Abstract
Bakgrunn
kinesin familiemedlem 4A (KIF4A), en microtubule basert motor protein, ble innblandet i regulering av kromosomstruktur og kinetochore mikrotubulidynamikk. Tatt i betraktning de funksjonene KIF4A, antok vi at KIF4A er involvert i utviklingen av muntlige plateepitelkarsinom (OSCCs) via aktivering av spindelenheten sjekkpunkt (SAC). Men lite er kjent om relevansen av KIF4A i oppførselen til OSCC. Vi undersøkte KIF4A uttrykket status og dets funksjonelle mekanismer i OSCC.
Metoder
KIF4A uttrykk nivåer i sju OSCC-avledet celler ble analysert ved kvantitativ revers transkriptase-polymerase chain reaction og immunoblotting analyser. Ved hjelp av en KIF4A knockdown modell, vurdert vi uttrykk for (SAC) -relaterte molekyler (BUB1, MAD2, CDC20, og cyclin B1), cellesyklus, og cellulær proliferasjon. I tillegg til
i
vitro
data, kliniske sammenhengen mellom KIF4A uttrykk nivåer i grunnskolen OSCCs (n = 106 pasienter) og clinicopathologic status ved immunhistokjemi (IHC) også ble evaluert.
Resultater
KIF4A mRNA og protein ble oppregulert signifikant (
P
0,05) i sju OSCC-avledet celler sammenlignet med humane normale orale keratinocytter. I de KIF4A knockdown-celler, ble det observert SAC-aktivering via økt BUB1 ekspresjon på kinetochores, hensiktsmessig kinetochore lokalisering av MAD2, nedregulering av CDC20, oppregulering av cyclin B1, og cellesyklus arrestert i G2 /M-fasen. Resultatene viste at cellulær proliferasjon av KIF4A knockdown cellene betydelig redusert (
P
0,05) sammenlignet med kontrollceller. IHC viste at KIF4A uttrykk i primær OSCCs var signifikant (
P
0,05) større enn i de vanlige muntlige kolleger og at KIF4A-positive OSCCs ble korrelert tett (
P
0,05) med tumorstørrelse.
Konklusjoner
Våre resultater er foreslått for første gang at KIF4A kontrollerer celleproliferasjon via SAC aktivering. Derfor KIF4A kan være en viktig regulator for tumorprogresjon hos OSCCs
Citation. Minakawa Y, Kasamatsu A, Koike H, Higo M, Nakashima D, Kouzu Y, et al. (2013) kinesin familiemedlem 4A: En Potensial Predictor for Progresjon of Human Oral Cancer. PLoS ONE 8 (12): e85951. doi: 10,1371 /journal.pone.0085951
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 6 juni 2013, Godkjent: 10 desember 2013; Publisert: 30.12.2013
Copyright: © 2013 Minakawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kinesin super proteiner (KIFS), klassifisert i. 14 underfamilier, er ATP-avhengige motor proteiner med microtubule avhengig plus-end bevegelse evne [1,2]. Under mitose, er aktivitetene til KIFS på spindelen microtubule kontrollert nettopp for å sikre at mitotiske hendelser blir orkestrert i riktig rekkefølge gjennom mitose [3,4]. Disse proteinene i de inter mikrotubuli kontrollere en balanse av ytre krefter og innover styrker for å sikre kromosom fangst og vedlegg til spindler og hindre spindelforlengelse før anaphase [5,6]. Blant de KIFS styrer KIF4A spindel organisasjon, kromosom justering og kinetochore mikrotubulidynamikk med et protein regulator av cytokinese en [4,7-13]. Feilregulering av KIF4A induserer unormal spindel separasjon og forårsaker Aneuploidy av datterceller [14,15]. Celler som påvirkes av aneploidy er preget av gevinst eller tap av genetisk materiale. De er sterkt mistenkt for å være assosiert med kreft progresjon [16]. Derfor hypotese vi at KIF4A kan være assosiert med kreft progresjon.
spindelenheten sjekkpunkt (SAC) overvåker interaksjoner mellom kinetochores og spindel mikrotubuli i mitosen og kontrollerer meta-anaphase overgang før alle kromosomene etablere biorientation. Derfor har SAC en viktig rolle i cellulær proliferasjon via en cellesykluskontrollmekanisme, noe som er spesielt viktig for nøyaktigheten av kromosom segregering [17-19]. Riktig funksjon av SAC krever felles handling av flere sjekkpunkt proteiner, dvs. BubR1, Bub1, Bub3, Mad1, og Mad2 [19-22]. Den aktive sjekkpunkt hemmer anaphase fremme kompleks /cyclosome (APC /C) ble arrestert på anaphase [23-26]. Inhibering av APC /C hindrer degradering av flere viktige mitotiske proteiner, som må nedbrytes for anaphase å starte [23-28]. Tilstedeværelsen av ufestede kromosomer eller en mangel på spindel spenning som normalt genereres av bipolare kromosomet feste resulterer i fortsatt sjekkpunkt aktivering, mitotisk stopp, og til slutt programmert celledød [17-19,23-25]. I tillegg har SAC blitt rapportert å være defekt i en rekke humane kreftformer, inkludert oral, kolorektal, skjoldbruskkjertelen, og eggstokk-kreft, og det er forbundet med progresjon av kreft [29-32].
Fordi forholdet mellom SAC og KIF4A er bare begynnelsen for å bli forstått, antok vi at feilregulering av KIF4A er involvert i utviklingen av muntlige plateepitel karsinom (OSCCs) via aktivering av SAC [4,5,17 , 33,34]. Vi rapporterer her at avvikende uttrykk for KIF4A i OSCCs var funksjonelt og klinisk knyttet til tumorvekst, og at KIF4A kan være en molekylær markør for progresjon av OSCCs.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
den etiske komiteen for Graduate School of Medicine, godkjent Chiba Universitetet studieprotokollen (godkjenningsnummer, 236). Studien ble utført i henhold til de etiske standardene i Helsinkideklarasjonen. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.
OSCC-avledet cellulære linjer og prøver vev
udødeliggjort menneskelige OSCC-avledede cellelinjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22 , Sa3, HO-1-u-en, og KON) ble hentet fra human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) eller Riken BRC (Ibaraki, Japan) gjennom National Bio-Resource prosjekt Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) (Tokyo, Japan). Kort tandem gjentar pro fi les bekreftes mobil identitet. Alle OSCC-avledede celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium /F-12 HAM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheter /ml penicillin og streptomycin (Sigma). Primære dyrkede humane normale orale keratinocytter (HNOKs) ble anvendt som en normal kontroll [35-40]. De var friske munnslimhinnen epitel prøver innsamlet fra unge pasienter ved Chiba universitetssykehus. Tre uavhengige HNOKs var primært dyrket og vedlikeholdes i Oral keratinocyte Medium (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, California) består av 5 ml mikstur keratinocyte vekst supplement (ScienCell Research Laboratories) og 5 ml penicillin /streptomycin løsning (ScienCell Research Laboratories).
Ett hundre seks primær OSCC prøver og pasient-matchet normal epitel ble oppnådd under operasjoner utført ved Chiba universitetssykehus. De resected vev ble fiksert i 20% bufret formaldehyd løsning for patologisk diagnose og immunhistokjemi (IHC). Histopatologiske diagnose av hver OSCC prøvene ble utført i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier ved Avdeling for patologi av Chiba universitetssykehus [41]. Clinicopathologic iscenesettelse ble bestemt av TNM-klassifikasjon av International Union mot kreft [42]. Alle pasientene hadde OSCC som ble histologisk bekreftet, og tumorprøver ble sjekket for å sikre at tumorvevet var til stede i mer enn 80% av prøvene.
Utarbeidelse av cDNA og protein
Total RNA ble isolert bruker Trizol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert ved hjelp av 5 mikrogram total RNA fra OSCC-avledede cellelinjer ved hjelp av Ready-To-Go You-Prime Første Strand Perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) og kort sentrifugert. Cellepelletene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter i en lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vekt /volum CHAPS og 10 mM Tris pH 7,4) med en protease inhibitor cocktail (Roche, Diagnostics). Proteinkonsentrasjonen ble målt med BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).
mRNA uttrykk analyse
Sanntids kvantitativ revers transkriptase-polymerase chain reaction (QRT-PCR) ble utført bruker LightCycler 480 apparat (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Primere og universelle prober ble utformet ved hjelp av Universal Probe Library (Roche Diagnostics) som spesi fi es den mest egnede sett. Primersekvensene brukes for QRT-PCR var:
KIF4A
, fremover,
5′-TCTGTTTCAGGCTGCTTTCA -3 «
; revers,
5′-GCCCTG AAATATTTGATTGGAG -3 «
; og universell sonde 25, og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), forover,
5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3 «
; omvendt, etter
5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 «; og universell sonde 60. Utskriften beløp for
KIF4A
ble beregnet fra de respektive standardkurver og normalisert til
GAPDH
avskrift beløp fastsatt i tilsvarende prøver. Alle prøver ble analysert i triplikat og tre uavhengige preparater av RNA ble analysert fra hver cellelinje.
Immunoblotting analyse
Proteinekstrakter (20 pg) ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese i fire -12% gel, overført til nitrocellulosemembraner, og blokkert i en time ved romtemperatur i Blocking One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan). Membranene ble inkubert med kanin-anti-KIF4A polyklonalt antistoff (Gene Tex, San Antonio, TX), muse-anti-GAPDH monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), muse-anti-CDC20 monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), og kanin anti-cyklin B1 polyklonalt antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann, inkubert med sekundært antistoff og koblet til pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus IgG (Promega, Madison, WI) i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble membranene påvist ved anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo), og immunoblotting ble visualisert ved å utsette membranene til Atto Lys-Capture II (Atto, Tokyo, Japan). Signal intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av CS Analyzer versjon 3.0 software (ATTO).
Transfeksjon med shRNA plasmid
OSCC cellelinjer (HSC-3 og Ca9-22) ble transfektert med KIF4A shRNA (shKIF4A ) eller kontroll shRNA (shMock) vektorer (Santa Cruz Biotechnology) ved hjelp Lipofectamine LTX og Plus reagenser (Invitrogen). Etter transfeksjonen ble stabile transfektanter ble isolert ved dyrkningsmedium inneholdende 2 ng /ml puromycin (Invitrogen). To til tre uker etter transfeksjon ble levedyktige kolonier overført til nye retter. shKIF4A og shMock celler ble brukt for videre eksperimenter.
Immunofluorescence
transfektanter ble sådd ut på kammers objektglass (Falcon BD, Franklin Lakes, NJ) ved 50% konfluens, vaskes med iskald PBS , og fiksert med 4% paraformaldehyd-PBS i 20 minutter, deretter permeabiliserte i PBS inneholdende 0,2% Triton X-100 som tidligere beskrevet [43]. Vi brukte følgende primære antistoffer for påvisning av SAC aktivering: kanin anti-KIF4A polyklonale antistoff (Gene Tex), mus anti-BUB1 monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), og mus anti-MAD2 antistoff (Santa Cruz Biotechnology). Fikserte celler ble inkubert med en blokkerende oppløsning inneholdende 0,5% bovint serumalbumin i 1 time ved romtemperatur og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Etter skylling med PBS, ble cellene inkubert med sekundære antistoffer i 1 time ved 37 ° C. De sekundære antistoff var fluorescein isotiocyanat-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og Texas Red-konjugert-anti-muse-IgG-antistoff (Vector Laboratories) inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørket. Til slutt ble de seksjoner vasket tre ganger med PBS og montert ved hjelp av monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories). Den immunfluorescens ble utført av konfokalmikroskopi og analysert med Fluoview programvare (Olympus Optical, Tokyo, Japan).
Cell-syklus analyse
Hvis du vil synkron celler ved G0 /G1 eller G2 /M overgangen ble cellene ute av serum i 48 timer og behandlet med 200 ng /ml nocodazol (Sigma) i 20 timer [44,45]. For å bestemme celle-syklusfordeling, ble cellene høstet, vasket med PBS, og probet med CycleTEST Plus DNA-reagenssettet (Becton-Dickinson, San Jose, CA) ifølge produsentens protokoll. Strømningscytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert ved BD AccuriTM C6 Flowcytometer (Becton-Dickinson). De fraksjoner av cellene i G0-G1, ble S og G2-M faser analysert ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon).
Cellular vekst
transfektanter ble sådd i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler per brønn. Celler ble innhøstet i 168 timer, og tellet hver 24. time. Ved de angitte tidspunkter ble cellene trypsinert og telt ved bruk av et hemocytometer i triplikate prøver.
IHC
IHC ble utført på fire-um deler av parafininnstøpte prøver i overensstemmelse med kanin-anti-KIF4A polyklonale antistoff (Gene Tex). I korthet, etter deparaffinization og hydrering ble endogen peroksydase-aktivitet ble stoppet ved 30 minutters inkubering i en blanding av 0,3% hydrogenperoksidløsning i 100% metanol; delene ble blokkert i 2 timer ved romtemperatur med 1,5% blokkerende serum (Santa Cruz Biotechnology) i PBS før reaksjon med anti-KIF4A antistoff ved 4 ° C i et fuktig kammer over natten. Etter inkubasjon med det primære antistoff, ble prøvene vasket tre ganger i PBS og ble behandlet med seg reagens (DAKO, Carpinteria, CA), etterfulgt av fargefremkalling i 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAKO). Lysbildene så ble litt kontra med hematoxylin, dehydrert med etanol, renset med xylen, og montert. Ikke-spesifikk binding av et antistoff til andre enn antigenet enkelte ganger proteiner. Som en negativ kontroll ble triplikate seksjoner immunostained uten eksponering for primære antistoffer, som bekreftet spesifisiteten farging (figur S1A). For å kvantifisere status KIF4A protein uttrykk i disse komponentene, brukte vi IHC scoring systemer som er beskrevet tidligere [39,40,46-49]. I sammendraget, ble gjennomsnitts prosenter av positive tumorceller bestemt i minst tre tilfeldige felt på 400 × forstørrelse i hver seksjon. Intensiteten av KIF4A-immunologiske reaksjon ble scoret som følger: 0+, none; 1+, svak; 2+, moderat; og 3+, intense. Den cellulære nummer og den fargeintensitet ble multiplisert for å fremstille en KIF4A IHC poengsum. Vi vurderte det fargeintensitet av skjelettmuskelceller, som var positive kontroller for KIF4A (figur S1B). Saker med en KIF4A IHC poengsum overstiger 95,0 (3 standardavvik [SD] score for normalt vev) ble definert som KIF4A-positive. De ± 3-SD cutoff, som statistisk bare 0,2% av målingen ville forventes å falle utenfor dette området, ble brukt fordi det var ikke til å bli påvirket av tilfeldige eksperimentelle feil som produseres av prøven manipulering [50]. To uavhengige patologer fra Chiba universitetssykehus, ingen av dem hadde noen kjennskap til pasientens kliniske status, gjorde disse dommene.
Statistisk analyse
I sammenligninger av KIF4A uttrykk nivåer, ble statistisk signifikans evaluert med Mann-Whitneys U-test. Relasjoner mellom KIF4A-immunhistokjemisk fargings score og clinicopathological profiler ble evaluert av χ
2 test, Fishers eksakte test, og Mann-Whitneys U-test.
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Resultater
Evaluering av KIF4A uttrykk i OSCC-avledet cellulære linjer
For å undersøke mRNA uttrykk for
KIF4A
, utførte vi QRT-PCR analyse ved hjelp av syv OSCC-avledet cellulære linjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22, SA3, Ho-1-u-en, og KON) og HNOKs.
KIF4A
mRNA var oppregulert betydelig i alle OSCC-avledet cellulære linjer sammenlignet med HNOKs (Figur 1a). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av triplikate resultater (
P
0,05). Vi utførte også immunblotanalyse for å undersøke KIF4A protein uttrykk status i OSCC-avledet cellulære linjer og HNOKs (Figur 1b). En betydelig økning i KIF4A protein-ekspresjon ble observert i alle OSCC cellulære linjer i forhold til de HNOKs. Expression analyse indikerte at både transkripsjon og oversettelse produkter av dette molekylet ble sterkt uttrykt i OSCC-avledet cellulære linjer.
(A) Kvantifisering av KIF4A mRNA uttrykk i OSCC-avledet cellulære linjer ved QRT-PCR-analyse. Betydelig oppregulering av KIF4A mRNA er sett i syv OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med de HNOKs (
P
0,05, Mann-Whitney U-test). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av triplikat resultater. (B) Immunoblotting analyse av KIF4A protein i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs. KIF4A protein uttrykk er oppregulert i OSCC-avledet cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs. Densitometrisk KIF4A protein data er normalisert til GAPDH protein nivåer. Verdiene er uttrykt som en prosentandel av HNOKs (
P
0,05, Mann-Whitney U-test).
Etablering av KIF4A knockdown celler
Siden KIF4A uttrykk var oppregulert i OSCC cellulære linjer, vi etablert KIF4A knockdown celler ved hjelp shRNA teknologier. HSC-3 og Ca9-22-celler ble transfektert med KIF4A shRNA (shKIF4A) og kontroll shRNA (shMock) plasmider. Ekspresjonsnivåene av KIF4A mRNA og protein i de shKIF4A cellene var signifikant lavere enn de i shMock celler (HSC-3 og Ca9-22-avledede transfektanter) (figur 2A, B) (
P
0,05) .
(A) QRT-PCR viser at KIF4A mRNA uttrykk i shKIF4A celler (HSC-3-og Ca9-22-avledet transfektanter, 2 kloner hver) er betydelig lavere enn i de shMock celler (
P
0,05, Mann-Whitney U-test). (B) Immunoblotting analyse viser at KIF4A protein nivåer i shKIF4A-transfekterte celler (HSC-3- og Ca9-22-avledet transfektanter, 2 kloner hver) også har avtatt betydelig sammenlignet med i shMock celler (
P
. 0,05, Mann-Whitney U-test)
Aktivering av SAC
for å undersøke mekanismen som KIF4A er relatert til SAC, utførte vi immunfluorescens analyse for spindel-sjekkpunkt protein (BUB1) og sjekkpunkt sensor protein (MAD2). BUB1 ble funnet i kondensert kromosomer i shKIF4A celler, men ble ikke lokalisert på kinetochores i shMock celler (figur 3A). MAD2 ble lokalisert på kinetochores i shKIF4A celler, mens kinetochore lokalisering ikke ble sett i de shMock celler (figur 3B). Den direkte mål på SAC-aktivering er CDC20, som er aktivatoren i den anafase-fremmende kompleks /cyclosome (APC /C) [23-26]. Videre er cyklin B1 en viktig regulator av G2 /M progresjon og M-G1 overgang [27]. For å evaluere M faserest ved aktivering av SAC, vi også utført immunblotting av CDC20 og cyklin B1, og strømningscytometrisk analyse. Som forventet, mens CDC20 var signifikant nedregulert, cyclin B1 var oppregulert i shKIF4A celler (figur 4A). Videre er prosentandelen av G2 /M fase i shKIF4A celler var signifikant (P 0,05) høyere enn det i shMock celler (figur 4B). Resultatene indikerte at nedregulering av KIF4A kan indusere cellesyklus arrest eller forsinkelse i M fase via SAC aktivering.
Lokalisering av BUB1 og MAD2 til kinetochores sammenlignes i shKIF4A og shMock celler ved immunfluorescens. (A) BUB1 på kinetochores økt i shKIF4A celler sammenlignet med i shMock celler (grønn, KIF4A, rød, BUB1, blå, DNA). (B) Riktig lokalisering av MAD2 er sett i shKIF4A celler, mens kinetochore lokalisering ikke er sett i shMock cellene. (Grønn, KIF4A, rød, MAD2, blå, DNA)
For å undersøke SAC aktivering og cellesyklusutvikling, har vi fastslått uttrykket nivåer av CDC20 og cyklin B1, og DNA-innhold i G0-G1, S og G2-M-faser. (A) shKIF4A celler viste nedregulering av CDC20 og oppregulering av cyclin B1 (HSC-3- og Ca9-22-avledede transfektanter, 2 kloner hver) sammenlignet med shMock celler (
P
0,05 , Mann-Whitney U-test). (B) flowcytometrisk analyse ble utført for å undersøke cellesyklus i shKIF4A og shMock celler. Prosentandelen av G2 /M fase i shKIF4A celler (HSC-3- og Ca9-22-avledet transfektanter, 2 kloner hver) har økt markant sammenlignet med shMock celler (
P
0,05, Mann-Whitneys U-test).
Redusert cellevekst i KIF4A knockdown celler
for å evaluere effekten av KIF4A knockdown på cellevekst, utførte vi en celleproliferasjonstest. shKIF4A og shMock celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn som ble telt i 168 timer. Det var en signifikant (
P
0,05). Reduksjon i cellevekst av shKIF4A celler sammenlignet med shMock celler (figur 5)
For å bestemme effekten av shKIF4A på celleproliferasjon, shKIF4A og shMock celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn. Begge transfektanter ble regnet med sju sammenhengende dager. Celleveksten av shKIF4A-transfekterte celler (HSC-3- og Cas9-22-avledede transfektanter, 2 kloner hver) ble signifikant hemmet sammenlignet med shMock celler etter 7 dager (168 timer). Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom shKIF4A og shMock celler (
P
0,05, Mann-Whitney U-test)
Evaluering av KIF4A protein uttrykk i grunnskolen OSCC
.
Representative IHC resultater for KIF4A protein i normal oralt vev og primære OSCC er vist i figur 6A-C. Positiv farging ble sett hovedsakelig i kjernen av primær OSCC prøver (figur 6A, B). De KIF4A IHC score i primær OSCCs (62.3-188, median, 131) var betydelig høyere enn i normalt vev (26.5-103, median, 66,5) (figur 6C) (
P
0,05). Vi definerte tilfeller med IHC poengsum over 95 (3 SD score for normalt vev) som KIF4A-positive. Sammenhenger mellom clinicopathologic kjennetegn ved pasientene med OSCC og status for KIF4A protein uttrykk er vist i tabell 1. Blant de kliniske parametre, KIF4A uttrykk var knyttet betydelig (
P
0,05) til primær størrelse av OSCC svulster. Disse resultatene antydet at KIF4A kan være relatert tett til tumorprogresjon.
Representant IHC resultater for KIF4A protein i normal oral vev (A) og primær OSCC (B). A, B: Original forstørrelse, × 400. Skala barer, 10 mikrometer. Sterk KIF4A immunoreaktivitets ble oppdaget i primær OSCCs; normale orale vev viser nesten negativ farging. C: Delstaten KIF4A protein uttrykk i primær OSCCs (n = 106) og de vanlige kolleger. De KIF4A IHC Stillingen ble beregnet som følger: IHC poengsum = 0 x (antall ufargede celler i felten) + 1 x (antall svakt fargede celler i felten) + 2 x (antall moderat fargede celler i felten) + 3 x (antall intenst fargede celler i felten). De KIF4A IHC score for normale orale vev og OSCCs varierte 26,5 til 103 (median, 66,5) og 62,3 til 188 (median, 131), henholdsvis. KIF4A protein uttrykk nivåer i OSCCs er signifikant (
P
0,05, Mann-Whitneys U-test). Høyere enn hos normale muntlige vev
Resultater av farging
klinisk klassifisering
No. pasienter (%)
Total KIF4A- negative
KIF4A-positive
P
verdi
en
alder ved kirurgi (år) 603 914 (36) 25 (64) ≧ 60, 702 212 (55) 10 (45) 0,121
b
≧ 704 510 (22) 35 (78) Kjønn Male7529 (39) 46 (52) 0.122
c
Female31 7 (23) 24 (77) T-primærtumor T19 5 (56) 4 (44) 0,005
d
T25825 (43) 33 (57) T319 3 (16) 16 (84) T420 3 (15) 17 (85) T1 + T26730 (45) 37 (55) 0,010
c
T3 + T439 6 (15) 33 (85) N-regional lymfeknute N (-) 4515 (33) 30 (67) 0,920
c
N (+) 6121 (34) 40 (66) Stage I9 5 (56) 4 (44) 0,121
d
II3814 (37) 24 (63) III11 4 (36) 7 (64) IV4813 (27) 35 (73) Histopatologisk typen Well6123 ( 38) 38 (62) 0.352
d
Moderately3711 (30) 26 (70) Poorly8 2 (25) 6 (75) tumor nettstedet Gingiva32 9 (38) 23 (63) 0,861
d
Tongue6527 (42) 38 (58) Buckal mucosa6 0 (0) 6 (100) Oral floor3 0 (0) 3 (100) Tabell 1. Sammenheng mellom KIF4A uttrykk og klinisk klassifisering i OSCCs.
en
P
0,05 ble betraktet som signifikant,
b
χ
2 test,
c
Fishers eksakte test,
d
Mann-Whitneys U-test. CSV Last ned CSV
Diskusjoner
Siden KIF4A ble overexpressed ofte i OSCC-avledede cellelinjer, etablerte vi KIF4A knockdown celler for å se hvorvidt KIF4A har kritiske funksjoner i OSCCs. shKIF4A celler viste redusert cellevekst av SAC aktivering fører til cellesyklus arrest i M-fasen. I tillegg til
in vitro
data, fant vi også at KIF4A var oppregulert i kliniske OSCC prøvene sammenlignet med normalt vev og at KIF4A-positive OSCC saker ble knyttet tett til tumorstørrelse. Resultatene indikerte at KIF4A er knyttet til regulering av cellesyklus i M fase og spiller en viktig rolle i tumorprogresjon i OSCCs.
Mange studier har indikert at KIFS spiller avgjørende roller, inkludert tumor utvikling og progresjon, i kreft [12-14,31,32]. Blant dem, KIF2C, KIF18A, KIF20A, og KIF20B var oppregulert i flere maligniteter og knyttet til tumorprogresjon [51-56]. I kontrast KIF1A var nedregulert i nasofaryngeal karsinom og rapportert som en potensiell tumordemper [57]. KIF4A ble overexpressed i livmorhalsen og lunge kreft [58,59], mens KIF4A ble nedregulert i mage kreft [60]. I tillegg til den aktuelle data som KIF4A var signifikant oppregulert i OSCCs, Castillo et al. rapportert at overekspresjon av noen motoriske kinesins, inkludert KIF4A, som genererer ekstra ytre krefter under mitose, induserer overdreven spindel separasjon fører til ulik fordeling av genetisk materiale i anaphase og til slutt utvikling av datterceller påvirkes av Aneuploidy [61]. I kontrast, har flere studier rapportert at tap av KIF4A kan påvirke tumor spredning og kreftutvikling [34,62]. På grunn av motstridende resultater som disse, er flere studier er nødvendig for å bedre forstå de komplekse roller KIF4A spiller i kreftutvikling og progresjon.
De nye funnene i denne studien er sammenhengen mellom KIF4A knockdown og forstyrret mitose som følge av SAC aktivering. SAC aktivering veien er strengt kontrollert av spindel sjekkpunkt proteiner, slik som BUB1 og MAD2 [17-22]. Som svar på upassende feste av kromosomer til spindel mikrotubuli, som forårsaker unormal celledeling, er BUB1 konsentrert på kinetochores i mitotiske celler og hjelper lokalisere MAD2 på kinetochores [62-64]. Aktivert MAD2 lokalisert riktig på kinetochores kan hemme CDC20, som aktiverer ubiquitin ligase kjent som APC /C [65-67]. Dermed indikerer at dette bevis på at KIF4A knockdown kan føre SAC aktivisering gjennom APC /C inaktive [23-27].
Vi fant at høye nivåer av cyclin B1 og M fase arrestasjonen ble observert i KIF4A knockdown celler. I løpet av induksjon av G2 /M fase rest etter behandling av celler med mikrotubul-inhibitorer som aktiverer den SAC ved å interferere med mikrotubul-dynamikk og stabilitet, slik som nocodazol og paclitaxel, en markert økning i cyklin B1 proteinnivåer ble også sett for [65-69]. Derfor er nedregulering av KIF4A indusert cellesyklus-stans av OSCC celler ved tilsvarende funksjoner av de mikrotubul-inhibitorer
KIF4A protein uttrykk nivåer i primær OSCCs ble korrelert med tumorstørrelsen. Dette antyder sterkt at KIF4A kan spille en viktig rolle i progresjon OSCCs og utvikling. Til sammen kan stratifisering av pasienter med OSCC basert på KIF4A status gi en mer personlig tilnærming til menneskelig oral kreftbehandling.
Konklusjon
Den nåværende Resultatene viste for første gang at KIF4A er overuttrykt ofte i OSCC, noe som antyder forstyrrelser i funksjon av spindel sjekkpunkt proteiner som BUB1, MAD2, og CDC20. KIF4A ekspresjon ble korrelert med tumorstørrelse i KIF4A-positive tilfeller, noe som tyder på at SAC-aktivering spiller en viktig rolle i cellulær proliferasjon i OSCC. KIF4A uttrykk er sannsynlig å være en viktig regulator av tumorprogresjon i OSCCs.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
KIF4A immunoactivity i negative og positive kontroller. For å evaluere spesifisiteten av KIF4A antistoff, undersøkte vi fargeintensitet av negative og positive kontroller. Original forstørrelse, × 400. Skala barer, 10 mikrometer. (A) Som en negativ kontroll ble primær OSCC prøvene immunostained uten eksponering for primære antistoffer. Det var ingen fargede celler. (B) skjelettlidelser muskelvev er en positiv kontroll for KIF4A. Sterk KIF4A immunoreaktivitet ble spesifikt påvist i cellekjernen.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085951.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Ms Lynda C. Charters av Medical International for å redigere dette manuskriptet
