Abstract
22Rv1 er en vanlig prostatakreft cellelinje som brukes i xenograft museforsøk samt? in vitro cellekulturanalyser for å studere aspekter ved prostatakreft tumorigenesis. Nylig ble denne cellelinjen vist til båtplass flere kopier av et gammaretrovirus, kalt XMRV, integrert i sitt genom. Mens den opprinnelige prostata kreft-xenograft CWR22 er fri for retrovirus, og senere som genereres cellelinjer 22Rv1 og CWR-R1, bære dette viruset og i tillegg felle infeksiøse gammaretroviral partiklene i deres supernatanten. Selv om XMRV mest sannsynlig ble dannet ved rekombinasjon i cellekultur dette viruset er blitt vist til å infisere humane celler in vitro og 22Rv1 samt CWR-R1 celler blir nå betraktet biosikkerhet 2-reagenser. Her viser vi at 22Rv1 celler med redusert retrovirale transkripsjon viser redusert tumor angiogenese og økt nekrose av den primære svulsten avledet fra xenopodet celler i SCID-mus i forhold til den parentale cellelinje. Tilstedeværelsen av XMRV transkripsjoner øker betydelig sekresjon av osteopontin (OPN), CXCL14, IL13 og TIMP2 i 22Rv1 celler. Videre er disse dataene støttes av in vitro celle invasjon og differensieringsanalyser. Kollektivt, våre data tyder på at tilstedeværelsen av XMRV transkripter i det minste delvis bidrar til 22Rv1 egenskaper observert in vitro og in vivo med hensyn til migrasjon, invasjon og tumorangiogenese. Vi foreslår at data mottas med 22Rv1 celler eller tilsvarende celler som bærer xenotropisk gammaretroviruses bør kontrolleres nøye, inkludert andre prostatakreft cellelinjene som ble testet for virale sekvenser
Citation. Stieler K, Schumacher U, Horst AK, Fischer N (2012 ) XMRV Induserer Cell Migrasjon, cytokin uttrykk og Tumor Angiogenese: Er 22Rv1 Cells en egnet prostatakreft Model? PLoS ONE syv (7): e42321. doi: 10,1371 /journal.pone.0042321
Redaktør: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Republikken Korea
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © 2012 Stieler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den vanligste typen av kreft hos menn i vestlige samfunn med mer enn 350.000 nydiagnostiserte kreftformer og over 90.000 faktiske dødsfall per år, utelukkende i Europa, og dermed representerer et alvorlig samfunnsøkonomisk problem. Prostatakreft reflekterer en heterogen og flertrinns sykdom som gir en utfordring i å utvikle egnede in vitro- og in vivo-modeller
In vitro-modeller er avhengige av noen få prostatakreftcellelinjer er tilgjengelige [1] som er av epitelial opprinnelse.: de mest vanlige cellelinjene som brukes er LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] og som en felles xenograft modell også 22Rv1 celler [5]. Disse cellelinjene servert i det siste, og er fortsatt ofte brukt, som modeller for å undersøke tumorprogresjon, invasjon, metastaser, nye terapeutiske strategier samt resistens. Transplantert inn i immundefekte mus disse cellelinjene produserer tumorer som er lik den paren tumor [5]. Slike in vivo xenograft modeller har blitt etablert ved hjelp av LNCaP celler, 22Rv1 eller PC3 celler podet i immunodeficient SCID, naken eller NOD-SCID mus. I fravær av en ideell musemodell stiller hyper og hyperplasi i epitelceller (prostatahyperplasi intraepitelial neoplasi, PIN), høyverdig PIN (HGPIN), adenokarsinomer og invasive prostata karsinom (mus naturligvis ikke utvikler PC), xenograft mus eksperimenter med vev skiver eller humane prostatacancercellelinjer er utbredt.
22Rv1 er avledet fra et tilbakefall xenopodet svulst CWR22 som er blitt serielt transplantert i nakne mus [5]. I 2009 har 22Rv1 celler vist seg å bære flere integrerte kopier av gammaretrovirus XMRV (xenotropisk murine leukemi virus relaterte virus); Disse celler produserer høy-titer av viruset i kultursupernatanten [6]. Nyere arbeider gir bevis for at to cellelinjer generert fra en xenograft tumor CWR22, 22Rv1 (CWR22Rv1) og CWR-R1, produsere smittsomme XMRV partikler i deres supernatant [7].
XMRV er opprinnelig identifisert i prostata vev fra pasienter med familiær prostatakreft [8]; påfølgende arbeid gitt bevis for XMRV protein uttrykk i opptil 23% av alle prostata kreft tilfeller [9]. Men flere studier ikke klarte å oppdage XMRV i prostatakreft prøver ved hjelp av PCR eller IHC metoder [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] på grunn av den manglende sekvens variasjon av XMRV genfragmenter i pasientenes isolater sammenlignet med sekvensen variasjon identifiseres i en XMRV positiv cellelinje 22Rv1 ble det postulert at XMRV kan være et laboratorium forurensning i stedet for en sann eksogent menneskelig virus [20]. Disse dataene er styrket av nyere data av Paprotka og kolleger analysere ulike passasjer av CWR22 xenografter: XMRV er tilstede i 22Rv1 celler og CWR-R1 celler, men tidlige passasjer av CWR xenograft ikke bære noen påvisbare XMRV sekvenser. Disse dataene er i favør av en rekombinasjon hendelse i løpet aging av xenograft CWR22, og dermed generere XMRV [7].
22Rv1 celler er en vanlig brukt preklinisk modell av prostatakreft [21], [22], [23] . Bare nylig ble denne cellelinje er klassifisert som et biosikkerhetsnivå 2-cellelinjen. Denne cellelinjen produserer høye titere av xenotropisk gammaretroviral partikler som kan infisere humane celler [6], [7]; innavlede mus celler vanligvis bærer en mutasjon i reseptoren av disse virusene, som kalles Xpr1, og er ikke ettergivende for denne gruppe virus. Men visse museceller (viltlevende mus og noen innavlede stammer som bærer den aktuelle reseptor-allelet [24], [25]), kan være infisert med viruset. Forsiktig for tolkningen av data utelukkende som følge av 22Rv1 celler som bærer viruset har vært diskutert tidligere [26] men ikke direkte omtalt i in vivo eller in vitro eksperimenter.
I denne studien analyserte årsakssammenheng mellom den vi gammaretrovirus XMRV og transformert fenotype av 22Rv1 celler ved hjelp av in vitro analyser som vanligvis brukes til å studere celleproliferasjon, migrasjon og differensiering ved å sammenligne 22Rv1 celler og 22Rv1 celler med redusert virustiter i xenograft mus eksperimenter in vitro migrasjon, invasjon og tube dannelse analyser. Vi gir bevis for at gammaretrovirus XMRV bidrar vesentlig til tumorigenesis av 22Rv1 xenotransplantater hos mus. Disse observasjonene er støttet av in vitro-resultater som viser forskjeller i cytokine release i 22Rv1 celler infisert med XMRV og 22Rv1 celler med redusert virus transkripsjoner. Videre gir vi bevis for at XMRV infeksjon i prostata stromal fibroblaster betydelig induserer endringer i frigjøring av cytokiner. Vi observerer forskjeller i cellemigrasjon fra LNCaP-celler når de anvendes i in vitro-cellemigrering og invasjons analyser sammen med kultursupernatant fra stromale celler infisert med XMRV; supernatanten av celler infisert med amfotrofiske gammaretroviruses eller XMRV env pseudotyped virus som partikler ikke påvirker celle migrasjon av LNCaP celler indikerer at dette påvirker er spesifikke for XMRV og ikke avhengig av reseptor interaksjon eller reseptor signalisering.
I sammendraget, vår resultatene tyder på at den transformerende kapasitet på 22Rv1 celler er sterkt avhengig av tilstedeværelsen av XMRV. Derfor resultater oppnådd i eksperimenter med 22Rv1 celler med hensyn til prostatakreft tumorigenesis må validert i andre virus negative prostata kreft cellelinjer.
Resultater
prostata epitel cellelinje 22Rv1, avledet fra et humant prostatakarsinom xenopodet i immunodefekte mus, inneholder flere kopier av gammaretrovirus XMRV integrert i vertscelle-DNA. XMRV replikerer aktivt i denne cellelinje som resulterer i virus som inneholdt infeksiøs supernatant [6], [7]. 22Rv1 celler er blitt anvendt i xenograft museforsøk i det siste uten å vite at en smittsom virus shedded av denne cellelinje. Til tross for at XMRV mest sannsynlig ikke er et virus som sirkulerer i befolkningen vi analysert bidraget av dette viruset til cellelinje egenskaper. Celle migrasjon og cytokine release samt tumorprogresjon i immunsvikt mus
xenopodet 22Rv1 svulster i SCID mus med redusert viral transkripsjoner er Highly Necrotic og Show mindre Vessel Formation
Vi etablerte en 22Rv1 cellelinje med reduserte XMRV transkripsjon mengder som resulterer i mindre smittsomme viruspartikler i kultursupernatanten. To forskjellige shRNAs rettet mot to ulike regioner i XMRV LTR regionen (figur 1A) ble kombinert. Stabile hårnåler inneholder sekvensene shLTR1 og shLTR2 (tabell S1) ble individuelt klonet inn i lentiviral vektor Lego G-puro [27]. Pseudotyped viruspartikler inneholdende supernatant fra begge shRNAs innehold lentivirale RNA ble brukt for infeksjon av 22Rv1 celler, som deretter ble behandlet med puromycin for å velge shRNA uttrykkende celler. For å utelukke bestemt utvalg av individuelle integrering hendelser, ble bulk utvalg i stedet for enkelt klon utvalg utført samt kontroll supernatant inneholder pseudotyped viruspartikler med foreldre lentiviral plasmid Lego G-puro uten shRNA innsats ble generert. Som vist i figur 1B Gag P30 /CA (kapsid-protein) ekspresjonsnivåer ble signifikant redusert, så vel som mengden av infeksiøse partikler utskilles i supernatanten var betydelig redusert i shLTR1 + 2 uttrykkende 22Rv1 celler (figur 1C). Ved hjelp av disse cellene i xenograft in vivo eksperimenter, ble totalt seks SCID mus per shRNA gruppe subkutant injisert med 2 × 10
6 celler i matrigel i hver lateral flanke. Begynnende svulstdannelse og vekt ble overvåket for 36d. Vi observerte ikke signifikante forskjeller i utbruddet av tumorvekst mellom 22Rv1 kontrollceller og 22Rv1 celler som uttrykker shLTR1 + 2 som bedømmes av daglig visuell inspeksjon og vektkontroll av musene (data ikke vist). Etter 36d, ble musene avlivet og tumorvekt, nekrose samt fartøy dannelse ble analysert. Vekten av 22Rv1 shLTR1 + 2 tumorer var signifikant redusert (figur 2A venstre panel) sammenlignet med kontrolltumorer. Disse tumorene viste store nekrotiske områder (som vist i figur 2B venstre panel, fig S2A (kontrollceller) og S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)) og viste signifikant færre fartøyet tall ved utføring av immunhistokjemisk farging påføring av et CD34 monoklonalt antistoff til tumor vevsnitt ( Figur 3A øvre paneler og figur 3B) sammenlignet med kontrollene.
(A) Skjematisk representasjon av XMRV LTR region og 5 «UTR av Gag. Lokalisering av shRNAs brukes til å redusere XMRV transkripsjoner i 22Rv1 celler vises som piler. Tre forskjellige sekvenser, shLTR1 (R region), shLTR2 (U5 region) og shLTR3 (ligger like nedstrøms spleisedonoren nettstedet (SD)) ble valgt ved hjelp av Ambion sin siRNA Target Finder nettbasert verktøy. (B) 22Rv1 celler transduced med lentiviral supernatant som inneholder det angitte shRNAs og puromycin valgt: 22Rv1 shLTR1 + 2 celler viser betydelig redusert p30 protein (CA) i Western Blot analyse sammenlignet med kontrollceller. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Real-time PCR bestemme den relative mengde av infeksiøse partikler i supernatanten av shRNA transdusert 22Rv1 celler.
SCID-mus (n = 6) ble s.c. injisert med 22Rv1 shLTR1 + 2, shLTR3 eller med 22Rv1 kontrollceller. For hver cellelinje var det endelige tumormengde n = 12. 36d p.i. ble musene avlivet og tumorene ble analysert for vekt (A) og nekrose (B).
(A) Immunhistokjemi farging for CD34 avslørte rudimentær blodkardannelse i XMRV knock down tumorer, mens tumorer 22Rv1 styre displayet dukket strukturer av angiogenese. (B) CD34
+ områder i svulster ble kvantifisert i kontroll og shLTR3 tumorer (n = 10 hver). Prosenter av CD34
+ områdene er uttrykt i forhold til de totale områdene analysert.
For å utelukke at de observerte forskjellene er en konsekvens av såkalte off target effekter av shRNAs rettet mot XMRV vitnemål eller klonal seleksjon av en individuell integrering hendelse, en tredje shRNA med komplementære sekvenser til 5’GAG regionen (229-250, NC_007815) ble (figur 1A) klonet inn Lego G-puro plasmid. I likhet med 22Rv1 celler transfektert med shLTR1 + 2, 22Rv1 celler som uttrykker shLTR3, viste signifikant redusert p30 CA /gag-proteinet uttrykket nivåer (figur 1B, spor 3 og 4) og opp til 80% mindre infeksiøse viruspartikler i kultur supernatanten (figur 1C) sammenlignet med kontroll-celler. Injeksjon av disse cellene inn i hver flanke av seks SCID-mus reduserte ikke tidspunkt av tumorveksten, så vel som det var ingen signifikant endring i vekten av tumoren som ble observert for shLTR1 + 2 (figur 2A, høyre panel). Men observerte vi store nekrotiske områder i 22Rv1 shLTR3 tumorer (figur 2B, panel høyre). Mens svulster 22Rv1 shLTR1 + 2 viste små forskjeller i størrelsen på nekrotiske områder, disse forskjellene var statistisk signifikante i tumorer indusert med 22Rv1 shLTR3 celler. Tilsvarende CD34 flekker demonstrert redusert fartøy dannelse basert på CD34 positive IHC flekker i tumorer indusert av 22Rv1 shLTR3 celler i forhold til å kontrollere svulster (figur 3).
Disse forsøkene tyder på at egenskapene til 22Rv1 transplantater i immunsvikt mus delvis avhenge på produksjon av gammaretrovirus XMRV i disse cellene.
22Rv1 celler som uttrykker shLTR1 + 2 Varierer i cytokin Expression Pattern Sammenlignet Foreldre Cells
Kultursupernatantene fra 22Rv1 kontrollceller, infisert med pseudotyped lentiviral supernatant som inneholder den tomme Lego G puro plasmid og fra 22Rv1 shLTR1 + 2 celler ble samlet og analysert for cytokiner ved hjelp av en fastfase immunoblottingsprosedyren (RayBio Menneskelig cytokin antistoff Array 5; RayBiotech) (Figur S3). Supernatantene ble påført på membraner inneholdende antistoffer mot 80 humane cytokiner. Mindre forskjeller i frigivelse av cytokiner fra disse cellene ble påvist (figur S3). I 22Rv1 celler med redusert XMRV transkripsjonsnivåer, osteopontin (OPN), vev hemmer av matrixmetalloproteinase TIMP2 og IL13 ble noe redusert mens hepatocytter vekstfaktor (HGF) ble økt.
Ved hjelp av kvantitativ real-time PCR for den angitte mRNA transkripsjoner vi bekreftet disse funnene: OPN, TIMP2 og IL13 uttrykk er betydelig redusert i 22Rv1 celler som uttrykker shLTR1 + 2 mens HGF uttrykk er betydelig økt (figur 4). I tillegg testet vi uttrykk for matriksmetalloproteinase MMP9 og CXCL14 uttrykk i 22Rv1 celler og 22Rv1 shLTR1 + 2 celler. Selv om vi ikke finne noen forskjeller i MMP9 mRNA uttrykk i disse cellelinjene (data ikke vist), ble CXCL14 uttrykk betydelig redusert de 22Rv1 shLTR1 + 2 celler.
Total RNA av 22Rv1 kontroll og 22Rv1 shLTR1 + 2 ble analysert med hensyn på mRNA ekspresjonsnivåer av de angitte cytokiner ved QRT-PCR. Data ble normalisert mot tre housekeeping gener (GAPDH, TBP, RLP13).
De Novo smitte av prostata stromal fibroblast med Replication Kompetent XMRV Utførte Forskjeller i cytokin Expression
For å analysere om observerte forskjellene i cytokin uttrykk og utgivelsen er celletype avhengig, analyserte vi cytokin uttrykk og slipp i prostata stromal fibroblaster (PRSC) infisert med replikering kompetente XMRV stammer fra LNCaP celler transfektert med XMRV VP62 førvirus DNA. PRSC ble isolert fra prostatavevet ved collagenase fordøye og dyrking i selektive medier som beskrevet nylig [28], [29]. Outgrowing celler ble ekspandert og bekreftet ved FACS farging for ekspresjon av α-SMA (glattmuskel aktin) og vimentin (markører for aktivert stromal fibroblast) og mangel på cytokeratin uttrykk [28]. Kun lave passasje antall av disse celler ble anvendt i XMRV smitteforsøk. 2d tidligere infeksjon supernatanten av XMRV infisert PRSC eller mock-infiserte celler ble påført på et kommersielt antistoff membran arrays (RayBio; se figur S4). XMRV infeksjon av cellene ble bekreftet ved XMRV gag spesifikk PCR (data ikke vist). Av de 60 cytokiner analysert ved antistoff membran arrays åtte (GRO, GROα, TIMP1, TIMP2, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) ble uttrykt forskjellig av XMRV infiserte forhold til mock-infiserte celler. Mens GRO og GROα transkripsjoner ble opp regulert i supernatant fra PRSC XMRV infiserte celler, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, ble TIMP1 og TIMP2 uttrykk redusert.
For å bekrefte resultatene oppnådd av cytokin antistoff arrays og for å utelukke forskjeller i celle forberedelse av primære prostata stromal fibroblaster, utførte vi kvantitative real-time PCR eksperimenter ved hjelp av to forskjellige PRSC stromal fibroblast linjer hentet fra forskjellige pasienter (figur 5). Celler ble infisert med kultursupernatant inneholdende replikasjonskompetente XMRV avledet fra LNCaP-celler transfektert med XMRV VP62 proviralt DNA [30], [31]; Totalt RNA ble ekstrahert, DNaseI behandlet og deretter analysert ved QRT-PCR for forskjeller i cytokin ekspresjon. Mens vi var i stand til å bekrefte våre resultater oppnådd ved Ab array for GROα, IL13 og TIMP1, var vi ikke i stand til å bekrefte våre foreløpige data for TIMP2, HGF og IGFBP4. TIMP2 og IGFBP4 uttrykk økt respons på XMRV infeksjon og induksjon av HGF uttrykk ble kun observert i PrSc29 celler, mens PrSc5 celler viste motsatt effekt.
Primær prostata stromal fibroblaster (PRSC) ble infisert med XMRV supernatant av LNCaPi celler eller med mock supernatant. Totalt RNA ble analysert med hensyn på mRNA ekspresjonsnivåer av forskjellige cytokiner ved QRT-PCR. Data ble normalisert mot tre ulike husholdningsgener og illustrert som relativ genekspresjon i forhold til spotte infiserte celler ved hvert enkelt tidspunkt.
cytokine release Avhengig XMRV Replication Påvirker Invasivitet og Tube Formation in vitro
for å få en mekanistisk forståelse av de observerte forskjellene i cytokine release av prostata epitelceller eller stromale celler infisert med XMRV, flere in vitro-studier ble utført. Vi har ikke observere forskjeller i celleproliferasjon mellom infisert (22Rv1 kontroll shRNA og 22Rv1 shLTR1 + 2 eller PRSC infisert og ikke-infiserte PRSC celler søker en MTT-analyse (figur S1). Deretter undersøkte vi om XMRV infiserte celler kan fremme migrasjon av LNCaP celler i en parakrint måte. Primær prostata stromal fibroblaster enten håne eller XMRV infiserte ble sådd i bunnen rommet på en 24-transwell kammer parabolen. Gjennom en ettergivende membran utgitt cytokiner direkte påvirke invasivitet av LNCaP celler. Ved hjelp av denne analysen vi utførte et kurs på en XMRV infeksjon, er vist i figur 6A. XMRV infeksjon av stromal fibroblast resulterer i en statistisk signifikant økning av migrerende LNCaP-celler, som dessuten har økt i celler infisert i lengre tidsrom (28d). Denne økningen er spesifikk for XMRV siden en beslektet MLV (MoMCF, en amfotrofisk MLV hjelp PIT2 som reseptor) ikke resulterte i høyere mengder av trekkende LNCaP celler (Figur 6b). Interessant, replikering inkompetent virus som partikler pseudotyped med XMRV env ikke resultere i en økning av LNCaP celle migrasjon (figur 6B ) tyder på at hendelser uavhengig av reseptor binding og signal bidra til de observerte fenotype.
(A) Primære stromale fibroblaster (PRSC) 8d eller 28d pi med XMRV ble sådd i bunnen kupé av en invasjon kammer. Invasivitet av LNCaP-celler ble beregnet i tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater. (B) PRSC celler infisert med xenotropisk MLV (XMRV) indusere invasjon av prostata kreft celler in vitro mens stromale celler infisert med amfotrofisk MoMCF eller XMRV env pseudotyped virus lignende partikler ikke øker invasjon av LNCaP celler. (C) og (D) XMRV infeksjon induserer dannelsen av rør HMEC celler. Celler seeded på matrigel ble inkubert med supernatanten fra enten XMRV eller mock-infiserte stromale fibroblaster og rør dannelsen ble fulgt i 5 timer. Representativt bilde av røret dannelse observeres, er vist i (C). (D) Kvantifisering av to uavhengige eksperimenter utført in triplo. Bilder av tre ulike visuelle felt per brønn ble analysert for rørlengde (20 rør per felt) ved hjelp av Adobe Photoshop hersker verktøy
I tillegg har vi utført in vitro angiogenese analyser. Tube formasjonen ble analysert ved hjelp av supernatanter enten fra XMRV eller mock-infiserte celler som et sentralstimulerende som de inneholdt forskjellig uttrykt /eller ulike nivåer av pro-angiogene cytokiner. Kultur supernatant fra prostata stromal fibroblaster ble lagt inn i HMEC celler på matrigel og rør formasjonen ble fulgt i 5 timer. Endringer i cytokine release i respons til XMRV infeksjon økt betydelig lengden av kapillær nettverk dannet av HMEC celler (figur 6C og D), som er i tråd med våre in vivo funn.
Diskusjoner
Vårt studium viser at xenotropisk gammaretroviruses, som har blitt hyppig identifisert i kreftcellelinjer, etablert ved å føre dem skjønt nakne mus, ikke bare bære risikoen for infeksjon, men også i betydelig grad kunne påvirke de eksperimentelle data som er mottatt med disse cellelinjene. Spesielt prostatacancercellelinje 22Rv1 som vanligvis brukes i prostata cancer in vitro studier, så vel som in vivo-xenograft-modeller bærer flere kopier av XMRV integrert og aktivt kaster infeksiøst virus i sin supernatanten.
XMRV ble opprinnelig identifisert i human prostata kreftvev og dens assosiasjon med humane sykdommer er blitt foreslått i de siste årene. Nyere data tyder på en rekombinasjon av to stamfar mus XMRV sekvenser, kalt Pre-XMRV1 og Pre-XMRV2, i cellekultur og dermed generere XMRV [7] sammen med flere studier ikke påvise XMRV sekvenser i humane prøver [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] spørsmåls en sammenslutning av XMRV med menneskelige sykdommer.
Likevel er analysen av XMRV transformasjonspotensialet betydelig interesse siden 22Rv1 celler og CWR22-R1 cellene produserer smittsomme virus og er en generelt akseptert in vitro modell samt xenograft modell for å studere prostatakreft tumorigenesis, progresjon, biomarkører og utvikling av terapeutiske strategier.
i denne studien vi generert en 22Rv1 cellelinje med redusert XMRV utskrifter og virale proteinnivåer ved bruk av shRNAs rettet mot to ulike regioner i XMRV LTR regionen. in vivo forsøk viste at svulster indusert av 22Rv1 celler med redusert XMRV transkriptene var svært nekrotisk og viste betydelig mindre vaskularisering som bedømt ved CD34-farging (figur 3) og CEACAM-1 farving (data ikke vist). For å utelukke integrasjon nettstedet utvalg samt shRNA utenfor mål påvirker disse eksperimentene ble gjentatt ved bruk av uavhengige 22Rv1 Lego-shXMRV LTR smitteforsøk, samt å bruke ulike shRNA sekvenser rettet mot en tredje region i XMRV (shLTR3). I motsetning til de eksperimenter ved hjelp 22Rv1 shLTR1 + 2 celler, ble det ikke observert noen signifikante forskjeller i tumorstørrelse som kan være på grunn av lite antall dyr per gruppe. Alternativt forskjellene observert i tumorstørrelse i det første settet med xenograft eksperimenter med shRNA sekvenser rettet mot LTR regionene 59-79 og 103-125 kan være en konsekvens av såkalte off-target effekter i cellene. Det påpekes at i stedet for shRNA mot luciferase, eller andre sekvenser som vanligvis ikke finnes i det humane genomet, ble en tom lentiviral vektor som brukes til å generere styre lentiviral supernatanten ble deretter anvendt til å transdusere 22Rv1 celler. Dermed kan vi ikke utelukke en metning av komponenter av siRNA maskiner resulterer i uspesifikke effekter. Vi har imidlertid ikke observere noen fenotype, økte nivåer av apoptose, redusert levedyktighet av celler, som har blitt beskrevet å være korrelert med uspesifikke effekter forårsaket av mette siRNA vei [38]. Off-target effekter ble utelukket ved å gjenta dyreforsøk med en tredje, annen region i XMRV genomet som en shRNA sekvens.
Ingen metastasedannelse i lunge, milt og lever, samt beinmetastaser ble påvist i kontrollmus samt shLTR mus (data ikke vist). Videre ble tumorene ikke varierer i differensiering status, stromal celle organisasjon heller ikke svulstene viser forskjellene i leukocytt-infiltrering, reflektert av den relative tilstedeværelse av CD18
+ leukocytter (data ikke vist). Interessant nok, begge sett av eksperimenter (xenograft shLTR1 + 2 samt shLTR3) viste redusert vaskularisering og øket områder av nekrose. Siden vi ikke skapte en XMRV-viruset med en endret målområde av anvendt shRNAs som vi kan bruke til å utfylle 22Rv1 celler transduced med shLTR3, er det mulig at den observerte in vivo og in vitro forskjeller på disse cellene er en konsekvens av å lese gjennom eller rekombinant XMRV og mobil transkripsjoner.
Nyere studier har antydet viktige funksjoner av cytokiner i ulike aspekter av tumorvekst. De fleste av cytokiner som er identifisert i våre analyser har blitt beskrevet for å påvirke mikrotumordannelse under prostata tumorigenesis. GRO /GROα (CXCL1), et medlem av CXC chemokin familien, fremmer angiogenese og rekrutterer nøytrofile granulocytter og endotelceller under ondartet progresjon i prostatakreft. Den avvikende ekspresjon av HGF (hepatocytt-vekstfaktor) og dens reseptor, c-Met, ofte korrelerer med avanserte stadier av prostatakreft. Tilsvarende IGFBP2 og 4 (insulin-lignende vekstfaktorbindende proteiner, 2 og 4) er biomarkører for prostatakreft stadier. Tissue inhibitorer av matrixmetalloproteinases (TIMP) har uavhengig av deres funksjon – å hemme proteinase aktiviteten av MMP (matrixmetalloproteinases) blitt beskrevet som faktorene som er involvert i tumorprogresjon: TIMP 1 og 2, som begge hemme tumorcelle-apoptose; TIMP en fremmer tumor angiogenese og TIMP 2 akselererer tumorprogresjon
XMRV-indusert cytokin frigjørings synes ikke å være svulst epitelcelledifferensiering spesifikke, men kan også observeres ved hjelp av prostata stromal fibroblaster (figur 5, S4).. Vi ønsker å påpeke at i disse forsøkene XMRV virus aksjer avledet fra LNCaP celler transfektert med førvirus XMRV VP62 DNA ble brukt. Vi gjorde ikke sekvensere viruset befolkningen stammer fra de novo infiserte LNCaP celler for å utelukke akutt trans XMRV varianter avledet av rekombinasjon som nylig publisert [39].
XMRV infeksjon av stromal fibroblast resulterte i statistisk signifikant økning av trekkende LNCaP-celler som videre ble økt i celler infisert i lengre tidsrom (28d). Denne økningen kan være spesifikke for XMRV og avhengig av XMRV replikasjon: en beslektet MLV (MoMCF, en amfotropisk MLV ved hjelp PIT2 som reseptor) resulterte ikke i høyere mengder av LNCaP-celler som migrerer (figur 6B). Interessant, supernatanten fra celle infisert med replikasjonsdefektivt XMRV-env pseudotyped partikler resulterte ikke i endring av cellemigrasjon antyder at reseptorbindende ikke bidrar til de observerte forandringer.
Generelt er våre observasjoner er i overensstemmelse med en viss aspekter av nylig publiserte data som viser at XMRV infeksjon av LNCaP-celler fremmer proliferasjon, transformasjon og invasivitet av disse cellene in vitro [40], så vel som det nylig vist at XMRV infeksjon kan indusere apoptose i noen humane cellelinjer [41]. Mens vi også observere en økning i invasivitet av celler ved inkubasjon med kultursupernatant av XMRV infiserte celler, kan vi ikke observere en økning på spredning på grunn av XMRV infeksjon, verken 22Rv1 celler transduced med shRNAs rettet mot XMRV transkripsjoner (Figur S1) eller LNCaP celler eller stromale celler infisert med XMRV (data ikke vist) viste en nedgang eller økning i proliferasjonsrate
Vi har ikke observere forskjeller i MMP9 mRNA nivåer som følge av XMRV infeksjon som nylig publisert [40].; selv ble observert en reduksjon av TIMP2 utgivelsen av PRSC celler infisert med XMRV. Siden MMP er i hovedsak regulert på protein nivåer vi ikke kan utelukke forskjell i MMP9 aktivitet. Cytokin antistoff arrays brukt her ikke inkluderer MMP9 eller MMP2 så vel som vi ikke inkluderte Zymografi teknikker for å teste for forskjeller i MMP9 eller MMP2 protein aktivitet. Det er underforstått at hastigheten og graden av angiogenese er en kritisk komponent for tumorprogresjon. Den nøyaktige mekanisme som XMRV kan påvirke angiogenese, fartøy dannelse og forskjeller i cytokine release er ikke forstått.
Retrovirus forurensning synes å være hyppigere blant mye brukt cellelinjer [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Den ukjente nærvær av retrovirus i cellelinjer ved siden av biohazard risiko kan påvirke utfallet av eksperimentene. Nyere studier viser tydelig at humane cellelinjer inkludert prostatakreft cellelinjer ofte bære gammaretroviral sekvenser [6], [20], [48]. For noen av dem smittsomme partikkeldannelse har blitt demonstrert: human T-cellelinje Jurkat J6, lymfoblastoid cellelinje A3.0 /F7 [47], B-celle-linje DG75 [45] og prostatakreft-cellelinjer LAPC4, VCap og EKVX [6], [48]; imidlertid, på bare noen få eksempler konsekvensen på eksperimentelle resultat er blitt demonstrert [44], [47], [49]. Vi konkluderer med at eksperimentelle resultater som ble oppnådd in vitro eller in vivo utført med retrovirus-positive cellelinjer (særlig 22Rv1 eller CWR-R1) kan reflektere molekylære egenskaper av viruset i stedet for celletypespesifikke egenskaper. Derfor bør retroviral status av cellelinjer som brukes i forsøkene gis samt studier (herunder xenograft in vivo forsøk) skal valideres ved hjelp av flere cellelinjer.
Materialer og metoder
Cellelinjer
humane prostatacancercellelinjer LNCaP (ATCC # CRL-1740) og 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco) supplementert med 10% FCS, 5% penicillin /streptomycin og L- glutamin. Lignende forhold ble brukt til shRNA behandlet 22Rv1 celler. TE671 (ATCC # CRL-8805) og 293T-celler (ATCC # CRL-11268) ble dyrket i DMEM Glutamax (Gibco) supplementert med 10% FCS, 5% penicillin /streptomycin. HMEC celler (Lonza) ble dyrket i endotelcelle vekstmedium MV2 (PromoCell). Stromale cellelinjer (PRSC) ble etablert som beskrevet [29], [50], [51].
