Abstract
pentaspan membran glykoprotein CD133 (også kjent som prominin-1) har vært mye brukt som en markør for både kreft og normale stamceller. Imidlertid har funksjonen av CD133 ikke klarlagt. Her beskriver vi en kreftstamcellelinje etablert fra klarcellet karsinom i eggstokken (CCC) og viser at CD133 samhandler med plakoglobin (også kjent som γ-catenin), en desmosomal linker protein. Vi viser videre at knockdown av CD133 ved RNA-interferens (RNAi) resulterer i en nedregulering av desmoglein-2, en desmosomal cadherin, og opphever celle-celle adhesjon og tumorigenisitet av CCC stamceller. Vi spekulerer i at CD133 kan være et lovende mål for kreft kjemoterapi
Citation. Koyama-Nasu R, Takahashi R, Yanagida S, Nasu-Nishimura Y, Oyama M, Kozuka-Hata H, et al. (2013) Kreft Stem Cell Marker CD133 samhandler med Plakoglobin og kontroller desmoglein-2 protein nivåer. PLoS ONE 8 (1): e53710. doi: 10,1371 /journal.pone.0053710
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 26 september 2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 10 januar 2013
Copyright: © 2013 Koyama-Nasu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Research Program of Innovative Cell Biology av Innovative Technology (Integrated Systems Analysis of Cellular Oncogene Melde Networks), Grants-in-Aid for Scientific Research på innovative områder (Integrative kreftforskning mikromiljøet Network) og for Scientific Research (C), Takeda Science Foundation og delvis av Global COE Program (Integrative Life Science Basert på studier av Biosignaling Mekanismer), MEXT, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cancer stamceller antas å ha kapasitet til å spre seg og fornye seg selv og å være ansvarlig for tumorigenesis, metastaser og tilbakefall [1], [2]. Tilstedeværelsen av kreft stamceller har blitt vist i en rekke forskjellige tumorer [1]. Spesielt har glioblastom stamceller blitt grundig studert som de kan opprettholdes i serum-fritt medium som favoriserer veksten av nevrale stamceller [3]. Imidlertid er det fremdeles vanskelig å opprettholde og øke kreft stamceller avledet fra andre vev
in vitro
. I denne studien har vi klart å etablere en kreftstamcellelinje fra klarcellet karsinom i eggstokken (CCC), som har den verste prognosen blant epitelial eggstokkreft [4] og viser at CD133 samhandler med plakoglobin styrer desmoglein-2 protein nivåer og er nødvendig for celle-celle adhesjon og tumorigenicity av CCC stamceller.
Resultater og diskusjon
Vi dyrket CCC stamceller isolert fra en pasient diagnostisert med CCC under serumfrie betingelser. I likhet med glioblastom stamceller [5], CCC stamceller vokste eksponentielt på laminin-belagt retter under serumfrie betingelser (Fig. 1A og S1 A). Som rapportert tidligere for andre krefttyper [3], [6], [7], CCC stamceller gått differensiering når de dyrkes i serumholdig medium (CCC differensierte celler): de oppviste en svak morfologisk endring (figur 1A.), Og den uttrykk nivåer av stamcellemarkører, slik som
CD133 product: [8],
SOX2 product: [9] og
Lgr5 product: [10], ble betydelig redusert (fig. 1B) . Når CCC stamceller ble subkutant injisert i immunkompromitterte mus, alle musene utviklet svulster som var histopathologically lik deres opprinnelige svulsten (Fig. 1C og S1B). I motsetning til ingen av mus transplantert med CCC differensierte celler utviklet svulster, til tross for deres evne sprer eksponentielt
in vitro plakater (Fig. 1C og S1A).
(A) CCC stilk og differensiert (diff) celler i kultur. Fasekontrast fotografier er vist. (B) Et mRNA-nivåene av de angitte gener ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR og vist som gangers forandring i løpet av mRNA-nivåer i CCC stamceller. Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3). (C) CCC stilk eller differensierte celler ble subkutant transplantert inn nog mus (
n
= 3). Syv måneder etter transplantasjonen, mus (øvre) og tumorer (lavere) ble fotografert. (D) eluerer fra immunopurified CD133 fra membranfraksjonen av CCC stamceller ble oppløst ved SDS-PAGE og visualisert ved sølvfarging. (E) desmosomal proteinene identifisert ved hjelp av massespektrometri. Antallet unike peptider identifisert vises. (F) Prøver ble fremstilt som beskrevet i (D) og immunoblottet med antistoffer mot de angitte proteiner. (G) samlokalisering av CD133 (rød) med desmosomale proteiner (grønn). CCC stamceller ble immunostained med antistoffer mot de angitte proteiner. TO-PRO-3-jodid ble brukt for nukleær DNA-farging (blå). Skala barer representerer 20 mikrometer.
uttrykk for CD133 er strengt begrenset til en sjelden befolkning på somatiske og kreftstamceller [8]. Det er derfor vanskelig å oppnå et tilstrekkelig antall celler for å utføre biokjemiske analyse av CD133-holdige proteinkompleks. Å dra nytte av evnen til CCC stamceller til å vokse eksponensielt og opprettholde høy uttrykk nivåer av CD133
in vitro
, vi dro ut for å immunopurify den endogene CD133 kompleks. CD133 ble immunopresipitert fra membranfraksjonen med anti-CD133 antistoff og etter bekreftelse ved hjelp av SDS-PAGE og sølvfarging, ble immunopresipitatene kastet væskekromatografi-massespektrometri (Fig. 1D). Blant co-rensede proteiner identifisert (tabell S1), fokuserte vi vår oppmerksomhet på plakoglobin og desmoplakin (fig. 1E), fordi de er komponenter av den desmosom, som formidler celle-celle-adhesjon [11]. Desmosomes er junctional komplekser bestående av medlemmer av cadherin familien av celleadhesjonsprosesser proteiner og knytte proteiner som fester celleoverflate adhesjonsproteiner til intracellulære keratin cytoskeletal filamenter. Plakoglobin og desmoplakin funksjon som de viktigste desmosomale knytte proteiner.
Vi har bekreftet evne CD133 til å samhandle med plakoglobin av
in vivo
rullegardin analyser. Når et lysat fra CCC stamceller ble underkastet immunoutfelling med anti-CD133 antistoff, etterfulgt av immunblotting med anti-plakoglobin antistoff, ble plakoglobin funnet å ha ko-immunopresipitert med CD133 (fig. 1F). Plakoglobin ble ikke oppdaget da kontroll IgG ble brukt for immunoprecipitation. Men våre
in vitro
pull-down-analyser ikke klarte å påvise ko-utfelling av plakoglobin med fragmenter inneholdende de enkelte cytoplasmatiske domener av CD133 (data ikke vist). Dette kan være fordi membranen topologien av CD133 er viktig for dens assosiasjon med plakoglobin. Alternativt CD133 kan ikke knyttes direkte til plakoglobin. Resultater med desmoplakin var mangelfulle, så det co-utfelt med enten anti-CD133 antistoff eller kontrollere IgG i henhold til våre eksperimentelle forhold.
Immunhistokjemisk analyse av CCC stamceller avslørt at CD133 og plakoglobin samlokalisert innen regioner i cellen -celle kontakt (fig. 1G). CD133 farging ble ikke oppdaget når cellene ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133 (Fig. 2C), som indikerer spesifisiteten av anti-CD133 antistoff. Desmoplakin ble funnet delvis co-lokalisere med CD133 (Fig. 1G).
(A) CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133. Celler ble utsatt for mekaniske påkjenninger ved pipettering i PBS inneholdende 1 mM CaCl
2 og 0,5 mM MgCl
2. Representative bilder vises (øverst). Den søylediagram som viser forholdet mellom celletallet /klyngenummer (nedre). Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3).
p
= 0,011 med sammenligning til å kontrollere shRNA av t-test. (B) CCC stamceller ble behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot de angitte proteiner. (C) CCC stamceller ble behandlet som beskrevet i (A). Celler ble immunostained med antistoffer mot de indikerte proteiner (rød). TO-PRO-3-jodid ble brukt for nukleær DNA-farging (blå). Skala barer representerer 20 mikrometer. (D) CCC stamceller ble behandlet som beskrevet i (A). Celler ble subkutant transplantert inn immunsupprimerte mus (
n
= 3). Elleve måneder etter transplantasjon, ble mus (øverst) og tumorer (midten) fotografert. Den søylediagram som viser tumorvekt (lavere). Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3).
p
= 0,007 med sammenligning til å kontrollere shRNA av t-test.
Vi utførte immunhistokjemisk analyse av desmoglein-2 og desmocollin-2, to desmosomale cadherins som kommer til uttrykk i CCC stamceller . Vi fant ut at disse proteinene også samlokalisert med CD133 (Fig. 1G). I særdeleshet, CD133 og desmoglein-2 hadde svært like fordelingsmønster. Imidlertid er verken desmoglein-2 eller desmocollin-2 kunne påvises i CD133 immunutfelninger, noe som indikerer at de ikke er fysisk tilknyttet (fig. 1F). I motsetning til dette ble plakoglobin immunopresipitater funnet å inneholde CD133 samt desmosomale cadherins (fig. 1F). Til sammen tyder disse resultater på at CD133 samvirker med plakoglobin, men ikke med den desmosomal proteinkompleks som inneholder desmoglein-2 og desmocollin-2.
neste undersøkt rollen til CD133 i regulering av celle-celle adhesjon. Vi har observert at CCC stamceller ikke lett kunne dispergeres ved pipettering. Imidlertid, når cellene ble infisert med en lentivirus som uttrykker en shRNA rettet mot CD133, cellene kan bli dispergert ved pipettering (fig. 2A). Videre hengende dråpe celle aggregering analyser viste at CD133 knockdown cellene ikke samle tett og kunne bli spredt ved å pipettere (fig. S2). Således kan CD133 være viktig for den adhesjon av CCC stamceller. For å belyse den molekylære mekanismen bak denne reduksjonen i celle-celle adhesjon, undersøkte vi uttrykket nivåer av desmosomale proteiner. Immunoblotting og RT-PCR-analyser avslørte at knockdown av CD133 resulterte i en reduksjon i nivåene av desmoglein-2-protein, men ikke
desmoglein-2
mRNA (fig. 2B og S3A), et resultat som ble bekreftet ved hjelp immunhistokjemi (fig. 2C).
knockdown av CD133 ved hjelp av en distinkt shRNA også resultert i nedregulering av desmoglein-2 (fig. S3b). Lignende resultater ble oppnådd med det humane tarm epitelcellelinje Caco-2, som også uttrykker høye nivåer av CD133 [12] (fig. S3C). I tillegg knockdown av CD133 førte til en svakt diffust lokalisering av plakoglobin (Fig. 2C). Videre har vi funnet at knockdown av plakoglobin resulterte i en reduksjon i nivåene av desmoglein-2-protein (fig. S3D, E). I samsvar med disse resultatene, hengende dråpe celle aggregering analyser avslørte at knockdown av desmoglein-2 resulterte i en reduksjon i adhesjon av CCC-celler (fig. S2). Disse resultatene tyder på at CD133 er nødvendig for stabilitet og riktig lokalisering av desmosomale proteiner.
CD133 er mye brukt for å isolere en rekke kreft stamceller, herunder CCC av eggstokk [8], [13]. Imidlertid har sin funksjonelle bidrag til tumorigenesis vært uklar. Celle-celle-adhesjon er en iboende egenskap av faste tumorer, og flere rapporter har antydet at desmoglein-2 er avgjørende for tumordannelse av flere epiteliale tumorer [14]. Derfor undersøkte vi potensielle rolle CD133 i tumorigenitet av CCC stamceller ved hjelp av en shRNA-koding lentivirus til stabilt knockdown CD133 uttrykk. Soft-agar-kolonidannende analyser viste at knockdown av CD133 resulterte i en reduksjon i den kolonidannende evne CCC stamceller (fig. S4). I tillegg knockdown av desmoglein-2 også redusert kolonidannelse. Når CD133-knockdown celler ble subkutant injisert i immunkompromitterte mus, vokste de på et betydelig redusert hastighet i forhold til kontrollcellene (Fig. 2D). Dette resultatet tyder på at CD133 er nødvendig for tumordannelse av CCC stamceller.
I denne rapporten, vi demonstrert at CD133 samhandler med plakoglobin og styrer celle-celle-adhesjon i CCC stamceller. Av spesiell interesse er det faktum at knockdown av CD133 i CCC stamceller forårsaket en reduksjon i nivåene av desmoglein-2. Den mekanismen som CD133-plakoglobin komplekset stabiliserer desmoglein-2 gjenstår å undersøkes. I blodkreft stamceller, er CD133 kjent for å bli beriket på nettstedene til kontakt med osteoblasts [15]. Således kan CD133 fungere i både kreft og normale stamceller som en regulator av celle-celle interaksjoner. Vi viste videre at CD133 er viktig for den tumorigenisitet av CCC stamceller. Dette funnet er i samsvar med tidligere rapporter som viser at desmoglein-2 er involvert i tumordannelse [14]. Det er derfor interessant å spekulere i at CD133 og /eller desmoglein-2 kan være terapeutiske mål for CD133-positive epiteliale kreftstamceller.
Materialer og metoder
Tumor Prøve og cellekulturer
studiet ble godkjent av etikkomiteen for Biomedical Research av Jikei Institutional Review Board, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Tumorprøve klassifisert som klarcellet karsinom i eggstokken ble hentet fra en pasient som gjennomgår kirurgisk behandling ved Jikei universitetssykehus. Svulster ble vasket, og mekanisk og enzymatisk dissosiert til enkeltceller. Tumorceller dyrket på laminin (Sigma) -belagt rett i DMEM /F-12 medium (Life Technologies) inneholder B27 supplement (Life Technologies), EGF og FGF2 (20 ng /ml hver, Wako Pure Chemical Industries). For
in vitro
differensiering, tumorceller ble dyrket i DMEM /F-12 medium (Life Technologies) inneholdende 10% føtalt bovint serum. 293ft og Caco-2-celler ble dyrket i DMEM (Nissui) inneholdende 10% føtalt bovint serum.
Subkutane xenotransplantater
En uke etter lentivirusinfeksjon, 1 x 10
5-celler ble injisert subkutant i seks uker gamle Nog mus (Central Institute for forsøksdyr) (
n
= 3). Svulster ble histologisk analysert etter hematoxylin og eosin (HE) farging. Denne studien ble godkjent av Animal etiske komité, The University of Tokyo, Tokyo, Japan. Alle dyr eksperimentelle protokollene ble utført i samsvar med politikken i etikkomiteen Animal, The University of Tokyo, Tokyo, Japan.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp NucleoSpin RNA Clean -up kit (Takara) og revers-transkribert til cDNA ved hjelp PrimeScript RT Master Mix (Takara). Real-time PCR ble utført ved hjelp LightCycler480 SYBR Grønn jeg Master og en LightCycler480 Instrument (Roche). Resultatene ble normalisert med påvist verdi for
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)
. Primere som brukes i real-time PCR var som følger:
GAPDH
fremover (5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «),
GAPDH
revers (5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′);
CD133
fremover (5′-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 «),
CD133
revers (5′-CTCCGAATCCATTCGACGATAGTA-3′);
SOX2
fremover (5′-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3 «),
SOX2
revers (5′-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3′);
Lgr5
fremover (5′-GATTTCCTGCTTGACTTTGAGG-3 «),
Lgr5
revers (5′-GCAGGTGTTCACAGGGTTTG-3′);
plakoglobin
fremover (5′-GATCTTCCGGCTCAACACC-3 «),
plakoglobin
revers (5′-GATGTTCTCCACCGACGAGT-3′);
desmoglein-2
fremover (5′-GGAAATTTTCAAGCTTTTGATGA-3 «),
desmoglein-2
revers (5′-CCACAGAGATCCAATTATCTCTATCTT-3′).
Antistoffer
mus monoklonalt antistoff (mAb) til CD133 (AC133) ble oppnådd fra Miltenyi Biotec. Mouse mAb til desmocollin-2/3 (7G6), desmoglein-2 (6D8) og α-tubulin var fra Santa Cruz Biotechnology. Mouse mAb til plakoglobin var fra BD Biosciences. Mouse mAb til GAPDH var fra Millipore. Mouse mAb til desmoplakin (2Q400) var fra Abcam og brukes for immunhistokjemi. Kanin polyklonalt antistoff (pAb) for å desmoplakin var fra Abcam og anvendt for immunblotting.
Immunoutfelling og Immunoblotting
Membranfraksjonen av celler ble lysert i lyseringsbuffer [50 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM ditiotreitol og protease-inhibitor cocktail (Roche)] (fig. 1D). Alternativt ble membranfraksjonen lysert i lyseringsbuffer inneholdende 1% digitonin i stedet for NP40 (fig. 1F). Lysater ble inkubert med anti-CD133, anti-plakoglobin eller kontroll lgG1 immobilisert på aktivert CH-Sepharose 4B (GE Healthcare) i 4 timer ved 4 ° C. Etter fem vaskinger med lyseringsbuffer, ble bundne proteiner eluert med 100 mM glysin-HCI og underkastet trypsin fordøyelse. Etter avsaltet med ZipTip (C18; Millipore), ble prøven underkastet væskekromatografi-massespektrometri. For immunoblotting ble de eluerte proteinene fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Immobilon-P, Millipore). Membranen ble underkastet immunblotanalyse ved anvendelse av alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus eller kanin IgG (Promega) som sekundære antistoffer. Visualisering ble utført ved hjelp av NBT /BCIP kolo underlaget system (Promega).
massespektrometrisk analyse og Protein Identifikasjon
hagle proteomikk analyser ble utført av en lineær ionefelle-orbitrap massespektrometer (LTQ- Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific) kombinert med nanoflow LC system (Dina-2A, KYA Technologies) som beskrevet tidligere [16]. Protein identifikasjon ble utført ved å søke MS og MS /MS-data mot RefSeq (National Center for Biotechnology Information) humant protein database (32,968 proteinsekvenser per 12.09.2011) med Mascot ver. 2.3.02 (Matrix Science). Metionin oksidasjon, protein N-terminal acetylering og pyro-glutamination for N-terminal glutamin ble satt som variable modifikasjoner. Maksimalt to tapte spaltinger ble tillatt i vår database søk og toleranse for masse avvik ble satt til 3 deler pr million (ppm) for peptid masser og 0,8 Da for MS /MS topper, respektivt. Protein identifikasjon var basert på kriteriet om å ha minst en MS /MS-data med Mascot score som oversteg grensene (
p
0,01).
RNA interferens
de shRNA oligonukleotidsekvenser var som følger: CD133 # 1 (5′-GGAUACACCCUACUUACUAAA-3 «), CD133 # 2 (5′-GCACUCUAUACCAAAGCGUCA-3′), desmoglein-2 # 1 (5»-GUUAGCGAGAGCAUGGAUAGA-3 «), desmoglein -2 # 2 (5»-GCAUUAUCAGUAAUAAUUUGU-3 «), plakoglobin (5′-GAGCAUGAUUCCCAUCAAUGA-3»).
Lentivirus Produksjon
Lentiviral vektor (CS-RFA-CG) som uttrykker en shRNA drevet av H1 promoter ble transfektert med emballasje vektorer pCAG-HIV-gp og pCMV-VSV-G-RSV-Rev inn 293ft celler ved hjelp Lipofectamine 2000 Transfeksjon Reagens (Life Technologies). Alle plasmider ble vennlig levert av H. Miyoshi (Riken Bioresource Center, Japan). Viral supernatant ble renset ved hjelp av ultrasentrifugering ved 25 000 rpm i 90 min (SW28 rotor, Beckman). Infeksjon Effektiviteten ble registrert grønn fluorescens protein (GFP) uttrykk som den er drevet av CMV-promoteren.
Immunhistokjemi
Celler ble sådd ut på laminin-belagte dekkglass og fiksert med iskald metanol . Celler ble inkubert med primære antistoffer etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer konjugert med Alexa 488 eller 594 (Life Technologies). For visualisering CD133, ble celler inkubert med anti-CD133 antistoff konjugert til R-fykoerytrin. TO-PRO-3-jodid (Life Technologies) ble anvendt for nukleær DNA-farging. Celler ble fotografert med en LSM510 META laser scanning mikroskop (Carl Zeiss).
celledissosiasjon analysen
5 × 10
4 celler ble sådd i laminin-belagte 12-brønners plater. Cellene ble løsnet fra dyrkningsskåler med en celleskrape og ført 10 ganger gjennom en 200-mL pipettespissen i PBS inneholdende 1 mM CaCl
2 og 0,5 mM MgCl
2. Bildene ble tatt ved fasekontrastmikroskopi. Graden av celledissosiasjon var representert ved forholdet mellom celletallet /klyngenummer.
hengende dråpe Cell Aggregation Assay
Cellene ble trypsinert, vasket med PBS og resuspendert til 5 x 10
5 celler per milliliter i medium. 7,5 x 10
3-celler ble suspendert i hengende dråper fra lokket av kulturskål og fikk aggregere over natten. For triturering ble celler ført 10 ganger gjennom en 200-mL pipettespissen. Bildene ble tatt ved fasekontrastmikroskopi. Størrelsen på partiklene ble målt ved hjelp ImageJ 1.46r programvare.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Karakterisering av CCC stamceller. (A) Kinetikken for Formerinasanalyse CCC stamceller. CCC stem og differensierte (diff) celler ble dyrket i de angitte tidsrom. Baren diagrammet representerer dag (
x
-aksen) og celletall (
y
-aksen). (B) Histopatologisk analyse av tumor-xenografter. HE farging av et CCC stamceller xenograft og pasient svulsten er vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053710.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
CD133 og desmoglein-2 er nødvendig for adhesjon av CCC stamceller. CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133 eller desmoglein-2. Celler ble sådd på hengende slipp kulturer og lov til å aggregere over natten. Før (-) og etter (Triturerings) celler ble utsatt for mekaniske påkjenninger ved pipettering, ble bilder tatt fra fasekontrastmikroskopi (øvre). Den søylediagram som representerer midlere partikkelstørrelse i forhold til celler som uttrykker kontroll shRNA (nedre). Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3). NS, ikke signifikant; *,
p
0,05 av t test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053710.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
CD133 og plakoglobin kontrollere uttrykket nivåer av desmoglein-2. (A) CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133. MRNA nivåene av de angitte gener ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR og vist som gangers forandring i løpet av mRNA-nivåer i celler som uttrykker kontroll shRNA. Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3). (B) CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133 (CD133 shRNA 2 #). Cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot de angitte proteiner. (C) Caco-2 celler ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133. Cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot de angitte proteiner. (D) CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting plakoglobin. Cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer mot de angitte proteiner. (E) CCC stamceller ble behandlet som beskrevet i (D). MRNA nivåene av de angitte gener ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR og vist som gangers forandring i løpet av mRNA-nivåer i celler som uttrykker kontroll shRNA. Feilfelt representerer S.D. (
n
= 3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053710.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
CD133 og demoglein-2 er nødvendig for forankringsuavhengig vekst av CCC stamceller. CCC stamceller ble infisert med et lentivirus uttrykke en shRNA targeting CD133 eller desmoglein-2. Celler ble sådd ut i myk-agar og dyrket i 2 uker. Baren diagrammet representerer kolonien antall i forhold til celler som uttrykker kontroll shRNA. Feilfelt representerer S.D. (
n
= 4). *,
p
0,05 med sammenligning til å kontrollere shRNA av t test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053710.s004 plakater (TIF)
Tabell S1.
Komplett liste av peptider identifisert i massespektrometrisk analyse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0053710.s005 plakater (XLSX)
