Abstract
Lungekreft er den nest vanligste kreftformen og den ledende årsak til kreft dødsfall. Til tross for nylige fremskritt i utviklingen av målrettet terapi, pasienter med avansert sykdom forbli uhelbredelig, mest fordi metastatisk ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) etter hvert bli resistente mot tyrosinkinasehemmere (TKI). Kinase-inhibitorer har potensial for target promiscuity fordi den kinase-superfamilien er den største familien av druggable gener som binder seg til et felles substrat (ATP). Som et resultat, har TKI ofte utviklet for et bestemt formål vist seg å virke på andre mål. Drug affinitetskromatografi har blitt brukt til å vise at dasatinib samvirker med TGFp type I-reseptor (TβR-I), en serin-treoninkinase. For å bestemme den potensielle biologiske relevansen av denne foreningen, studerte vi den kombinerte effekten av dasatinib og TGFB på lungekreftcellelinjer. Vi fant ut at dasatinib behandling alene hadde svært liten effekt; imidlertid, når NSCLC-cellelinjer ble behandlet med en kombinasjon av TGFp og dasatinib ble indusert apoptose. Kombinert TGFB-1 + dasatinib behandling hadde ingen effekt på aktiviteten til Smad2 eller andre ikke-kanoniske TGFB intracellulære meklere. Interessant, kombinert TGFp og dasatinib behandling resulterte i en forbigående økning i p-Smad3 (sett etter 3 timer). I tillegg, når NSCLC-celler ble behandlet med denne kombinasjon, den pro-apoptotiske protein BIM ble oppregulert. Knockdown av ekspresjonen av Smad3 ved hjelp Smad3 siRNA også resulterte i en reduksjon i BIM-protein, noe som tyder på at TGFp-1 + dasatinib-indusert apoptose medieres ved Smad3 regulering av BIM. Dasatinib er bare effektive i å drepe EGFR muterte celler, som er vist i bare 10% av NSCLCs. Derfor observasjonen at villtype EGFR lungekreft kan bli manipulert til å gjengi dem følsomme for drap av dasatinib kan ha viktige implikasjoner for å utforme nyskapende og potensielt mer effektive behandlingsstrategier for denne sykdommen
Citation. Gordian E, Li J, Pevzner Y, Mediavilla-Varela M, Luddy K, Ohaegbulam K, et al. (2014) transformerende vekstfaktor β signale seirer Dasatinib Resistance i lungekreft. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10,1371 /journal.pone.0114131
Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA
mottatt: 27 mars 2014; Godkjent: 03.10.2014; Publisert: 11.12.2014
Copyright: © 2014 Gordian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health SPORE Grant P50 CA119997-02-S2. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den nest vanligste kreftformen og står for ca 15% av alle kreftdiagnoser. Til tross for nylige fremskritt i utviklingen av målrettet terapi, pasienter med avansert sykdom er fortsatt uhelbredelig. På grunn av det genetiske mangfoldet innen svulster, celler med aktiverte alternative vekst trasé til slutt dukke opp; dermed forstå mekanismer som ulike veier er slått av og på er viktig i utformingen av nye målrettede behandlingsformer. Selv om noen kreftformer er i utgangspunktet svært følsomme for tyrosinkinasehemmere (TKI), til slutt utvikler resistens. For eksempel, et flertall av metastatisk ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) hos pasienter med EGFR-aktive mutasjoner responderer på behandling med erlotinib; Men alle pasienter til slutt fremgang. Derfor er alternative terapier sterkt behov for pasienter med EGFR mutasjoner som i utgangspunktet svarer til EGFR TKI terapier, men til slutt utvikle resistens, så vel som for pasienter som viser villtype-EGFR genotype [1]. Denne motstanden kan være delvis på grunn av kompleksiteten som karakteriserer signalisering av disse typer proteiner, så vel som heterogeniteten av lunge adenocarcinomer [2]. Dasatinib, en TKI med flere kinase mål, blir nå testet for å behandle ulike kreftformer hvor disse målene er overuttrykt, inkludert kronisk myelogen leukemi og bryst og lunge kreft [3], [4], [5]. Kliniske studier har testet effekten av dasatinib i NSCLC som monoterapi [6], i kombinasjon med tiden brukes kjemoterapiregimer som epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) inhibitor erlotinib [7], og hos pasienter som har utviklet resistens overfor erlotinib og gefitinib [8]. Song
et al
vist at dasatinib induserer apoptose i en del av NSCLC-celler som utviser en mutant fenotype EGFR; men denne effekten ble ikke observert i NSCLC-cellelinjer med en vill-type EGFR fenotype [9].
transformerende vekstfaktor β (TGFp) er et cytokin som er involvert i en rekke cellulære prosesser, inkludert vekst, proliferasjon, adhesjon , migrasjon og apoptose. I tillegg er tap av respons til TGFp-1 blitt korrelert med tumorgenisitet i mange forskjellige krefttyper [10]. TGFp signaltransduksjon begynner med ligand binding til de TGFp type II reseptor (TβR-II), etterfulgt av rekruttering av type I-reseptor (TβR-I) og dannelse av en hetero-oligomere kompleks av TGFp-1, TβR-II, og TβR -I [11]. Etter kompleksdannelse, konstitutivt autofosforyleres TβR-II fosforylerer TβR-I, initiere en fosforylering kaskade av nedstrøms cytoplasmiske substrater, inkludert Smad proteinene, med påfølgende aktivering av målgener [10]. Den krysstale mellom TGFp reaksjonsveien og mange andre signaloverføringsveier resulterer i endring av den opprinnelige TGFp signal gjennom ikke-kanoniske trasé og blir brukt til å forklare de multiple effekter av TGFp [12], [13], [14]. I normale epitelceller, inhiberer TGFp celleproliferasjon og induserer apoptose, for derved å virke som en tumor suppressor; men i mange krefttyper, TGFfi fungerer som en svulst promoter (celle invasjon, metastase, immunregulering, og mikromiljøet modifikasjon) [15].
Drug affinitetskromatografiske eksperimenter viste at dasatinib, opprinnelig utviklet som et SRC inhibitor [16], samhandler med over 40 kinaser, inkludert tyrosin kinaser, reseptor tyrosin kinaser, serin /treonin kinaser, og MAP kinaser. Ett av serin /treoninkinaser som ble identifisert ved bruk av denne fremgangsmåten var den TGFp type I-reseptor (TβR-I) [17]. For å bestemme den potensielle biologiske relevansen av denne foreningen, studerte vi den kombinerte effekten av dasatinib og TGFB på NSCLC cellelinjer. Vi fant ut at dasatinib behandling alene hadde svært liten effekt; imidlertid, når NSCLC-cellelinjer ble behandlet med en kombinasjon av TGFp og dasatinib ble indusert apoptose. Dasatinib er bare effektive i å drepe EGFR muterte cellene [9], som står for 10% av NSCLCs; derfor til observasjon at lungekrefttilfellene kan manipuleres gjengi dem følsomme for drap av dasatinib kan ha viktige implikasjoner for å utforme nyskapende og potensielt mer effektive behandlingsstrategier for denne sykdommen.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
human lunge adenokarsinom NCI H292 og A549 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI-1640 medium (Thermo Scientific, Waltham, MA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Inc., Lawrenceville, GA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 1 mM glutamin. Cellelinjene ble opprettholdt i en fuktig inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2.
Antistoffer og forbindelser
Polyklonalt anti-Shc1 antistoff ble erholdt fra Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), og polyklonale anti-MADH7 (Smad7) antistoff ble kjøpt fra Abcam Inc. (Cambridge, MA). Anti-HDAC2 ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA). Følgende antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA): anti-pSma2 (linker og COOH bestemt fosforylering), anti-Smad2, anti-pSmad3, anti-Smad3, anti-Pakt, anti-Perk, anti-BIM, anti-PARP, og anti-GAPDH. Rekombinant human TGFp-1-protein ble innkjøpt fra R disse ble rangert basert på egenskaper som inngår hydrofobisitet, oppløsningsmiddel eksponering, og hydrogenbinding potensial. Initial Glide [32], [33] SP (standard presisjon) etterfulgt av XP (ekstra presisjon) dokking av de fire forbindelsene ble utført til de 3 beste bindingssteder. Basert på denne første dokking, ble nettstedet en valgt som mer sannsynlig bindingssetet. Site 1, som korrelerer til lommen hvor dorsomorphin ble beskrevet, ble også rangert høyest av SiteMap.
Senere docking studiene ble utført ved hjelp av indusert Fit Docking (IFD) [32], [34] arbeidsflyt i Maestro. IFD arbeidsflyt regnskapet for reseptoren fleksibilitet ved prøvetaking orienteringer av nettstedet kjedene innenfor bindende regionen ved dokking av liganden. Flere ligand conformations ligger til kai på en slik måte og scoret ved hjelp Glide. Hver ligand var forankret i Side en definert av liganden beste scoring posere fra den første SP docking til nettstedet 1. For hver ligand IFD scorte og rapporterte flere (-50) protein-ligand conformations som den gjennomsnittlige IFD Poengsummen ble beregnet.
Proliferasjon /Cytotoxiticy
A549-celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10
3-celler per brønn i triplikat. Etter 24 timer ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av TGFp-1, dasatinib, eller TGFp + dasatinib kombinert. Etter en 48-timers inkubasjon ble proliferasjon /cytotoksisitet målt ved tilsetning av CellTiter 96 One Solution (Promega Corporation, Madison, WI). Etter tilsetningen ble cellene inkuberes i 1 time, og absorbansen ble målt ved 490 nm på en Biotek EL808 mikroplateleser (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT). Behandlede prøver ble normalisert til ubehandlede kontroller, med resultater som er vist som prosent.
Western blotting
Hel-celle-protein ekstraksjon ble gjennomført ved skraping cellene i kald 1X fosfat-bufret saltvann (PBS), etterfulgt av ultralydbehandling og lysering i 1X CHAPS buffer (Cell Signaling Technology). For å bestemme den subcellulære lokalisering av Smads proteiner ble celler fraksjonert i nukleære og cytoplasmiske komponenter som tidligere beskrevet [35]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad, Hercules, CA). Protein lysater ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE), overført til polyvinylidenfluorid membran (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts), blokkert i 1 time i 1 x TBST som inneholdt 5% fettfri melk og inkubert over natten i tilsvar primært antistoff ved 4 ° C. Blottene ble avsluttet ved inkubasjon med pepperrot peroksidase-merket sekundært antistoff og utviklet ved hjelp av Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare og biovitenskap, Pittsburg, Pennsylvania).
caspase analysen
A549 cellene sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10
3-celler per brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av TGFp-1, dasatinib, eller TGFp + dasatinib kombinert, og Cell spiller 96-brønners kinetisk caspase 3/7 reagens ble tilsatt samtidig (Essen Bioscience). Behandlinger ble utført in triplo. Inkubasjon ble gjort i en fuktig inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 med IncuCyte levende celle bildebehandling system (Essen Bioscience), som tillater oss å fange ett bilde fra hver brønn gjennom en × 20 objektiv og GFP filter cube 2-timers tidsintervaller i 48 timer. Den første og siste bilder av hvert bilde sett ble hentet ut for analyse med Definiens Developer versjon 1.5 (Definiens Inc., München, Tyskland), og caspase 3/7-positive celler ble identifisert og segmentert med en autothreshold segmentering algoritme. Denne segmenteringen ble videreutviklet av objektstørrelse, og til slutt antall caspase 3/7 celler ble nummerert. Verdier er representert som det gjennomsnittlige antall av kaspase 3/7-positive celler fra tre uavhengige eksperimenter.
cellesyklusanalyse
A549-celler ble sådd ut ved 3 x 10
5 celler pr brønn i 6-brønners kulturplater. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller bærer (DMSO). Etter behandling ble cellene oppsamlet flytende og senere kombineres med adherente celler høstet ved trypsinering. Celler ble resuspendert i 1 x PBS, fiksert i 2 ml iskald 70% etanol, og inkubert i 2 timer ved -20 ° C. Cellepelleter ble oppsamlet ved sentrifugering (5000 rpm i 5 minutter) og resuspendert i 400 ul av propidiumjodid (0,6 mM), Triton X-100 (0,1% v /v), og RNase A (0,2 mg /ml). Etter 30 minutters inkubasjon ved 37 ° C, ble cellene analysert for DNA innhold ved hjelp av en FACS Calibur (BD Biovitenskap, San Jose, CA), og data ble analysert ved hjelp ModFit LT V3.3.11 programvare (Verity Software House, Topsham, ME).
siRNA eksperimenter
ON TARGETplus SMART basseng siRNA mot
Shc1
,
Smad3
, og negativ kontroll ble kjøpt fra Dharmacon (Thermo Scientific) . Hver pool ble rekonstituert i 1 x siRNA buffer (Dharmacon) og fortynnet i DEPC-behandlet vann til en sluttkonsentrasjon på 20 uM. Transiente transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, NY). I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og transfektert etter 24 timer ved 60-70% konfluens. Den lipofektamin RNAiMAX, OptiMem (Invitrogen), og 200 pmol av siRNA blandingen ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur og tilsatt til celler inkubert i serumfritt medium. Etter inkubering ved 37 ° C i 4 timer ble mediet fjernet. Cellene ble deretter vasket en gang i 1 x PBS, og forbindelse inneholdende medium ble tilsatt til cellene. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon for protein utvinning forberedelse.
Resultater
TβR-I docking studier
Eksperimenter som bruker narkotika affinitetskromatografi å identifisere molekyler som kommuniserer direkte med dasatinib har identifisert over 40 kinaser, inkludert tyrosin kinaser, reseptor tyrosin kinaser, serin /treonin kinaser, og MAP kinaser. Ett av serin /treoninkinaser som er identifisert ved hjelp av denne metode er TβR-I [17]. TβR-I har en cysteinrike N-terminale domenet som er involvert i ligandbindende, et enkelt transmembranskruelinje, en regulerings cytoplasmatisk juxtamembrane region, og en C-terminal serin treonin kinase domene [36]. For å undersøke bindingen av dasatinib til TβR-I, vi utførte tilkoblings studier ved bruk av tidligere rapporterte krystallstrukturen av TβR-I cytoplasmatiske domene [18]. Som beskrevet i Materialer og metoder, området betegnet som Site 1 ble valgt som mer sannsynlig bindingssetet. I våre studier har vi sammenlignet bindingen av dasatinib, bosutinib (strukturelt beslektet med dasatinib), LY-364947 (TβR-I kinase kommersielt tilgjengelig hemmer [37]), og dorsomorphin (opprinnelig brukt i TβR-I krystallisering studier). Hver ligand var forankret i Side en definert av liganden beste scoring posere fra den opprinnelige standard presisjon docking til nettstedet 1. For hver ligand, Induced Fit Docking (IFD) ble scoret, med flere (-50) protein-ligand conformations rapportert som den gjennomsnittlige poengsum IFD ble beregnet (fig. 1C). Våre docking resultatene av de fire ligander av interesse viste at dasatinib scoret høyest. IFD protokollen angitt at TβR-I -dasatinib dannet beste scoring kompleks (IFD poengsum på omtrent -14 742 kcal /mol), så vel som mottok bedre i gjennomsnitt (IFD poengsum på omtrent -14 694 kcal /mol) over alle rapporterte komplekser. Den beste TβR-I-dorsomorphin Komplekset hadde en IFD score på omtrent -14 519 kcal /mol med gjennomsnittet av -14 469 kcal /mol. Bosutinib og LY-364947 utførte de fattigste, med beste protein-ligand komplekser ledelsen på ca -14 353 kcal /mol og -14 154 kcal /mol, henholdsvis, og i snitt -14 313 kcal /mol og -14 119 kcal /mol. Analyse av den øverste pose fremstilt av det fleksible forankringsmodellen viser at bosutinib interaksjon med bindingssetet omfatter fire hydrogenbindinger med stene Pro-439, Thr-378, Asn-341 og Tyr-219 i en avstand på 2,4, 2,18, 2,37 og 2,25 Å og med respektive vinkler på 120,7, 144,8, 154,1 og 151,6 grader (fig. 1A). Omvendt, danner dasatinib tre hydrogenbindinger med Arg-218, Asn-341 og Hans-284 i en avstand på 1,97, 2,00 og 2,32 Å og vinkler på 145,9, 150,3 og 139,7 grader (Fig. 1B).
Ligand samhandling diagram av (A) bosutinib og (B) dasatinib dokket inn TβR-en. Liganden er representert i svart. Hydrogenbindinger er merket med tall ved siden av obligasjonen. Avstander og vinkler av hver hydrogen binding som er merket på figuren er gitt i tabeller i hver figur. (C) for 1. IFD resultater. Gjennomsnittlig (svart) og beste (hvit) IFD score av de fire forbindelsene forankret i stedet en basert på -50 innrapporterte positurer for hver forbindelse. IFDScore multipliseres med -1 for klarhet i presentasjonen.
Dasatinib påvirker respons på TGFB-en hos NSCLC cellelinjer
For å bestemme den potensielle biologiske relevansen av sammenhengen mellom dasatinib og TβR-i, A549 lungekreftceller dyrket i komplett medium inneholdende TGFp-1 ble inkubert i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av dasatinib som tidligere beskrevet [9]. Enkelt behandling med TGFp-1 eller dasatinib hemmet celleproliferasjon (45% og 34%, henholdsvis, Fig. 2A, asterisker). Interessant, denne hemming av proliferasjon økte når cellene ble behandlet med en kombinasjon av TGFp-1 og dasatinib (75% inhibering, Fig. 2A, dobbelt stjerne). Økningen i hemming av proliferasjon var avhengig av dasatinib dose. Lignende resultater ble oppnådd når cellelevedyktighet ble anvendt for å bestemme antall celler (S1 figur). For ytterligere å forstå den observerte inhibering i celleproliferasjon, undersøkte vi effekten av denne kombinerte behandlings på cellesyklusprogresjon. Etter 48 timers behandling med TGFp-1 og dasatinib, økningen i cellene i G1 var ikke signifikant forskjellig fra når cellene ble behandlet med TGFp-1 alene (fig. 2B, heltrukket linje). På samme måte, med den dobbelte behandling, var det en økning i antall celler i G2 /M etter at TGFp-1-behandling, men økningen i celler var ikke forskjellig fra når cellene ble behandlet med dasatinib alene (Fig. 2B, stiplet linje) . Derfor kan reduksjonen i celletallet etter at TGFp-dasatinib kombinasjonsbehandling ikke forklares ved endringer i cellesyklusen.
(A) A549-celler ble behandlet med DMSO, forskjellige konsentrasjoner av TGFp-1 (0-10 ng /ml, hvite stolper), forskjellige konsentrasjoner av dasatinib (0-400 nM; sorte stolper), eller en kombinasjon av TGFp-1 og dasatinibbehandlede (stiplet bar) i 48 timer. Behandling av celler med begge midler resulterte i økning inhibering (**), som sammenlignet med når cellene ble behandlet med enten middel alene (*). (B) A549-celler ble behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Etter 48 timer ble propidiumjodid fargede celler analysert for å bestemme cellesyklusfordeling og analysert som beskrevet i Materialer og Metoder.
økt apoptose i celler behandlet med TGFp i kombinasjon med dasatinib
TGFB har vært innblandet i pro-apoptotiske responser, samt anti-apoptotiske respons [38]; derfor vi undersøkt om hemming av spredning sett etter kombinert TGFB + dasatinib i A549 celler ble resultatet av apoptotisk celledød. Apoptose ble målt ved hjelp av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spalting etter behandling med TGFp-dasatinib kombinasjon. Dasatinib eller TGFp-1 alene induserte ikke apoptose målt ved PARP-spaltning (Fig. 3A). Dette er i samsvar med det som er blitt rapportert tidligere, der behandling av A549 celler med dasatinib ikke resulterte i apoptose [4]. I motsetning til dette, en kombinasjon av TGFp + dasatinib resulterte i apoptose, bestemt til å samarbeide behandling med dasatinib, som inkubering med en EGFR-inhibitor (erlotinib) eller en annen SRC-inhibitor (AZD0530) resulterte ikke i PARP spalting (fig. 3A). For å vurdere om
de novo
proteinsyntese er nødvendig for at TGFp + dasatinib-indusert apoptose, A549 celler ble for-behandlet med 10 pg /ml cykloheksimid i 1 time, etterfulgt av TGFp-1 behandling med eller uten dasatinib. Som vist på fig. 3B, tilsetning av cykloheksimid hemmet ikke økning i apoptose, hvilket antyder at
de novo proteinsyntese
er ikke nødvendig. Vi undersøkt effekten av kombinasjonsbehandlingen i 15 NSCLC-cellelinjer (13 EGFR WT og 2 EGFR MU) og funnet øket PARP-spaltning i fem av dem når de behandles med en kombinasjon TGFp + dasatinibbehandlingen (S2 figur).
(A) A549-celler ble behandlet med 100 nM av dasatinib, 1000 nM av AZD0530 eller erlotinib med eller uten 5 ng /mL TGFp-1 i 48 timer. (B) A549-celler ble forbehandlet med 10 pg /ml cykloheksimid (CHX) i 1 time, etterfulgt av TGFp-1 pluss eller minus dasatinib. Etter inkubering ble cellene høstet, lysert, og PARP spalting detektert ved Western-blot-analyse. (C) A549-celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10
3 per brønn.
C
alen ble behandlet, og Cell Player 96-Well Kinetic caspase 3/7 Reagens ble lagt samtidig. Behandlinger ble utført in triplo. Verdier er vist som gjennomsnittlig antall caspase 3/7 positive celler fra 3 uavhengige eksperimenter.
For å bekrefte TGFB + dasatinib-indusert apoptose, en caspase-3/7 analyse (Incucyte) ble brukt å samtidig måle celledød og caspase 3/7 aktivitet. Som vist på fig. 3C, det TGFp + dasatinib kombinasjonsbehandling resulterte i en signifikant økning (92%) i antallet av celler som gjennomgår apoptose sammenlignet med hver behandling alene (22% og 19%, respektivt). I tillegg TGFp-dasatinib kombinasjon resulterte i tap av mitokondriell elektrisk potensial og frigjøring av cytokrom c fra mitochondria (data ikke vist), noe som tyder på at den observerte apoptose er et resultat av aktiveringen av indre (mitokondriell) apoptotiske reaksjonsveier.
TGFp-1-dasatinib virkning på aktiviteten av TGFp intracellulære mediatorer
TGFp er blitt vist å stimulere flere intracellulære reaksjonsveier, inkludert den Smad pathway (kanonisk pathway) og andre intracellulære mediatorer, inkludert p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), AKT, og ERK (ikke-kanoniske pathways) [39]. Derfor neste undersøkte vi om TGFB-dasatinib behandling aktivert disse banene ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner den fosforylert (aktivert) form av mediatorer fra begge de kanoniske og ikke-kanoniske veier. Som vist på fig. 4, uttrykk for aktivert Smad2 eller Smad3 ble ikke observert i hele celleekstrakter av enten ubehandlet eller dasatinibbehandlede celler, men ble observert etter TGFB-en behandling eller etter behandling med TGFB + dasatinib. Interessant, nivåer av fosforylert Smad3 etter behandling med TGFB-dasatinib er høyere enn nivåene med TGFB-en behandling alene. Økningen i p-Smad3 ses etter en time av TGFp-dasatinib kombinasjonsbehandling i Smad3 aktivering er forbigående som det ikke kan sees 48 timer etter behandling (data ikke vist). Dette er i motsetning til Smad2 fosforylering, som kan sees så tidlig som 5 minutter og forblir fosforylert før 48 timer. Dette kan være på grunn av den betydelig kortere halveringstiden for Smad3 (4,7 timer) sammenlignet med Smad2 (12,5 timer) [40]. Forbehandling med det TβR-I-inhibitor LY364947, blokker Smad2 fosforylering i nærvær eller fravær av dasatinib (Fig. 4B). Som forventet er SRC fosforylering inhiberes i nærvær av dasatinib, og inkubasjon med TGFp-1 påvirker ikke denne inhibering.
A549 NSCLC-celler ble behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib , eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib for ulike mengder tid (en time for deteksjon av pSmad2 og pSmad3, og 48 timer for påvisning av pSrc). Etter inkubering ble helcellelysater oppsamlet og underkastet Western blotting med de angitte antistoffer.
lokalisering og aktivitet av Smads proteiner er avhengig av fosforyleringen status i COOH og linkerområdene [41]. For å avgjøre om økningen i apoptose observert med kombinasjonen behandling skyldes endringer i plasseringen av Smads, undersøkte vi effekten av den kombinerte TGFB-dasatinib-behandling på lokalisering av de aktive Smads. Etter 48 timers TGFp-1 eller kombinasjonsbehandling av TGFp-dasatinib, celleekstrakter ble fraksjonert, og de fosforylerte Smads ble undersøkt i hver fraksjon. Som vist på fig. 5A, den Smad2 fosforylert i karboksyterminaler (p-Smad2 COOH) øker hovedsakelig i kjernen. Den Smad2 fosforylert i linkerområde (p-Smad2 Linker) øker også etter behandling med TGFp-1, men en større mengde forblir i cytoplasma. Interessant er mengden av fosforylert Smad3 etter TGFp-1 behandling akkumulerer også i kjernen, uavhengig av dasatinibbehandlingen (Fig. 5B).
A549-celler ble behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Etter behandling, ble cellelysater oppsamlet og de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner ble separert som tidligere beskrevet [35]. Etter fraksjonering, ble lysatene utsatt for Western blotting med de angitte antistoffer.
Behandling med kombinasjons TGFB-dasatinib ikke har en betydelig effekt på ikke-kanoniske TGFB pathway intracellulære meklere ERK, AKT, eller p38 (S3 figur). Det kan dessuten behandling med TGFp-1 ikke resultere i en økning i SHC aktivering i A549-celler, som tidligere er rapportert for andre celletyper [42], [43] og knockdown av ekspresjonen av ShcA ved hjelp ShcA siRNA ikke har en virkning på apoptose i ShcA-negative A549-celler (data ikke vist), noe som tyder på at denne veien ikke er involvert i apoptose observeres med TGFp-dasatinibbehandlingen.
TGFp-1-dasatinib apoptose medieres av Smad3- indusert BIM
Smad3 har blitt rapportert å bevisst cellene til de apoptotiske effektene av TGFB [40], og en av de foreslåtte mekanismene er induksjon av uttrykket av den pro-apoptotiske proteiner BIM (Bcl-2- samspill formidler av celledød) [44]. Som vist på fig. 6A, ved 24 timer etter kombinasjonsbehandling, vi har observert en økning i BIM-protein ekspresjon av høy molekylvekt og isoform av lavere molekyl og mer cytotoksisk BIM. Det har nylig blitt rapportert at en BIM-delesjons polymorfismer (som resulterer i en BIM-isoform uten BH3 domene) er involvert i resistens mot tyrosinkinaseinhibitorer i flere krefttyper [45], [46]. Screening av alle 15 cellelinjer ved bruk av primere som er beskrevet i litteraturen [45] var vi ikke i stand til å detektere BIM-isoformen i en hvilken som helst av de cellelinjer (S5 figur). Imidlertid knockdown av ekspresjonen av Smad3 ved hjelp Smad3 siRNA resulterte i en reduksjon i mengden av BIM etter kombinasjonsbehandling, noe som indikerer at Smad3 ekspresjon er nødvendig for øket ekspresjon av BIM (fig. 6B). Det er blitt rapportert at ekspresjon av Smad7 forhindrer apoptose ved å inhibere ekspresjonen av BIM [47]. Som det kan ses i fig. 6A med TGFB-dasatinib behandling som resulterte i PARP cleavage, observerte vi redusert uttrykk for Smad7. Denne reduksjonen i Smad7 foreslår en mekanisme for å holde TGFp pathway aktiv. Våre data antyder at kombinasjonen behandlingen av TGFp og dasatinib induserer apoptose ved å øke TGFp aktivering av BIM og nedregulering av TGFp spredningsveier hemmende signaler, for eksempel Smad7.
(A), A549-celler ble behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombinasjon av 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Etter behandling ble helcellelysater oppsamlet og underkastet Western blotting med de angitte antistoffer. (B) siRNA mot Smad3, og negativ kontroll ble transfektert inn i A549 celler. Etter 4 timers inkubering ble cellene vasket og medier som inneholder forbindelser ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon for proteinekstraksjon fremstilling og Western blotting-analyse.
