Abstract
Utviklingen av naturlig produkt agenter med målrettede strategier holder løftet for forbedret kreftbehandling med redusert narkotika -associated bivirkninger. Resveratrol finnes i rødvin, har anticancer aktivitet i ulike krefttyper. Vi rapporterte tidligere på en ny molekylære mål av resveratrol, metastasering-assosiert protein 1 (MTA1), som er en del av nucleosome ombygging og deacetylering (Nurd) co-repressor kompleks som medierer genet demping. Vi identifiserte resveratrol som en regulator av MTA1 /Nurd kompleks og re-aktivator av p53 acetylering i prostatakreft (PCA). I denne studien, adressert vi om resveratrol analoger også ha evnen til å hemme MTA1 og å reversere p53 deacetylering. Vi viste at pterostilbene (Pter), som finnes i blåbær, hadde større økning i MTA1-mediert p53 acetylering, bekrefter overlegen styrke over resveratrol som kosttilskudd epigenetisk agent. I orthotopic PCa xenografter, resveratrol og Pter betydelig hemmet tumorvekst, progresjon, lokal utbredelse og spontane metastasering. Videre MTA1-knockdown lysfølsomt celler til disse agentene som resulterer i ytterligere reduksjon av tumorprogresjon og metastasering. Reduksjonen var avhengig av MTA1 signale som viser økt p53-acetylering, høyere apoptotisk indeks og mindre angiogenese
in vivo
i alle xenotransplantater behandles med forbindelsene, og spesielt med Pter. Til sammen våre resultater indikerer MTA1 som en viktig bidragsyter i prostata svulst ondartet progresjon, og støtter bruk av strategier rettet mot MTA1. Våre sterke pre-kliniske data indikerer Pter som en potent, selektiv og farmakologisk trygg naturlig produkt som kan testes i avansert PCa
Citation. Li K, Dias SJ, Rimando AM, Dhar S, Mizuno CS, Penman AD, et al. (2013) pterostilbene virker gjennom metastaser-Associated Protein en til å hemme tumorvekst, Progresjon og metastaser i prostatakreft. PLoS ONE 8 (3): e57542. doi: 10,1371 /journal.pone.0057542
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 26 september 2012; Godkjent: 25 januar 2013; Publisert: 01.03.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Studien ble delvis støttet av egenutført forskning Support Program tilskudd (# 59927 og # 68100231012) fra University of Mississippi Medical Center til ASL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) behandling representerer fortsatt et udekket medisinsk behov. Diet-avledet polyfenoler, inkludert stilbenes, er attraktive kliniske kandidater for primær og sekundær kreft chemoprevention grunn av deres evne til å ikke bare blokkere eller hemme initiering av kreftutvikling, men også å reversere markedsførte etapper. Den sistnevnte egenskap gjør disse forbindelser lovende terapeutiske midler. Resveratrol (Res) og andre naturlige stilbenes er phytoalexins som er produsert av planter som svar på miljøstress [1]. Resveratrol har cardioprotective, anti-inflammatorisk og kreft aktiviteter [2], [3]. Anticancer handlinger resveratrol involverer regulering av flere og varierte molekylære mål og blir mediert ved induksjon av cellesyklus og apoptose [4] – [8] og inhibering av angiogenese [9] – [13].
nylig oppdaget at resveratrol nedregulerer metastase-assosiert protein 1 (MTA1) ved PCA [13]. MTA1 overekspresjon er korrelert med clinicopathological parametere som karakteriserer tumor aggressivitet: lymfeknutemetastaser, høye tumor karakterer, og angiogenese i ulike kreft [14] – [19]. I menneskelige prostata vev, ble et høyt MTA1 nivå forbundet med hormon-ildfast PCa [15]. Vi først identifisert MTA1 som en roman deltaker i «ond sirkel» av PCa bein metastasering, og videre viste at intensiteten av flekker og kjernefysiske lokalisering av MTA1 i menneskelige vev ble korrelert med aggressivitet PCa og beinmetastatiske lesjoner [19]. Vi etablerte også at MTA1 hadde pro-overlevelse, anti-apoptotisk, invasive og pro-angiogene egenskaper ved PCA
in vitro Hotell og
in vivo product: [19].
MTA1 er en del av den nucleosome ombygging og deacetylering (Nurd) ko-repressor-komplekset som er involvert i histon og ikke-histon-protein deacetyleringen og genspesifikke transkripsjonsregulering [20], [21]. Komplekset inneholder også histon deacetylases 1 og 2 (HDAC1 og 2). Vi viste tidligere at resveratrol-indusert MTA1 degradering destabiliserer MTA1 /HDAC /Nurd deacetylering kompleks som fører til økt acetylering /aktivering av tumor suppressor p53 i PCA celler [13]. MTA1 tie gjennom RNAi betydelig sensitivisert PCA celler til resveratrol avhengig p53 acetylering og apoptose. Dette HDAC-inhibitor-lignende aktivitet av resveratrol ble ytterligere understøttet av kombinasjonsforsøk med klinisk godkjent HDAC-inhibitor suberoylanilide hydroksamsyre (Saha), hvori resveratrol synergistisk øket p53-acetylering og apoptose [13]. Vi har også vist at MTA1 knockdown cellene hadde undertrykt invasjon og angiogen aktivitet
in vitro
, og forsinket tumordannelse og utvikling i subkutane xenografter [19]. Til sammen har vi definert en roman epigenetisk mekanisme av anticancer aktivitet av resveratrol mediert gjennom negative epigenetisk regulator, MTA1.
Til tross for sine lovende egenskaper, har resveratrol raske metabolisme og lav biotilgjengelighet utelukket sitt opprykk til klinisk bruk [2] , [22] – [24]. Begrensningene av resveratrol har bedt om vår interesse i naturlige og syntetiske analoger med forbedret farmakokinetikk og overlegen farmakologisk potens som holder større potensial som kreft naturlig produkt legemidler [25]. Men hvordan resveratrol analoger sammenligne med hverandre når det gjelder styrke og virkningsmekanismer er i stor grad ukjent.
in vivo
effektene er i hovedsak uutforsket for resveratrol analoger, som gjør det vanskelig å velge hvilke analog (e) er den beste for klinisk utvikling.
I denne studien har vi gjennomført en komparativ analyse av resveratrol og seks analoger i deres evne til å inhibere ekspresjon MTA1 og signalering, og fokusert på MTA1-mediert kreft og antimetastatic virkninger av de mest potente analoge, Pter, ved hjelp av ortotopiske PCA-xenografter. Våre resultater tyder MTA1 som en kraftig mål for intervensjon av kosttilskudd Pter som terapeutisk naturlig produkt stoffet for kreftbehandling i grunnskolen og metastatisk PCa.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle dyr arbeidet ble gjennomført i henhold til godkjent dyr protokollen # 1272 av Institutional Animal Care og bruk komité University of Mississippi Medical Center og akkreditert av Association for Assessment and Accreditation av Lab Animal Care International i samsvar med US Public Health service policy som sikret av Office of laboratoriet Animal Welfare.
Material
Resveratrol og piceatannol (PIC) ble oppnådd fra kommersielle kilder (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO og Calbiochem-Novabiochem Corp. , San Diego, henholdsvis CA,). Pterostilbene ble syntetisert ved å følge publiserte prosedyrer [26] trimetoksy-resveratrol (3M-Res) og (
E
) -4- (3,5-dimetoksystyryl) anilin (DMSA) ble syntetisert i henhold til tidligere beskrevne metoder [27 ]. Triacetyl-resveratrol (3AC-Res) og 3,5-diacetyl resveratrol (2AC-res) ble syntetisert som følger: 18 mg av resveratrol oppløst i 500 mL MeOH ble 10 dråper pyridin og 500 ul eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Etylacetat (EtOAc) ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og deretter fordelt med vann for å fjerne pyridin. EtOAc-sjiktet ble konsentrert under en strøm av nitrogen, og flekket på en tynnsjikt-kromatografi plate. Platen ble utviklet ved bruk av oppløsningsmiddelsystem 30% EtOAc: 70% heksan. Båndene av 3AC-Res (Rf 0,8) og 2AC-Res (Rf 0,6) ble skrapet fra platen og ekstrahert med EtOAc. Strukturene til 3AC-Res og 2AC-Res ble bestemt ved kjernemagnetisk resonans og massespektrometri. Strukturene til alle andre stilbener har også blitt bekreftet ved spektroskopi. Renheten av forbindelsene ble bestemt til å være 99%. Forbindelsene ble oppløst i høy renhet etanol eller DMSO og lagres i mørke ved -20 ° C før bruk i analyser.
Cell Culture
LnCap Du145 og PCA-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). PC3M celler var en gave fra Dr. R. Bergan (Northwestern University, Chicago, IL) [28], [29] og RWPE-en, «normale» udødeliggjort prostata epitelceller, var en gave fra Dr. C. Lee ( Northwestern University, Chicago, IL) [30]. PCA-celler ble dyrket i RPMI-1640 inneholdende 10% FBS, 5% penicillin /streptomycin, som tidligere beskrevet [13], [19]. RWPE-1-celler ble dyrket på ATCC komplett vekstmedium, som inneholder basis keratinocytt serumfritt medium supplert med bovint hypofyseekstrakt og human rekombinant epidermal vekstfaktor. Celler ble opprettholdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2. Mediet ble erstattet med fenol rød-fritt RPMI-1640 med 5% trekull-strippet serum 16-18 timer før resveratrol /analoger behandlinger for å tilveiebringe steroid-fri bakgrunn.
Western Blot analyse
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [13], [19]. I korthet ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av resveratrol eller analoger til 24 timer. Cellene ble vasket med kald PBS og lysert ved RIPA-lyseringsbuffer inneholdende og ekstraksjon Halt fosfatase og protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse-reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Like mengder protein (40-70 mikrogram) ble løst i 7-10% Tris-TGX Klar gels og overført til en PVDF membran ved Mini Trans-Blot Elektroforese Transfer System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranene ble deretter blokkert med TBS-Tween og 5% tørrmelk i 2 timer ved romtemperatur og probet med MTA1, AR, p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), eller Ac-p53 (K381) (Abcam) antistoffer. Blottene ble deretter analysert med p-aktin antistoffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som en lasting kontroll. Signaler ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence. Densitometry ble gjort ved hjelp av Image J. Effektiv dose (ED
50) ble beregnet ved Chou-Martin metode med CompuSyn for medikamentkombinasjoner og for general Dose-effekt-analyse programvare (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).
Generering av Stabile celler merket med Luciferase
MTA1-knockdown Du145 celler ble tidligere etablert ved hjelp av Expression Arrest GIPZ lentiviral shRNAmir vektorer som uttrykker MTA1shRNA eller ikke-tie tom vektor (EV, Open Biosystems) og var karakterisert
in vitro Hotell og
in vivo product: [13], [19]. Vektorer som inneholdt grønt fluorescerende protein (GFP) og en puromycin resistensgen. Selv om celler demonstrerte høy GFP signaler
in vitro
,
in vivo
forsøk var mislykket på grunn av høye bakgrunnssignaler fra animalsk vev. Som bioluminesens har høyt signal-til-støy-forhold til fluorescens, transduced vi celler med lentiviral luciferase (Luc) konstruere (en gave fra Dr. R. Graeser, Institutt for medisinsk onkologi, Freiburg, Tyskland) og utvalgte stabile kloner bruker puromycin. Klonale populasjoner av celler ble ekspandert
in vitro
og testet med hensyn til deres luciferase-aktivitet (se nedenfor). Flere lyse kloner ble gjentatte ganger valgt igjen og samles sammen for celler med høy luciferase uttrykk som skal brukes
in vivo.
In vitro Hotell og
in vivo
Bioluminescent Imaging
in vitro Hotell og
in vivo
bioluminesens (BL) ble utført ved hjelp av en IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Bilder og påvisning av BL signalene ble kjøpt og analysert ved hjelp av levende bilde programvare V. 4.1. For
in vitro
bildebehandling, celler som er merket med luciferase ble fortynnet i serie i en svart, klar bunn 96-brønns plate (Costar, Corning, New York). D-luciferin (150 ug /ml) ble tilsatt til brønnene, ble platen inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 10 minutter, hvoretter bilder ble tatt. For
in vivo
BL avbildning, bedøvede mus ble injisert intraperitonealt (i.p.) med 150 mg /kg D-luciferin (Sylinder) og plassert inne i kameraet boksen i 10 min. Kontinuerlig eksponering til 2% isofluran vedvarende sedasjon under bildebehandling. Oppkjøp tid var vanligvis maksimalt 3 min med autoeksponering avhengig av BL av svulster. Målinger av emittert lys ble utført for regioner av interesse (ROI) og kvantifisert som foton flux (fotoner /sek /cm2 /sr). Normalisering ble gjort for alle bilder ved slutten av forsøket. Gråtonebilder av mus ble også samlet inn på hver økt. Påvisning av metastase i løpet av eksperimentet var forurenset av sterk primærsignalet som resulterer i falske positive signaler. Derfor, ved slutten av forsøket, trukket vi det primære signal ved excising prostata og omgivende muskelvev å eksponere organene i bukhulen. Nyrer, lever og lunge /hjerte fra hver mus ble isolert og
ex vivo
avbildes ved å øke binning og F /stop.
ortotopiske PCA xenografter
Seven uker gammelt mannlige naken mus (Fox n1nu, Harlan) ble matet phytoestrogen fritt AIN-76A kosthold fra dag mottatt. Dyr ble randomisert til to store grupper før operasjonen og deretter injisert med enten Du145-EV-Luc (EV) eller Du145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) celler. Under operasjonen mus ble bedøvet med 2% isofluran ble et 7-9 mm abdominal midtlinjen snitt gjort, og prostata ble utsatt. 2,5 x 10
6 celler av hver cellelinje, i 20 mL PBS og Matrigel, ble injisert inn i fremre prostata. Såret ble sydd, og huden ble lukket med autoklips. Dyrene ble nøye overvåket etter kirurgi og klipp ble fjernet på dag 10. Svulster koloniserte og vokste i 14 dager. Mus som utviklet tumorer i hver gruppe ble randomisert i tre undergrupper (n = 6) med daglig i.p. administrering av 10% DMSO humbug kontroll (Ctrl); 50 mg /kg resveratrol eller Pter. Begge forbindelser var løselige i 10% DMSO da varmet opp ved hjelp av vannbad. Hver uke nye løsninger ble utarbeidet for injeksjoner. Kroppsvekt og BL signalene ble overvåket ukentlig. Musene ble avlivet ved uke 8 etter inokulering celle. Ved obduksjon ble prostata og andre organer skåret,
ex vivo
avbildes og fiksert med 10% nøytral-bufret formalin (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Serum ble også samlet opp og lagret ved -80 ° C
Histopatologi og Immunhistokjemi
Fire uM tykke snitt ble fremstilt fra formalin-fikserte paraffin innleiret tumorer og farget med hematoksylin og eosin (H . E ) ved hjelp av standardprotokollen. Immunhistokjemi (IHC) ble anvendt for å evaluere Ki-67, p53, Ac-p53 (K381), M30 og CD31 som tidligere beskrevet [19]. Kort fortalt delene ble deparaffinized, rehydrert med xylen og synkende grader av alkohol og vann. Antigen henting ble utført ved å koke lysbildene i Antigen avsløre Solution (Vector Labs, CA) i 30 minutter i en dampbåt. Objektglassene ble avkjølt og endogen peroksidase-aktivitet ble stoppet i 3% H
2o
2 i etanol i 5 min. Blokkering ble utført i samsvar med de aktuelle antistoffene ansatt for farging bruker Vectastain ABC Elite Kit (Vector laboratorier, CA). Seksjoner ble inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: anti-Ki67 (1:100) og anti-p53 (1:100, Santa Cruz Bioteknologi, California), anti-CD31 (1:100) og anti-Ac- p53 (1:100, Abcam, MA) og anti-M30 (1:100, Roche Diagnostics, GmbH, Tyskland). Snittene ble vasket og inkubert med passende sekundære antistoffer fra ABC-kit og farging ble avslørt ved hjelp av ImmPACT DAB-kit (Vector Labs, CA). Lysbilder ble kontra i hematoxylin, dehydrert og montert. Bilder ble sett og registrert på Nikon Eclipse E400 mikroskop. Den ImageTool programvare ble brukt til å telle positivt fargede celler i fem tilfeldig valgte felt.
Analyse av resveratrol og pterostilbene Innholdet i Murine Serum ved gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS)
Serum , som er lagret i -80 ° C fryser før bruk, ble sentrifugert ved 4 ° C i 15 minutter og behandlet med 80 ul av β-glucuronidase (1250 U /ml kaliumfosfatbuffer 75 mM, pH 6,8 ved 37 ° C). Blandingen ble inkubert ved 37 ° C med risting ved 750 rpm, i 17,5 timer, avkjølt til romtemperatur og deretter fordelt mellom 75 mL EtOAc. EtOAc-laget ble tørket under en strøm av nitrogen, derivatisert med 30 ul av 01:01 blanding av N, O-bis [trimetylsilyl] trifluoracetamid og dimetylformamid (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) og anvendt for analyse. GC-MS analyse ble utført ved hjelp av en JEOL GCMate II Instrument (JEOL, USA Inc., Peabody, MA) med en J W DB-5 kapillær kolonne (0,25 mm innvendig diameter, 0,25 mikrometer tykkelse, 30 mm lengde; Agilent Technologies , Foster City, California). GC temperaturprogram var: initial 190 ° C, holdt i 1 min, øket til 244 ° C med en hastighet på 30 ° C /min og holdt ved denne temperatur i 0,5 minutter, øket til 246 ° C med en hastighet på 0,5 ° C /min og holdt i 0,5 min, øket til 280 ° C med en hastighet på 20 ° C /min og holdt i 2 min, og til slutt økes til 300 ° C med en hastighet på 30 ° C /min og holdt i 0,8 min. Bæregassen var helium ultrahøy renhet, ved 1 mL /min strømningshastighet. Injeksjonsåpningen ble holdt ved 250 ° C, GC-MS-grensesnittet ved 230 ° C, og ioniseringskammeret ved 230 ° C. Volumet av injeksjonen ble 2 ul (splitless-injeksjon). Massespekteret ble kjøpt i utvalgte ion-overvåkingsmodus, elektronstøt 70 eV. Pterostilbene ble overvåket med m /z 328, 313 og 297 (retensjonstid 11,6 min). Resveratrol ble overvåket med m /z 444, 428 og 414 (retensjonstid 13,7 min). Kvantifisering ble gjort ved hjelp av eksterne standarder for en kommersiell prøve av resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og en syntetisk prøve av Pter [31].
Statistiske analyser
Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt ± SE eller boks plott av målinger. Studentens ensidige paret t-test ble brukt til å analysere
in vitro
data. Forskjeller i tumor BL intensitet
in vivo
ble analysert ved enten rang-basert eller to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post hoc analyse eller av Kruskal-Wallis test. For noen analysedataverdier ble log transformert. Forskjellene ble ansett signifikant ved p. 0,05
Resultater
pterostilbene er en potent hemmer av MTA1 Expression i PCA Cells
Vi har nylig oppdaget at resveratrol hemmer epigenetisk modifier MTA1 , som til slutt fører til økt p53 acetylering og apoptose av PCA-celler [13]. Her har vi testet seks resveratrol analoger (Fig. 1) for å avgjøre om de ville ha bedre anticancer aktivitet gjennom hemming av denne spesifikke molekylære mål. Av de analoger, er Pter, piceatannol (PIC) og trimetoksy-resveratrol (3M-Res) naturlig forekommende mens dimethoxystyrylaniline (DMSA), diacetylstilbene (2AC-Res) og triacetylstilbene (3AC-Res) er syntetiske derivater. Vi undersøkte effekten av disse analoger på MTA1 ekspresjon i tre PCA cellelinjer, som representerer forskjellige stadier av PCa progresjon. Cellene uttrykker MTA1 på ulike nivåer, fra moderat høy i androgen responsive LNCaP og androgen-motstandsdyktig Du145 til svært høye nivåer i metastatiske PC3M celler (Fig. 2A). Vi behandlet cellene med forskjellige doser (5-100 mm) av resveratrol /analoger til 24 timer og isolert protein for Western blot. Det var nedregulering av ekspresjon MTA1 i forbindelsesbehandlede sammenlignet med bærer-behandlede celler (Fig. 2). Resveratrol og analoger hemmet MTA1 protein nivåer på en doseavhengig måte, men med forskjellig potens. MTA1-inhibering ved hjelp av analoger var celle-spesifikk: mens den hemmende effekten av Pter var sammenlignbar med resveratrol i LNCaP-celler (Fig. 2B), i Du145 celler, 3AC-Res, PIC og Pter var mer potent enn resveratrol, men bare Pter hadde en ED
50 verdi i lavt mikromolområde (13,9 pM) (fig. 2C). I PC3M celler, 3M-Res og Pter demonstrert høyere potens enn resveratrol, og nok en gang, Pter hadde lavest ED
50 verdi (41,6 mikrometer, Fig. 2D). Derfor er blant de seks analoger som ble testet, Pter demonstrerte det mest potente MTA1-inhibering i alle tre cellelinjer. Pterostilbene ble opprinnelig isolert fra sandeltre og senere ble funnet i druer og blåbær [31], [32]. Som resveratrol, er Pter en potent antioksidant og anti-inflammatorisk middel med Kjemopreventivt og anticancer aktivitet [33] – [42]. I Du145 celler, Pter utstilt høyeste MTA1-hemmende potens (mer enn syv ganger høyere enn resveratrol). Viktigere, viste Pter større økning i MTA1-mediert p53 acetylering, spesielt i MTA1-knockdown sensibiliserte celler (Fig. 3), noe som tyder overlegen styrke over resveratrol som kosttilskudd epigenetisk middel som kontrollerer posttranslational modifikasjoner av proteiner.
resveratrol ( Res),
trans
-3,5,4′-trihydroxystilbene; Pterostilbene (Pter),
trans
-3,5-dimethoxystilbene; Trimetoksy-Resveratrol (3M-Res),
trans
-3,5,4′-trimethoxystilbene; Piceatannol (PIC),
trans
-3,5,3’4′-tetrahydroksystilben; Dimethoxystyrylaniline (DMSA),
trans
-4- (3,5-dimetoksystyryl) anilin; Diacetyl-Resveratrol (2AC-Res),
trans
-3,5-diacetylstilbene; Triacetyl-Resveratrol (3AC-Res),
trans
-3,5,4′-triacetylstilbene.
A. Cellelinjer representerer ulike stadier av PCa progresjon: RWPE-en, «normale» udødeliggjort prostata epitelceller; LNCaP, androgen-responsive celler; Du145, androgen-resistente celler; PC3M, aggressive metastatiske celler. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS og antibiotika. 75 ug protein ble separert på 10% gel, overført til membranen og probet med MTA1 antistoffer. β-actin var en lasting kontroll. Pterostilbene har den høyeste potens i å hemme MTA1. B. doseavhengige effekter av RES /analoger på MTA1 protein nivåer i LNCaP; i Du145 (C) og i PC3M (D) celler. (I) celler ble behandlet med 5-100 uM av Res /analoger i 24 timer og analysert ved immunblotting. (Ii) grafisk fremstilling av resultatene. Ctrl er satt til 1 og MTA1 nivåendringer er uttrykt som en prosentandel av Ctrl. Gjennomsnitt ± SE av fire uavhengige eksperimenter er vist. • p 0,05, # p 0,01, * p 0,001. (Iii) effektive doser (ED
50) ble beregnet ved Chou-Martin-metoden.
Du145-EV og Du145-MTA1shRNA celler (fig. S1) ble behandlet med 50 mikrometer av Res eller Pter for 24 timer og analysert for MTA1, p53, Ac-p53 ved Western blot som beskrevet i «Materialer og metoder». En representant blot er vist. Kvantifisering av Ac-p53 /p53-forholdet ble utført av Image J programvare og data vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter
Effekter av Resveratrol og pterostilbene på ortotopiske tumorvekst, progresjon og metastaser. Involvering av MTA1
Vi har tidligere vist at endogene nivåer av MTA1 fremme kreftutvikling i en subkutan modell av PCa [19]. Men rollen som MTA1 ved PCA vekst, progresjon og metastasering er fortsatt ukjent, og effektene av resveratrol og Pter har ikke blitt evaluert i ortotopiske PCA-modeller. Å sammenligne
in vivo
effekten av resveratrol og Pter, og å studere rollen til MTA1 i prostata tumorvekst og progresjon, vi utnyttet klinisk relevant orthotopic musemodell, hvor menneske PCA-celler som uttrykker eller forstummet for MTA1 kan vokse i et miljø som er relatert til deres vev opprinnelse. Målet med dette eksperimentet var tredelt: 1) for å evaluere effekten av resveratrol og Pter i hemme orthotopic PCa vekst og progresjon; 2) å vurdere rollen MTA1 i prostata svulst utvikling, progresjon og metastasering, og 3) å avgjøre om MTA1 påvirker i hvilken grad primærprostatatumor og metastaser til resveratrol og Pter.
For å undersøke MTA1 avhengige effekter, benyttet vi våre tidligere beskrevet og karakterisert Du145 celler transduced med lentivirus bære EV og MTA1shRNA [13], [19]. Vi merket disse cellene med luciferase og anvendt dem for ortotopisk inokulering (fig. 4). Før transplantasjon, validering av luciferase uttrykk og MTA1 knockdown i Du145-Luc celler ble utført ved hjelp av selvlysende analysen
in vitro Hotell og Western blot, henholdsvis (fig. S1). Ved kirurgi, ble musene injisert i prostatakjertelen med EV-Luc og MTA1shRNA-Luc celler. For å sikre spesifikk respons til MTA1-knockdown og behandling med forbindelser, fikk vi tumorer til å kolonisere og utvikle i 14 dager før randomisering. Tumorutvikling ble overvåket ved BL avbildning ukentlig. Mus som utviklet svulster (12/16 EV gruppe og 15/16 MTA1shRNA gruppe) ble randomisert ved størrelsen av bilder i tre undergrupper og behandlet med bærer-kontroll (10% DMSO), resveratrol eller Pter, ip, på samme 50 mg /kg /dag dose. Pterostilbene dose ble holdt identisk med resveratrol er å bestemme styrkeforskjeller. Mens bærer-behandlede mus viste hurtig tumorprogresjon i EV xenotransplantater, resveratrol og Pter forårsaket merkbar forsinkelse i tumorvekst (fig. 4A og B). Resveratrol, men mer så Pter viste tumor-inhiberende virkninger, selv om statistisk signifikans ikke ble nådd på grunn av lite antall mus. Xenografter uttrykker MTA1shRNA utstilt betydelig redusert tumorvekst i uke 5 etter transplantasjon med marginal betydning versus EV-Ctrl (p = 0,05). Videre MTA1-knockdown svulster behandlet med forbindelser hadde ytterligere respons, og forskjellene versus EV-Ctrl ble svært signifikant (p = 0,001 for resveratrol, p = 0,0004 for Pter). Derfor MTA1-knockdown lysfølsomt celler til resveratrol og spesielt til Pter. I samsvar med den potente antitumor effekter, resveratrol- og Pter behandlet svulster viste redusert mitotisk aktivitet sammenlignet med kjøretøy-behandlet EV-svulster som vist ved Ki-67 IHC (Fig. 5A). Viktigere, i samsvar med redusert MTA1 aktivitet i tumorer, nedstrøms acetyl-målet for MTA1, Ac-p53, hadde signifikant økt nivå ved behandlinger, beste sett med Pter (Fig. 5B). Følgelig M30 farging viste en stor økning i apoptose i tumorer fra EV forbindelsesbehandlede mus og MTA1-knockdown gruppe (fig. 5C). I tillegg microvessel område, som vurdert av CD31 farging, redusert med ~59% i EV-sammensatte behandlede tumorer og ved ~67% i MTA1-knockdown gruppen sammenlignet med EV-Ctrl (Fig. 5D).
Mann nakne mus ble injisert orthotopically med Du145-EV-Luc (EV) eller Du145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) celler og behandlet med kjøretøy (Ctrl), Res eller Pter, 50 mg /kg /dag, hver dag, ip A. Normalisert representant BL bilder av mus fra hver gruppe vises. B,
forlot
, Kvantitativ analyse av tumorlysemisjon i Total Flux (fotoner /sek /cm2 /sr) er plottet mot tiden. Gjennomsnitt ± SE er vist (n = 6 i starten), * p = 0,05.
Høyre
, logg trender for hver gruppe vises. Betydelig veksthemming ble oppdaget i EV- vs. MTA1shRNA-svulster som grupper, ** p 0,01 og mellom EV-Ctrl vs. MTA1shRNA-Res og MTA1shRNA-Pter, *** p. 0,001
Venstre,
representant IHC bilder av A. Ki-67 (spredning); B. Ac-p53 /p53 (MTA1 signalering); C. M30 (apoptose); og D. CD31 (angiogenese) i EV- og MTA1shRNA-svulster vises.
Høyre, etter kvantifisering av positivt fargede celler i prosent av totalt antall celler. Dataene er boksplott av tilfeldig valgte fem felt analysert uavhengig av to etterforskere. Parvise sammenligninger, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 vs. EV-Ctrl;
# p 0,05 og
## p 0,001 vs. MTA1shRNA-Ctrl; + P 0,05 og ++ p. 0,001, av forbindelser mellom EV og MTA1shRNA grupper
Noen preklinisk PCa xenograft modeller fremgang til metastasering, noe som gjør det vanskelig å studere den funksjonelle betydningen av MTA1 i metastasering. Vår tidligere studie med LNCaP-Luc-celler viste ingen metastase når orthotopically injisert i mus (upubliserte data). På grunn av den mer aggressive fenotype av Du145 celler, vi vurderte muligheten for spontane metastaser i ortotopiske Du145 xenografter. Ved begynnelsen av uke 7, har vi oppdaget at BL-signaler forskjellige fra den primære kilde (prostata) i sham EV-Ctrl gruppe (Fig. 4A og 6A).
Ex vivo
BL bilder av metastaser ble påvist ved obduksjon i lever, nyrer og lunger /hjerte, og histologi ble bekreftet av en sertifisert patolog (JRL) (Fig. 6B). Den høyeste forekomsten av metastase ble iakttatt i EV gruppen (100%), mens den MTA1shRNA gruppen viste bare 50-75% og med høy grad av heterogenitet (Fig. 6C). Omfattende macrometastases i alle organer observert i EV-Ctrl ble hemmet av resveratrol og Pter. MTA1-knockdown svulster utviklet mindre metastaser, og i færre organer. Spesielt MTA1shRNA svulster behandlet med forbindelser enten ikke utvikle noen nyre metastaser eller hadde små lesjoner i en nyre (Fig. 6D). Hemming av metastaser i respons til MTA1 målretting midler og MTA1 lyddemping indikerer MTA1 bidrag til lokal invasjon, formidling og metastasering. Sammen disse dataene tyder på at MTA1 signale spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av metastatisk prostatakreft og at målretting MTA1 sti av kosttilskudd polyfenoler kan være effektive i å bremse ned tumorprogresjon og hindre metastase.
A. BL bilder av metastase vises. Signaler oppdaget etter prostata fjerning besto av metastatiske og uspesifikke signaler. Fjerning av hud og muskler eliminert non-spesifisitet. B.
Top, ex vivo
bilder av metastaserende organer.
Bottom, etter Validering av metastatiske lesjoner (T) i nyrene (K), lever (Li) og lunge /hjerte (L /H) av H E farging. C, kvantitativ analyse av totale metastatisk Luc signaler i Total Flux (fotoner /sek /cm2 /sr). Åpne sirkler representerer uteliggere. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 er parvise sammenligninger vs EV-Ctrl. D, kvantitativ analyse av organspesifikk metastase beregnes ved luciferase signaler som Total Flux (fotoner /sek /cm
2 /sr). Fargekodede histogrammer av signaler for hver gruppe vises. Pter var mer effektive i å hemme metastase i alle organer i forhold til Res i EV-gruppe.
