og ikke-genomiske mekanismer. De genomiske (eller klassiske) østrogen vakte reaksjoner er gjennom kjernereseptorer ERα og ERβ [2]. ERα er reseptoren ansvarlig for 17β-østradiol (E2) -indusert signalering, mens funksjon av ERβ er i motsetning til den av ERα [3]. De genomiske ER signal virker som ligand-avhengig transkripsjonsfaktorer som direkte binder til østrogenresponselementer (eres) i promoterregionen av målgener og tar vanligvis timer til dager for å fremstille fysiologiske effekter i celler [4]. I motsetning til dette, er ikke-genomisk ER signalering gjennom en transmembran reseptor for østrogen [2], [5].
G-protein-koblet reseptor 30 (GPR30) er en funksjonell membran reseptor som er involvert i ikke-genomiske østrogen signale [6] – [8]. Den GPR30-mediert signalisering østrogen stimulerer cAMP-produksjon og intracellulær Ca
2 + mobilisering, og deretter aktiverer forskjellige kinaser som bidrar til cellevekst og migrasjon [2], [9], [10]. I brystcancerceller som mangler ende kravene, medierer GPR30 opp-regulering av c-fos-protein i nærvær av østrogener, som fører til fremming av celleproliferasjon [11]. I tillegg er både østradiol og tamoxifen indusere ekspresjon av
c-fos
og celleproliferasjon gjennom GPR30 (ikke-genomisk ER) signalveien i forskjellige cancere [12], [13]. Dessuten er det også klart at overekspresjon av GPR30 indikerer dårlig prognose av endometrial, ovarier og brystkreft [14] – [16]
Cellemigrering er påkrevet for invasjon av tumorer.. Fokal adhesjonskinase (FAK), en ikke-reseptor tyrosinkinase regulere cellulære signalbaner av cellemigrering [17], er involvert i dannelse og omsetning av kontaktklebesider [18], [19]. I tillegg har overekspresjon av FAK er vist for å indikere invasiv potensial og dårlig prognose i forskjellige humane cancere [20].
Langvarig utsettelse for endogene eller eksogene østrogener og tamoxifen (en østrogen-antagonist) er en av risikofaktorene for celleproliferasjon og migrasjon i livmorkreft [21] – [23]. Men effekten av østrogen på cellemigrasjon fra livmorkreft med lav eller uten ERα ikke tidligere er undersøkt, men tidligere studier har vist at østrogen induserer en hurtig fosforylering av FAK i endometriet stromaceller og kreftceller [23]. Noteworthily, er det fortsatt uklart om østrogener og tamoxifen bare stimulere spredning av endometrial celler
in situ
eller om de også gjengi disse cellene til å invadere på et lokalt område.
I denne studien, vi vist at behandling av østradiol (E2), G1 (en GPR30 agonist) og tamoxifen (4-hydroxytamoxifen, OHT) indusert fosforylering av FAK på Y397 og cellemigrasjon i livmorkreft cellelinjer. Den mekanistisk linken og klinisk relevans mellom GPR30 og FAK signale ble også demonstrert.
Materialer og metoder
Pasient og vevsprøver
Førti-ni pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Chang Gung Memorial Hospital (CGMH) og hadde patologisk bekreftelse av livmorkreft ble inkludert. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 98-2576B).
Cell kultur og reagenser
RL95-2 cellelinje, som stammer fra en godt differensiert adenokarsinom i endometrium [24], ble erholdt fra American Type Culture Collection. Den Ishikawa cellelinje, et godt differensiert endometrial adenokarsinom, er en gave fra Dr. Nishida (Kasumigaura Rikshospitalet, Japan) [25]. Ishikawa-celler ble holdt i minimum essensielt medium (α-MEM) inneholdende 15% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) og 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. RL95-2 celler ble dyrket i Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM /F12) med 10% føtalt bovint serum (FBS; Biological Industries, Israel), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Begge cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2. Cellene ble dyrket til 80% konfluens og overført til serumfritt medium i 24 timer før behandling med 17β-østradiol (E2), G1 og 4-hydroxytamoxifen (OHT) og medroksyprogesteronacetat (MPA). E2, OHT, G1, MPA (Sigma), lapatinib (en EGFR-inhibitor, GlaxoSmithKline plc, London, UK), FAK-inhibitor 14 (Tocris Bioscience, UK) og SRC-inhibitor 1 (sigma) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO).
fosforylering-kinase rekke
En fosforylering-kinase array (Proteome Profiler ™ Array kit, R 45) (p 0,0001) (tabell 1). Klinisk tilfeller med lav uttrykk for kjernefysisk ERα studert avsløre tegn på økt tilbøyelighet for invasjon (staging fra IB til IVA). Videre nivået av fosforylert FAK var signifikant korrelert med uttrykk av GPR30 i humane livmorkreft med lav ERα (p 0,05) (Fig. 5C), men ingen slik sammenheng ble funnet mellom ERα og pFAK plakater (figur 5D.).
(A) i kliniske prøver av human livmorkreft med lav ekspresjon av ERα (histoscore = 10), relativt høy ekspresjon av GPR30 (histoscore = 270) og pFAK (histoscore = 225) ble observert (40 x forstørrelse av objektet linse). (B) De histoscores både GPR30 og pFAK var lavere i menneskelivmorkreft med høy ER (histoscore 45, venstre panel) sammenlignet med de med lav ER (histoscore ≤45, panel til høyre). (C) Det var en positiv korrelasjon på histoscores mellom pFAK og GPR30 i menneskelivmorkreft med lav ERα. (D) Det ble ikke funnet i histoscores mellom pFAK og ERα i menneskelivmorkreft. NS.: Ikke signifikant
diskusjon
GPR30 blitt foreslått å virke som en steroid-reseptor lokalisert enten til celleplasmamembranen, eller til det endoplasmatiske retikulum og medierer hurtig virkning av østrogen [21], [22]. Det er også åpenbart at GPR30 utløser cellulær proliferasjon gjennom aktivering av phosphokinases, f.eks phosphatidyinositol 3-kinase (PI3K) og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), som respons på østrogen og tamoxifen [7], [8], [11]. Likevel er det noen rapporter som viser at østrogen virker uavhengig av GPR30 i enkelte spesifikke celletyper [39] – [42]. Spesielt, har en studie vist at GPR30 er i stand til å formidle østrogen handling, for eksempel svikt i å aktivere cAMP, ERK eller PI3K følgende østrogenbehandling, i endotelceller uten ERα og ERβ [41]. I denne studien, knockdown av GPR30 i RL95-2 og Ishikawa livmorkreftceller avskaffet E2 og tamoxifen indusert fosforylering av FAK og avskaffet den påfølgende celle migrasjon (fig. 2E, 2F, 3E og 3F), noe som indikerer at GPR30 er i stand til å formidle østrogen handling i livmorkreftceller med eller uten atom ERα.
Tamoxifen er en selektiv østrogen reseptor modulator (SERM), som fungerer som en ERα antagonist i brystet, men en svak østrogen i endometrium. Anti-kreft behandling med tamoxifen i brystkreft er knyttet til økt forekomst av livmorkreft [43] – [46]. Mekanistisk, aktiverer tamoxifen MAPK vei gjennom GPR30 å fremme spredning av endometrial kreft celler [47]. Som med fremming av celleproliferasjon, tamoxifen aktivert FAK-reaksjonsveien i begge RL95-2 og Ishikawa endometrial kreft-celler (fig. 3A, 3B, 3C og 3D). I tillegg resultatene involverer GPR30 uttømming indikerte at GPR30 var viktig å fremme tamoxifen-indusert cellemigrasjon i livmorkreft (fig. 3E og 3F). Kollektivt, er tamoxifen i stand til å provosere celle migrasjon via GPR30 i livmorkreftceller med eller uten atom ERα.
Det er bevis som viser at østrogen utløser epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) sti gjennom GPR30 i brystkreftceller [36 ]. Lapatinib er en tyrosin kinase inhibitor av EGFR og blokkerer EGFR nedstrøms signalisering i kreftceller [48]. I denne studien lapatinibs trykt fosforyleringen av FAK-indusert av både E2 og tamoxifen i endometrial kreft-celler (fig. 4E). I tillegg knockdown av EGFR-ekspresjon ved siRNA også hemmet E2- og tamoxifen-indusert fosforylering av FAK i endometrial kreft-celler (fig. 4D). Disse funn viste at EGFR er vesentlig i GPR30-mediert reaksjonsvei og ytterligere støtter tanken om at lapatinib, i kombinasjon med tamoksifen, kan anvendes på pasienter med brystkreft for å hindre utviklingen av endometrial cancer [49].
Cell migrasjon er en avgjørende egenskap av kreftceller som påvirker tumor invasiv potensial inn i tilstøtende vev. En bedre forståelse av mekanismen for cellemigrering indusert av østrogener er avgjørende for utvikling av effektive terapier for endometrial cancer. I denne forbindelse har FAK blitt anerkjent for å lokalisere til plasmamembranen på områder av fokal adhesjon komplekser dannelse og virker som en nøkkel regulator i cellemigrering og celle invasjon som involverer proteolytisk degradering av den ekstracellulære matriks [47]. Resultater fra denne studien viste også at FAK-reaksjonsveien spilt en viktig rolle ved formidling av cellemigrering indusert av E2 og tamoxifen i RL95-2 og Ishikawa endometrial kreft celler (fig. 3A, 3B, 3C og 3D). I tillegg har studier med hemmere og siRNA også vist at FAK-avhengig cellemigrasjon er mediert gjennom EGFR, PI3K og ERK (fig. 4A, 4B, 4C, 4D og 4E). Kollektivt, våre data antydet at østrogen-indusert cellemigrering er mediert gjennom aktivering av PI3K /ERK /FAK banen i endometrial kreft celler med lav eller uten kjerne ERα.
Noteworthily, er det også mulig at østrogen-induserte cellemigrering er mediert gjennom bindevev vekstfaktor (CTGF). En tidligere rapport har vist at CTGF er en GPR30 target gen og GPR30 signale fremmer celle migrasjon gjennom CTGF induksjon i ER-negative menneskelige brystkreft celler [37]. Denne veien må vurdere å ytterligere belyse mekanismen av østrogen-indusert cellemigrasjon i livmorkreftceller.
Patologisk, er type 1 menneskelige livmorkreft østrogen-sensitive og har god prognose, mens type 2 menneskelige livmorkreft er ikke forbundet med økt eksponering for østrogen og bære dårligere prognose [50]. I den foreliggende undersøkelse, ble human livmorkreft (n = 24) med lav ERα funnet å uttrykke høyere nivåer av GPR30 og pFAK i forhold til de (n = 25) med høy ERα (fig. 5B og tabell 1). I tillegg GPR30 og pFAK var positivt korrelert i humane livmorkreft med lav ERα, men ingen slik sammenheng ble funnet mellom ERα og pFAK (fig. 5C og 5D). Resultatene fra de
in vivo
studier indikerte at livmorkreft med lav ERα kan være ekstremt følsomme for østrogen. Følgelig kan disse livmorkreft med lav ERα uttrykker høyere nivåer av GPR30 og pFAK selv med lave sirkulerende serumnivåer av østrogen og uten tilsetting av eksogent østrogen, som innebærer at de har et potensial til å invadere tilstøtende vev.
