Abstract
Målet med denne studien var å vurdere muligheten av EVO å redusere celleviabilitet og fremme cellesyklus og apoptose i småcellet lungekreft (SCLC) celler. Lungekreft har den høyeste forekomsten og dødeligheten blant alle kreftformer. Kjemoterapi er den primære behandling for SCLC; Men narkotika som er brukt for SCLC er mindre effektive enn de som brukes for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Derfor er det nødvendig å utvikle nye legemidler for behandling av SCLC. I denne studien ble effekten av evodiamine (EVO) på cellevekst, cellesyklus og apoptose undersøkt i den menneskelige SCLC cellelinjer NCI-H446 og NCI-H1688. Resultatene representerer den første rapporten som EVO kan hemme levedyktigheten til både H446 og H1688 celler i dose- og tidsavhengige oppførsel. EVO indusert cellesyklus-stans i G2 /M fase, indusert apoptose ved opp-regulerer ekspresjonen av caspase-12 og cytokrom C-protein, og induserte ekspresjon av Bax mRNA og ved ned-regulering av ekspresjonen av Bcl-2-mRNA i begge H446 og H1688 celler. Imidlertid var det ingen effekt på protein ekspresjon av caspase-8. Tatt sammen, kan de inhiberende virkninger av EVO på veksten av H446 og H1688 cellene være forårsaket av G2 /M rest og påfølgende apoptose, gjennom mitokondrier-avhengige og endoplasmatiske retikulum stressinduserte baner (iboende kaspase-avhengige reaksjonsveier), men ikke gjennom død reseptor-induserte veien (extrinsic caspase-avhengige veien). Våre funn tyder på at EVO er en lovende ny og potent antitumor narkotika kandidat for SCLC. Videre cellesyklus, mitokondriene og ER stress trasé er rasjonelle mål for den fremtidige utviklingen av en EVO levering system for å behandle SCLC
Citation. Fang C, Zhang J, Qi D, Vifte X, Luo J, L Liu, et al. (2014) evodiamine induserer G2 /M og apoptose via mitokondrie og endoplasmatiske retikulum Pathways i H446 og H1688 Menneskelig småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10,1371 /journal.pone.0115204
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 7 mai 2014; Godkjent: 19 november 2014; Publisert: 15.12.2014
Copyright: © 2014 Fang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskuddet CSTC2012JJB10027 fra Chongqing Science and Technology Committee, Chongqing, Folkerepublikken Kina. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste formen for kreft, sto for 12,5% av alle årlige nydiagnostiserte krefttilfeller på verdensbasis. I tillegg til en høy forekomst, har lungekreft den høyeste dødeligheten blant alle krefttyper [1]. Lungekreft kan klassifiseres i småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) basert på histopatologiske trekk ved sykdommen. Omtrent 10% til 15% av alle lungekreft er SCLC [2]. Klinisk er SCLC skilles fra NSCLC ved hurtig tumorvekst og utbredt metastasering. Ifølge retningslinjene til American Cancer Society [2], er kjemoterapi den viktigste behandlingen for SCLC, og cisplatin, etoposid, carboplatin og irinotecan er de mest brukte narkotika. Imidlertid har disse stoffene bare begrenset effekt og føre til alvorlige bivirkninger [3]. Faktisk er det fem-års overlevelse for SCLC ganske lav (3~8%) sammenlignet med de fem-års overlevelse for alle former for lungekreft ( 15%) [4]. Nye og effektive antitumormedikamentene med færre og mindre alvorlige bivirkninger er sterkt behov for å forbedre kliniske resultater.
evodiamine (EVO), en stor quinazolinecarboline alkaloid i
Evodia rutaecarpa
, har cytotoksiske effekter på forskjellige typer av humane kreftceller, for eksempel glioblastom-celler [5], magekreftceller [6], bryst-kreftceller [7], blærekreftceller [8] og lungekreftceller. Nærmere bestemt, EVO oppviste cytotoksiske effekter på forskjellige NSCLC-cellelinjer, blant annet A549 lunge adenokarsinomceller [9], H1299-celler [10], CL1 celler [11] og H460 stor-celle lunge karsinom-celler [12], [13]. I motsetning til de cytotoksiske effekter av EVO på ulike kreftceller [14], har EVO liten effekt på normale humane perifere blodceller eller på kroppsvekten av tumorbærende mus ved dens effektive dose [15].
på den annen side er det enkelte legemidler som har cytotoksiske virkninger på NSCLC har også åpenbare effekter på SCLC, slik som wentilactone A, som er cytotoksisk for både H460 og H446 [16], og glukosamin, som er cytotoksisk for A549 og H446-celler [17 ]. Derfor, selv om det har vært noen rapport om effekten av EVO på SCLC til dags dato, kan EVO være en potensiell ny medikamentkandidat for behandling av SCLC.
I denne studien ble virkningene av EVO for celle-levedyktighet, cellesyklus og apoptose i humane SCLC cellelinjer NCI-H446 og NCI-H1688 ble undersøkt, og de underliggende mekanismene ble ytterligere utforsket. Våre resultater viste at de inhiberende virkninger av EVO på veksten av H446 og H1688 cellene skyldtes G2 /M rest og påfølgende apoptose inn i mitokondriene avhengige og endoplasmatisk retikulum (ER) stressinduserte caspaseaktivering baner (iboende kaspase-avhengige reaksjonsveier ), men ikke gjennom døden reseptor-indusert caspaseaktivering veien (extrinsic caspase-avhengige veien). Så langt har ingen narkotika blitt rapportert å indusere apoptose i SCLC celler via ER stress sti. Våre resultater representerer den første rapporten som EVO induserer apoptose i H446 og H1688 SCLC cellelinjer via ER stress veien. I tillegg har det vært noen tidligere rapport av et stoff som samtidig induserer cellesyklus og apoptose i SCLC celler via mitokondrier-mediert og ER stress veier. Vi rapporterer for første gang at EVO indusert G2 /M arrest og apoptose via både mitokondrier-mediert og ER stress trasé i H446 og H1688 SCLC cellelinjer.
Materialer og metoder
2,1 forbindelse
evodiamine (EVO) ble kjøpt fra Yuancheng Technology Development Co, Ltd (Wuhan, Kina), renhet 99,13%. EVO ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) for å fremstille en 40 mM stamløsning, som ble fortynnet med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ) før hvert eksperiment. Den endelige DMSO konsentrasjonen var ikke mer enn 0,025% i denne studien.
2,2 Cell Culture
Den menneskelige NCI-H446 og NCI-H1688 SCLC cellelinjer ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina) og Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), henholdsvis. H446 og H1688-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco Co., Grand Island, NY, USA). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
2,3 cellenes levedyktighet Assays
H446 eller H1688-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners mikrotiterplater (Corning Incorporated, New York, USA). Cellene ble dyrket i 12 timer, og mediet ble erstattet med RPMI 1640 medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av EVO (1,25, 2,5, 5, 10 og 20 uM). Etter slutten av den angitte inkubasjonsperioden (24 timer, 48 timer og 72 timer), ble mediet byttet ut med ferskt medium som inneholdt 20 ul av 5 mg /ml metyl-tiazolyl-tetrazolium (MTT) oppløsning (Sigma). Etter inkubering i 4 timer ble MTT oppløsningen fjernet og erstattet med 150 ul DMSO, og mikroplatene ble ristet i 5 minutter. Absorbansen ble målt ved 490 nm med en Multiskan GO Microplate spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Cellen levedyktighet ble beregnet som følger: Cellenes levedyktighet (%) = OD
testgruppen /OD
kontrollgruppen x 100%, hvor OD
testgruppen var den optiske tetthet (OD) av EVO eller DMSO behandlingsgruppe og OD
kontrollgruppen var den optiske tettheten for den negative kontrollgruppe. Ubehandlet H446 eller H1688 celler ble brukt som en negativ kontrollgruppe. IC
50 verdi refererer til den konsentrasjon av medikament nødvendig for å drepe 50% av cellene [18]. Cellen viabilities av forskjellige EVO konsentrasjoner ble analysert ved OriginPro 7-programvaren (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA), og deretter IC
50 verdier ble innhentet. Den morfologi av H446 celler inkubert med EVO i 24 timer ble visualisert under en invertert fluorescens mikroskop (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan).
2,4 Cellesyklus og apoptose Analyser
H446 eller H1688 celler ble dyrket i 25 cm
2 kolber og behandlet med 10 mm EVO i 24 timer. Cellene ble høstet ved trypsinzation og sentrifugering, og deretter fiksert med 70% etanol ved 4 ° C i 12 timer. Etter skylling to ganger med fosfat-bufret oppløsning (PBS) ble cellene resuspendert i en DNA-fargeløsning som inneholdt 40 ug /ml propidiumjodid (PI) og 0,1 mg /ml RNase ved 25 ° C i mørke i 30 min. Cellene ble analysert med en FACSVantage flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) utstyrt med den Cellquest-programvare [18]. Deretter ble cellesyklusfordelingen bestemmes og analyseres.
apoptotisk celle kvantifisering ble bestemt ved anvendelse av en Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjonssett (Beyotime Institutt for bioteknologi, Shanghai, Kina). Induksjonen av apoptose ble påvist i H446 eller H1688 celler etter 24 timers behandling med 10 uM EVO ifølge Annexin V-FITC /PI fargemetoden. De H446 celler ble observert under et Nikon Eclipse Ti invertert fluorescens mikroskop.
2,5 reaktive oksygen arter (ROS), Intracellulær fritt kalsium (Ca
2 +), og mitokondriemembranen potensial (ψ
m )
ROS, Ca
2 + og ψ
m nivåer ble bestemt med en FACSVantage flowcytometer hjelp av disse tre fluorokromer: 2 «, 7»-dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) (Beyotime institutt for bioteknologi, Haimen, Jiangshu, Kina), Fluo-3 /AM (Beyotime institutt for bioteknologi, Shanghai, Kina), og JC-1 (Beyotime institutt for bioteknologi, Jiangshu, Kina), henholdsvis [19]. I korthet, H446 eller H1688-celler sådd med en tetthet på 1 x 10
6 celler /brønn på 6-brønners plater (Corning Incorporation, NY, USA) ble behandlet med 10 uM EVO i 24 timer. Cellene ble oppsamlet, sentrifugert og resuspendert i en fargeløsning som inneholdt 10 pM DCF-DA (5 uM Fluo-3 /AM eller 5 pg /mL JC-1) ved 37 ° C i 30 min (45 min eller 20 min) og deretter analysert ved hjelp av en FACSVantage strømningscytometer.
2,6 caspase-3, -8 og -9 aktivitetsanalyse
caspase-3, -8 og -9 aktivitetsnivå ble målt ved hjelp av aktivitetsanalyse kits (Beyotime institutt for bioteknologi, Haimen, Jiangsu, Kina). Kort sagt ble H446 eller H1688 cellene høstet etter å ha blitt behandlet med 10 uM EVO i 24 h (48 h eller 72 h). Deretter ble cellene vasket med kald PBS, resuspendert i lyseringsbuffer (100 ul per 2 x 10
6-celler), stå på is i 15 min og deretter sentrifugert ved 18000 x
g
4 ° C i 10 min. Analysene ble utført i 96-brønners mikrotiterplater ved inkubering av en blanding bestående av 10 ul av cellelysatet, 80 ul reaksjonsbuffer og 10 ul av caspase-3 (-8 eller -9) substrat (Ac-DEVD-pNA) ved 37 ° C i 4 timer. Caspase-3 (-8 eller -9) aktivitet i prøvene ble kvantifisert ved anvendelse av et Multiskan GO Microplate spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ved en absorbans på 405 nm.
2.7 Western blot-analyse
Cytochrome C (Cyt C), caspase-12, -8, -9 og -3, faktor assosiert selvmord (Fas) og tumor nekrose faktor-relatert apoptose induserende ligand (Trail) ble målt ved proteinnivået ved Western blotting. H446 celler behandlet med 10 mm EVO i 48 timer ble samlet og inkubert i radio immunoprecipitation assay (RIPA) lysebuffer (Beyotime Institutt for bioteknologi, Haimen, Jiangshu, Kina) i 60 min på is. Cellelysatene ble sentrifugert ved 13 000 g i 15 min, og proteinkonsentrasjonene i lysatene ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse Dye (Bradford) Reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Like mengder proteiner ble løst ved sulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og blottet på Immobilon-P overføringsmembraner (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).
Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i TBST-buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20). Cyt C, caspase-12, -8, -9 og -3, ble Fas og Trail påvises ved hjelp av primære antistoffer (kanin anti-Cyt C, caspase-12, -8, -9 og -3, Fas og Trail) og sekundære antistoff (geit-anti-kanin IgG (H + L), pepperrot peroksidase-konjugert). Alle antistoffer ble kjøpt fra Beijing Biosyntese Bioteknologi Co, LTD., Beijing, Kina og de ble fortynnet 1:200 med 5% skummet melk TBST (Sigma) før bruk. Sluttkonsentrasjonen av antistoffene var 20 ug /ml. På samme måte ble Cyt C og caspase-12 og -8 målt i H1688 celler behandlet med EVO i 48 timer ved Western blotting.
2,8 Reverse Transcription Polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
Total cellulært RNA fra nylig isolerte H446-celler ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA ble syntetisert ved anvendelse av revers transkriptase (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, USA). Den spesifikke genproduktet ble amplifisert ved PCR med Taq DNA-polymerase (Fermentas, Waltham, MA, USA). De primersett for PCR var som følger:
Bax følelse strand: 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 «;
Bax anti strand: 5′-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3′.
BCL-2 forstand strand: 5′-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 «;
BCL-2 antisens strand: 5′-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′;
2.9 Statistisk analyse
hvert forsøk i denne studien ble gjentatt 3 ganger. Alle data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) hvis ikke annet er angitt. Analysene ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (versjon 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Students t test ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellene mellom de eksperimentelle gruppene. Statistisk signifikans ble etablert på
P
. 0,05
Resultater
3.1 hemmende effekter av evodiamine på cellevekst
De hemmende effekter av EVO på menneskelige SCLC H446 og H1688 cellesvulster ble evaluert ved hjelp av MTT cytotoksisitetsassayer. Som vist på fig. 1A, EVO inhiberte human SCLC H446 vekst i en dose- og tidsavhengig måte. Levedyktighet frekvensen av H446 celler behandlet med 10 mm EVO i 24 timer (~66%) redusert med ~16% sammenlignet med for celler behandlet med 1,25 mikrometer EVO (~82%). Levedyktighet frekvensen av H446 celler behandlet med 10 mm EVO i 72 timer (~35%) redusert med ~22% sammenlignet med for celler behandlet med 1,25 mikrometer EVO (~57%). IC
50 Verdiene for EVO-behandlede H446-celler i 24 timer, 48 timer og 72 timer var ved 20 uM, 18,07 uM og 1,80 uM, henholdsvis
Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. . Cellene ble fotografert ved hjelp av mikroskop. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). *
P
0,05 viste signifikant forskjell mellom to grupper. Ubehandlet H446 eller H1688 celler ble brukt som en negativ kontrollgruppe. 0 mikrometer EVO gruppen inneholdt 0,025% DMSO. 0,025% DMSO ble anvendt for å fremstille 20 uM EVO (den maksimale konsentrasjonen av EVO oppløsning i studien). *
P
0,05 sammenlignet med den tilsvarende EVO behandlede gruppe på 24 timer.
#
P
. . 0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlet gruppe på 48 h
EVO hemmet human SCLC H1688 cellevekst i en litt annen måte (fig 1B ): (1) EVO hemmet humane SCLC H1688 cellevekst på en doseavhengig måte i løpet av 72 timer. Levedyktighet priser av H1688 celler behandlet med 10 mm EVO (~49% på 24 timer, ~33% på 48 timer og ~ 30% ved 72 h, henholdsvis) redusert med ~19%, 19% og 21% sammenlignet behandlet med 1,25 uM EVO (~68% i 24 timer, ~52% i 48 timer og ~51% i 72 timer, henholdsvis). (2) EVO hemmet H1688 vekst i en tidsavhengig måte i konsentrasjoner fra 1.25 uM til 10 uM i løpet av 48 timer og ved en konsentrasjon på 20 uM i 72 timer. (3) De inhiberingsgradene etter behandling i 48 timer var nesten de samme som de etter 72 timers behandling med EVO i konsentrasjoner fra 1.25 uM til 10 uM. (4) Den IC
50 verdier av EVO i H1688 cellene ble redusert fra 8,14 pM (ved 24 timer) til 2,08 uM (ved 48 timer) eller 1,37 um (ved 72 timer).
Etter behandling med 10 uM EVO, levedyktigheten ratene H446 eller H1688 cellene ble ~66% eller ~49% (24 timer), ~56% eller ~33% (48 h), og 35% eller ~ 30% (72 timer), respektivt . På grunn av den åpenbare hemmende effekten av 10 pM EVO på H446 eller H1688 celler, den mellomliggende dose av EVO (dvs. 10 uM) ble valgt for å brukes i alle de følgende prøver med mindre annet er angitt.
fig. 1C viste at morfologier av H446-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av EVO i 24 timer ble vesentlig endret. Når EVO konsentrasjonen øket, mer H446-celler ble rund og løsrevet fra dyrkningsplaten som deres pseudopodia gradvis trekkes tilbake. EVO hemmet H446 cellevekst på en doseavhengig måte, med unntak av at H446-celler behandlet med EVO ved 5 pM, 10 pM eller 20 pM i 24 timer hadde lignende cytotoksiske effekter.
Til sammen utgjør den naturlige urtebestanddelen EVO vesentlig hemmet viabilities av H446 og H1688 SCLC celler i dose- og tidsavhengige oppførsel.
3.2 Effekter av evodiamine på celle~~POS=TRUNC syklus~~POS=HEADCOMP og apoptose
for å undersøke forstyrrelse av cellesyklusen var ansvarlig for EVO-formidlet hemming av cellevekst, studerte vi cellesyklus-fordeling. Som vist på fig. 2A og 2B, EVO selektivt arrestert cellesyklusen ved G2 /M fase (dvs. pre-mitotisk /mitotisk fase). Etter behandling med 10 uM EVO til 24 timer, antallet EVO-behandlede H446 eller H1688 celler i G2 /M (~63% eller -50%) var omtrent 5-ganger eller 2,5 ganger større enn de ubehandlede celler (blindprøve , ~13% eller 20%). I mellomtiden, tallene (~31% eller ~29%) av EVO-behandlede H446 eller H1688 celler i S-fasen (syntesefasen under hvilken kromosomene replikeres) var nesten det samme som de for de ubehandlede celler (~ 30% eller ~29%).
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP ble oppdaget av PI analysen. Apoptose ble påvist ved hjelp av en Annexin V /PI dobbel farging analysen. De H446 celler farget med Annexin V /PI ble observert under en invertert fluorescens mikroskop. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). *
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe. Ubehandlede H446 eller H1688-celler ble anvendt som en negativ kontrollgruppe.
Apoptose er også referert til som cellulære selvmord eller programmert celledød. For å avgjøre om EVO indusert apoptose i SCLC H446 og H1688 celler, apoptose priser ble oppdaget av Annexin V-FITC /PI dobbel farging. Etter behandling med EVO til 24 timer, som vist i fig. 2C og 2D, apoptose frekvensen av EVO-behandlede H446 (~15%) eller H1688 (~11%) -celler var mye høyere enn for de ubehandlede celler (blank kontroll, ~ 5% eller ~4%); som vist i fig. 2E, typiske trekk ved apoptose, som kromatin kondens og marginalisering, kjernekraft segmentering og apoptotisk kroppen formasjon, ble observert i EVO-behandlede H446 celler. Kort sagt, EVO betydelig apoptose i begge H446 og H1688 celler. Det skal bemerkes at i våre preliminære forsøk vurderte vi de apoptotiske virkninger av lavere doser av EVO (slik som 1,25 uM og 2,5 uM). Apoptose priser av SCLC H446 celler behandlet med 1,25 mikrometer EVO eller 2,5 mikrometer EVO var nesten det samme som de tilsvarende tomme kontrollene (data ikke vist).
3.3 Effekter av evodiamine på ROS, Ca
2+ og ψ
m Levels
ROS, Ca
2 + og ψ
m nivåene var kritiske faktorer som indikerer mulig aktivering av apoptose veier. De fleste ROS er frie radikaler som forårsaker DNA, protein og biomembranen skade [18]. Intracellulært kalsium er en viktig intracellulær signaleringsfaktor. Ψ
m er en viktig indikator på celle helse fordi det er relatert til ATP produksjonskapasitet av celler. I denne studien, ROS, Ca
2 + og ψ
m ble målt med fluorescerende prober ved hjelp av en FACSVantage flowcytometer [18]. Etter behandling med EVO til 24 timer, sammenlignet med kontrollgruppene, (1) ROS-nivåer i EVO-behandlede SCLC H446-celler økt med mer enn en fjerdedel (~28%), og i H1688 celler, ROS-nivåene mer enn dobles (~104%) (figur 3A og 3B.); (2) den intracellulære Ca
2 + nivåer i både H446 og H1688 celler økte med halvparten (~51% eller -48%) (figur 3C og 3D.); (3) ψ
m nivåer redusert med nesten en tredjedel (~32%) og av en syvende (~14%) i H446 og H1688 celler, henholdsvis (Fig. 3E og 3F). Resultatene tyder på at EVO økte ROS-nivåene i SCLC-celler. Overskudd av ROS skadet ikke bare den DNA, men det også skadet mitokondriemembranen og øket mitokondriemembranen permeabilitet. Mer kalsium ble løslatt fra mitokondrier og kom inn i cytoplasma. Den intracellulære kalsiumkonsentrasjon, og mitokondriemembranen potensialet ble delvis depolarisert. EVO indusert apoptose i både SCLC H446 og H1688 celler gjennom ROS-mediert mitokondrie vei.
ROS, Ca
2 + og ψ
m ble separat oppdaget av DCF-DA, Fluo-3 /AM og JC-1-analyser. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688 celler ble brukt som en negativ kontrollgruppe. *
P
. 0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe
3.4 Effekter av evodiamine på caspase-8, -9 og -3 aktivitetsanalyse
Kaspaser er proteolytiske enzymer som er viktige formidlere av apoptose. Virksomheten til caspase-8, -9 og -3 ble bestemt ved spektrofotometri. Sammenlignet med de tilsvarende kontrollgruppene, betydelige økninger i aktiviteter av kaspase-8, -9 og -3 ble funnet i H446-celler ble behandlet med 10 uM EVO til 24 timer, 48 timer og 72 timer, med unntak av økningen i caspase -8 aktivitet i EVO-behandlede celler etter 24 timer, som ikke var statistisk signifikant. De høyeste nivåene av kaspase-8 (~213%, fig. 4A) ble og caspase-9 aktivitet (~240%, fig. 4B) observert etter behandling med EVO i 48 timer, mens den høyeste grad av caspase-3 aktivitet ( ~564%) ble observert ved 4 ° C 24 timer (fig.). Men de høyeste caspase-8 og -9 aktiviteter var likevel lavere enn den caspase-3 aktivitet (~278%) i EVO-behandlede celler i 48 timer. Disse resultatene tyder på at EVO indusert apoptose ved kaspase-avhengige reaksjonsveier.
Cellelysater ble analysert ved hjelp av en kolorimetrisk analyse av Ac-DEVD-pNA. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Kaspase-aktivitet ble gitt som vilkårlige enheter (AU) pr milligram protein. Ubehandlede H446-celler ble anvendt som en negativ kontrollgruppe. *
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe.
#
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlet gruppe på 24 timer.
P
. 0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlet gruppe på 48 h
3,5 Effekter av evodiamine på Protein Expression of Cyt C, caspase-12, – 8, -9 og -3, er Fas og Trail
Cyt C en mitokondrie protein som er involvert i initiering av mitokondriene-mediert apoptose. Kaspaser er cystein-asparaginsyre proteaser som er essensielle for apoptose. Caspase-12 er lokalisert til ER og er involvert i ER-mediert apoptose. Caspase-8 medierer signaltransduksjon nedstrøms for døds reseptorer (DR) befinner seg på plasmamembranen, og er således involvert i DR-mediert apoptose. Samspillet mellom DR med sine naturlige ligander (som Fasl og Trail) induserer aktivering av caspase-8. Caspase-9 er en asparaginsyre-spesifikk protease. Caspase-3 er en bøddel caspase ansvarlig for kromatin kondens og DNA-fragmentering i apoptose. Cyt C og caspase-12 og -8 utløse aktivering av caspase 9 (initiativtaker caspase) og caspase-3 (effektor caspase) før de endelig indusert apoptose.
For EVO-behandlet H446 eller H1688 celler, sammenlignet med de tilsvarende kontrollgrupper (nivå ble satt til 100% i hver av kontrollene), (1) proteinet ekspresjonsnivåer av Cyt C ble signifikant økt med ~220% og ~367% (se fig. 5A og 5B), respektivt , (2) proteinet uttrykket nivåer av kaspase-12 ble signifikant økt med ~248% og ~190% (se fig. 5C og 5D), henholdsvis, og (3) den proteinekspresjon nivåer av kaspase-8 var nesten uforandret ( ~94% og ~112%, henholdsvis) (se fig. 5E og 5F). Videre undersøkelser av H446-celler behandlet med EVO viste at den markerte økning av nivået av Cyt C resulterte i økt caspase-9 og -3 ekspresjon ved ~275% og 204%, henholdsvis (se fig. 5G og 5H). Videre er Fasl og Trail, som er kaspase-8 aktivatorer, ikke var uendret (~102% og ~105%, henholdsvis) (se fig. 5I og 5J). Western Blot Resultatene antydet at EVO økte Cyt C og caspase-12 nivåer i både H446 og H1688 SCLC celler, og dermed EVO indusert apoptose gjennom både mitochondria- og ER-mediert veier. Videre forhøyet protein ekspresjon av caspase-9 og -3 indikerte at EVO apoptose gjennom en caspase-3-avhengig reaksjonsvei. Derimot har EVO hadde ingen effekt på protein ekspresjon av kaspase-8 i enten H446 eller H1688 SCLC-celler, noe som antyder at det ikke induserer apoptose gjennom en DR-mediert reaksjonsvei.
Cellelysater ble analysert ved hjelp av Western blot . Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688 celler ble brukt som en negativ kontrollgruppe. *
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende kontrollgruppe. Fas: faktor assosiert selvmord; Trail: tumor nekrose faktor-relatert apoptose induserende ligand; Cyt C: cytokrom C.
3.6 Effekter av evodiamine på mRNA uttrykk av Bax og BCL-2
BAX er også kjent som Bcl-2-lignende protein 4 eller Bcl- 2-assosiert X; Bcl-2 står for B-celle lymfom 2. Bax fremmer apoptose ved å antagonisere Bcl-2, som er spesielt ansett som en viktig anti-apoptotiske protein. Samtidig er BAX og BCL-2 separat kodet av BAX og BCL-2 gener. Her ble de ekspresjonsnivåene av Bax og Bcl-2 genene bestemt ved RT-PCR. Sammenlignet med deres tilsvarende kontroller, (1) mRNA-ekspresjonsnivåene av Bax i H446 eller H1688 celler behandlet med EVO ble signifikant økt med ~215% eller ~135% (ved 24 timer), ~397% eller ~172% (ved 48 h) og ~514% eller ~185% (ved 72 timer), henholdsvis (fig. 6A og 6B). (2) På den annen side, de mRNA ekspresjonsnivåer av Bcl-2 i EVO-behandlede H446 eller H1688-celler ble signifikant redusert med -10% eller ~11% (ved 24 timer), -60% eller ~28% (ved 48 h), og ~66% eller ~53% (ved 72 timer), henholdsvis (fig. 6C og 6D). Tatt sammen, økte EVO forholdet Bax /Bcl-2 på transkripsjonsnivået, som forventes å ytterligere øke andelen av Bax /Bcl-2 på proteinnivå, og til slutt fremme apoptose.
Cellelysater ble analysert ved RT-PCR. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger. Data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Ubehandlet H446 eller H1688 celler ble brukt som en negativ kontrollgruppe. *
P
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen.
#
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlet gruppe på 24 timer.
P
0,05 sammenlignet med tilsvarende EVO behandlet gruppe på 48 h
Diskusjoner
I denne studien, viser vi for første gang. at EVO hemmer i betydelig grad levedyktigheten av SCLC-celler. IC
50 verdier av EVO i H446-celler ble redusert fra 20 uM (24 h) til 18.07 um (48 h) eller 1,80 uM (72 h); og i H1688 celler, IC
50 redusert fra 8.14 uM 24 (h) til 2,08 uM (48 h) eller 1,37 uM (72 h). EVO utøves hemmende effekt på H446 og H1688 celler i treringstrinnet og tidsavhengige oppførsel. Det er tidligere dokumentert at IC
50 verdier av EVO i humane NSCLC-celler var 12 um (48 h, H460-celler) [13], 13,2 pM (72 h, (R) -EVO, H460-celler) [12] , 2.6 um (72 H, (S) -EVO, H460-celler) [12], og 100 uM (72 h, A549-celler) [9]. Kort sagt, EVO oppviste antitumoraktivitet i SCLC i tillegg til NSCLC-celler. Videre er det i de fleste tilfeller, EVO hemmet veksten av H446 SCLC-celler mer effektivt enn den for H460 og A549 NSCLC-celler.
Undersøkelsen av cellesyklusfordelingen viste at forstyrrelse av cellesyklusen var ansvarlig for EVO- mediert cellevekst inhibering. Antallet H446 og H1688 celler i S-fasen var nesten uforandret etter EVO behandling sammenlignet med kontrollen. Men EVO utløste en pågripelse i G2 /M fase, dvs. EVO behandlet H446 og H1688 celler akkumulert i G2 /M-fasen. En arrestasjon av celler i G2 /M fase som svar på gentoksisk spenning (for eksempel oksidativt stress og DNA-interkaleringsforbindelser midler) kan indusere DNA-skade i både p53-avhengig (via ROS) [20] og p53-uavhengig måte [21].
Det er tidligere dokumentert at EVO indusert apoptose i ulike menneskelige kreftceller via forskjellige veier. For eksempel, i NSCLC H1299-celler ble indusert apoptose gjennom undertrykkelse av den nukleære faktor (NF) -κB aktiveringsveien [10]; og i bukspyttkjertelen SW1990-celler ble indusert apoptose via regulering av PI3 K /Akt sti [22], i 253J og T24 blærekreftceller, apoptose indusert gjennom mTOR /S6K1-mediert nedregulering av Mcl-1 [8]. Apoptoseinduksjon av EVO i H446 eller H1688 SCLC celler ble preget av Annexin V-FITC /PI dobbel farging og morfologiske endringene var tydelig i H446 celler. I tillegg er resultatene fra denne studien viser at G2 /M-fase cellesyklus-stans stanses H446 og H1688 celleveksten og førte til slutt til celledød ved apoptose gjennom to iboende kaspase-avhengige reaksjonsveier, men ikke gjennom den ytre caspase-avhengige reaksjonsveien (Fig . 7):
Apoptose ble indusert gjennom mitokondriene-mediert caspaseaktivering veien. Resultatene viste at EVO utløste mitokondriell apoptose ledsaget av akkumulering av ROS. I denne studien, endring av mitokondriemembranen permeabilitet som induseres av ROS generasjon førte til aktivering av intracellulære kalsium-frigjøring, tap av mitokondriemembranpotensialet, og den etterfølgende frigjøring av Cyt C. Som en apoptose faktor, Cyt C ytterligere utløses aktiveringen av caspase 9 (initiator caspase) etterfulgt av aktivering av kaspase-3 (effektor caspase), induksjon av PARP spalting og den endelige induksjon av apoptose [23]. Xu et al.
