Abstract
Bakgrunn
Semaphorins (SEMAs) består av en stor familie av utskilte og membran forankret proteiner som er viktige i neuronal pathfinding og axon veiledning i utvalgte områder i utviklings nervesystemet . Fra dem, har SEMA7A blitt rapportert å ha en kjemotaktisk aktivitet i nevrogenesen og for å være en immunmodulator; Men lite er kjent om relevansen av SEMA7A i atferd av oral plateepitelkarsinom (OSCC).
Metoder
Vi har evaluert SEMA7A uttrykk i OSCC-avledede cellelinjer og primære OSCC prøver å bruke kvantitativ revers transkriptase-polymerase chain reaction, immunoblotting, og semikvantitativ immunhistokjemi (kvadrat-IHC). I tillegg ble SEMA7A knockdown celler (shSEMA7A celler) anvendes for funksjonelle forsøk, herunder cellulær proliferasjon, invasivitet og migrasjon analyser. Vi analyserte også den kliniske sammenheng mellom SEMA7A status- og kliniske adferd hos pasienter med OSCC
Resultatene
SEMA7A mRNA og protein ble oppregulert signifikant (P 0,05). I OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med humane normale orale keratinocytter. De shSEMA7A cellene viste redusert cellevekst av cellesyklus-stans i G1 fase, som følge av oppregulering av cyclin-avhengige kinaser (p21
Cip1 og p27
Kip1) og nedregulering av cykliner (cyklin D1 , cyklin E) og cyklin-avhengige kinaser (CDK2, CDK4 og CDK6); og redusert invasivitet og migreringsaktiviteter ved redusert utskillelse av matriks-metallproteaser (MMP) (MMP-2, proMMP-2, pro-MMP-9), og ekspresjon av membrantype MMP 1- (MT1-MMP). Vi har også funnet inaktivering av de ekstracellulære regulerte kinase 1/2 og AKT baner, en oppstrøms molekyl av cellesyklus-stans i G1 fase, og redusert sekresjon av MMP i shSEMA7A celler. kvadrat-IHC viste at SEMA7A uttrykk i de primære OSCCs var signifikant (P = 0,001) større enn i normale motstykker, og ble korrelert med primær tumorstørrelse (P = 0,0254) og regional lymfeknutemetastase (P = 0,0002).
Konklusjon
Våre data gir bevis for en vesentlig rolle SEMA7A i tumorvekst og metastasering i OSCC og indikerte at SEMA7A kan spille en potensiell diagnostisk /terapeutisk mål for bruk hos pasienter med OSCC.
Citation: Saito T, Kasamatsu A, Ogawara K, Miyamoto jeg, Saito K, Iyoda M, et al. (2015) Semaphorin7A Fremme av tumorvekst og metastase i Human Oral Cancer ved forskrift G1 Cellesyklus og Matrix Metallproteaser: Mulig bidrag til tumor angiogenese. PLoS ONE 10 (9): e0137923. doi: 10,1371 /journal.pone.0137923
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN
mottatt: 1 juni 2015; Godkjent: 23 august 2015; Publisert: 17.09.2015
Copyright: © 2015 Saito et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Semaphorins (SEMAs), utskilt og membranassosierte proteiner, gi miljømessige signaler for å formidle ulike utviklingsprosesser inkludert nevronal cellemigrasjon, axon veiledning, vaskulogenese, forgrening morphogenesis, og hjerte organogeneseperioden [1]. SEMA avvik har vært innblandet i patogenesen av nevrologiske lidelser, som for eksempel Alzheimers sykdom og motoriske nevroner degenerasjon. SEMAs også uttrykkes i immunresponssystem, inkludert B-celler, T-celler, naturlige dreperceller og makrofager, og har vært implisert i regulering av organogenese, angiogenese, apoptose, og neoplasi [2].
SEMA1 -8 er karakterisert ved nærværet av et konservert stor SEMA domene (rundt 500 aminosyrer) ved den N-terminale domene, og differensiert ved sin C-terminale ende [3]. SEMA1 og SEMA2 finnes i virvelløse dyr, er SEMA3-7 funnet i virveldyr, og SEMA8 er funnet i virus [4]. SEMA4-7 eksistere hovedsakelig som membranbundne former, mens SEMA3 utskilles som et oppløselig molekyl. Diffusible SEMAs kan lokke fram autokrint /parakrint signalering, mens membranbundne familiemedlemmer kan megle kort rekkevidde juxtacrine signaler.
Selv om kreftceller vanligvis uttrykker unormale nivåer av SEMAs, er rollen til SEMA7A i kreft progresjon i stor grad ukjent. SEMA7A, en roman trans glycosylphosphatidylinisotol forankret protein, ble først identifisert i immunsystemet hos myeloid og lymfoidlinjen celler [5-7] og funksjoner gjennom betainte i flere systemer [8]. Vi presenterer resultatene fra en omfattende analyse av molekylære /mobil subtyper av SEMA7A i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) som er knyttet funksjonelt og bidrar klinisk til tumorprogresjon og prognose i OSCCs.
Materialer og metoder
Etisk uttalelse
den etiske komiteen av Graduate School of Medicine, Chiba University (godkjenningsnummer, 236) som er godkjent studieprotokollen, som ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.
OSCC-avledet cellelinjer og prøver vev
Menneske OSCC-avledede cellelinjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9- 22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u-en, og Ho-1-N-1) ble hentet fra human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) eller Riken Bioresource Senter (Ibaraki, Japan) gjennom National Bio-ressurs-prosjektet i departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Kort tandem gjenta profiler bekreftet mobil identitet. Primære dyrkede humane normale orale keratinocytter (HNOKs) ble oppnådd fra friske munnslimhinnen epitel prøver innsamlet fra unge pasienter ved Chiba universitetssykehus. Tre uavhengige HNOKs var primært dyrket og vedlikeholdes i oral keratinocyte medium (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) består av 5 ml mikstur keratinocyte vekst supplement (ScienCell Research Laboratories) og 5 ml penicillin /streptomycin løsning (ScienCell Research Laboratories) [9-12]. Alle OSCC-avledede celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma-Aldrich) og 50 enheter /ml penicillin og streptomycin (Sigma-Aldrich).
Ett hundre og femti primær OSCC prøver og pasient-matchet normal epitel ble oppnådd under operasjoner utført ved Chiba universitetssykehus. De resected vev ble fiksert i 20% bufret formaldehyd løsning for patologisk diagnose og immunhistokjemi (IHC) farging. Vi utførte histopatologisk diagnose av hver OSCC prøve i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier ved Institutt for patologi av Chiba universitetssykehus [13]. De clinicopathological etapper ble beregnet basert på TNM klassifisering av International Union mot kreft [14].
mRNA uttrykk analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert ved hjelp ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Life Science, Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Sanntids kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum ved hjelp av Thunder SYBR qPCR Mix (Toyobo) på LightCycler 480 apparatet (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), ifølge produsentens protokoll. De generelle amplifikasjonsbetingelser ble utført som beskrevet tidligere [15-18]. Primere ble utformet ved hjelp Primer 3Plus (on-line fri programvare, https://primer3plus.com/~~number=plural), som angir den mest hensiktsmessige sett. Primersekvensene brukes for QRT-PCR var:
SEMA7A
, fremover, 5′-TGTGTATTCCCTCGGTGACA-3 «; omvendt, 5»-GAGTGGAACAATGGCGTCTT-3 «; og
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase product: (
GAPDH
), fremover, 5′-AACATCATCCCTGCCTCTACTGG-3 «; omvendt, 5»-TTGAAGTCAGAGGAGACCACTG-3 «; og
MMP2
, fremover, 5′-CCCCAAAACGGACAAAGAG-3 «; omvendt, 5»-CTTCAGCACAAACAGGTTGC-3 «; og
MMP9
, fremover, 5′-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 «; omvendt, 5»-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 «; og
membrantype 1- MMP product: (
MT1-MMP
), fremover, 5′-GCCTTGGACTGTCAGGAATG-3 «; omvendt, 5»-AGGGGTCACTGGAATGCTC-3 «. Utskriften beløp for SEMA7A ble beregnet fra de respektive standardkurver og normalisert til
GAPDH
avskrift beløp fastsatt i tilsvarende prøver.
Immunoblotting analyse
Cellene ble vasket tre ganger med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) og forsiktig og kort sentrifugert. De cellulære Pelletene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter i en lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vekt /volum CHAPS og 10 mM Tris, pH 7,4) med en proteinase-inhibitor cocktail (Roche Diagnostics). Den totale proteinkonsentrasjon ble målt ved anvendelse av et fargestoff-bindende metode basert på Bradford assay med Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Proteinekstrakter ble underkastet elektroforese på 4-12% Bis-Tris-gel og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen) og blokkert i en time ved romtemperatur med Blokkering One (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan). Membranene ble vasket tre ganger med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann (TBS-T) og inkuberes med affinitets-renset anti-mus SEMA7A monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin anti- GAPDH polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-Cyclin D1 polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-cyclin E1 polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-p21
Cip1 polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology) , kanin anti-AKT polyklonale antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti- fosforylert-AKT (Pakt) polyklonale antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti- membran type-1 matriksmetalloproteinase (MT1-MMP) monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA), kanin-anti-ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2 (Cell Signaling Technology), kanin-anti-fosforylert ERK1-/2 (pErk1 /2) (Cell Signaling Technology), kanin anti- p27
Kip1 polyklonale antistoff (Cell Signaling Technology), kanin anti-cyclin-avhengig kinase (CDK) 2 monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology), kanin anti-CDK4 monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology), og kanin anti-CDK6 monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology) over natten ved 4 ° C. Membranen ble vasket med TBS-T og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus IgG som en sekundær antistoff (Promega, Madison, WI, USA), i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble membranene oppdaget ved hjelp av Super-Signal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), og immunoblotting ble visualisert ved å utsette membranene til ChemiDoc XRS Plus-system (Bio-Rad Laboratories). Signalintensitetene ble kvantifisert ved hjelp av bilde Lab system (Bio-Rad Laboratories). Densitometrisk SEMA7A protein data ble normalisert til GAPDH protein nivåer.
Transfeksjon med shRNA plasmid
OSCC-avledet celler (SAS og KOSC-2) ble transfektert med SEMA7A shRNA (shSEMA7A) eller kontroll shRNA ( shMock) vektorer (Santa Cruz Biotechnology) med Lipofectamine 3000 og Plus reagenser (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Etter transfeksjon ble cellene isolert ved dyrkningsmedium inneholdende 1 pg /ml puromycin (Invitrogen). Flere uker etter transfeksjon, en liten koloni var levedyktig. De cellekolonier ble plukket, overført til seks-brønners plater, og utvides gradvis til 10 cm skåler. For å vurdere effektiviteten av SEMA7A knockdown, utførte vi QRT-PCR og immunoblotting.
Cellular vekst
For å evaluere effekten av SEMA7A knockdown på celleproliferasjon, vi analyserte cellevekst i shSEMA7A og shMock celler . Disse cellene ble sådd ut i 6-cm skåler i en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler. På de angitte tidspunkter, ble cellene trypsinert og telt i tre eksemplarer ved hjelp av en hemocytometer.
Invasivitet analysen
For å evaluere effekten av SEMA7A knockdown på invasivitet, totalt 2,5 × 10
5 celler resuspendert i serumfritt medium ble sådd på Matrigel
®-belagt Transwell
® innsatser (8 mikrometer porer) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). I det nedre kammer, ble 2 ml DMEM med 10% FBS tilsatt som et kjemotiltrekkende. Etter at cellene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C, ble innsatsen vasket med PBS, og cellene på den øvre overflate av innsatsen ble fjernet med bomullspinner. Cellene fester seg til den nedre overflate av membranen ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Antallet celler som invaderte gjennom porene i fem tilfeldige områder ble tellet ved hjelp av et lysmikroskop ved 100 x forstørrelse.
Migration assay
Cellene ble sådd ut i seks-brønns plater med 10% FBS /DMEM til en konfluent monolag dannet. Ved hjelp av en mikropipette spissen, ble en såret laget i midten av hver plate. Vi inkuberes platene ved 37 ° C ved 5% karbondioksyd med fri-serum medium. Resultatene ble visualisert ved å måle sårområdet som var fri for celler ved hjelp av Lenaraf220b programvare (https://www.vector.co.jp/soft/dl/win95/art/se312811.html). Den midlere verdi ble beregnet fra data oppnådd fra seks brønner.
Cell-syklusanalyse
transmutants ble behandlet med 200 ng /ml nocodazol (Sigma-Aldrich) i 16 timer for å synkronisere celler ved G2 /M overgang [19-21]. Seksten timer etter behandling med nocodazol, ble cellene høstet, vasket med PBS, og probet med den CycleTEST Plus DNA-reagenssettet (Becton-Dickinson). Flowcytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av BD Accuri
TM C6 Flowcytometer (Becton Dickinson).
Zymografi
For å oppdage de utskilte MMP fra shSEMA7A og shMock celler, vi gjennomførte en gelatin zymografi assay (Primary Cell, Sapporo, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner. De kondisjonerte medier ble blandet med en SDS-prøvebuffer og separert på gelatingeler. Etter vasking, ble gelene inkubert i 32 timer ved 37 ° C i den enzymatiske reaksjonsbuffer. Gelene ble deretter farget med Coomassie brilliant blue og avfarget i et metanol /eddiksyreoppløsning med forsiktig risting på en risteplate. De MMP ble identifisert ved nærværet av klare bånd i en bakgrunn med ensartet farging.
Cycloheximide (CHX) behandling
CHX, et vanlig reagens for inhibering av proteinsyntese, er blitt rapportert til inaktive de MMP funksjoner. Siden flere studier har vist at den Ki av CHX varierer fra 1 til 50 pg /ml [22-27], anvendte vi CHX (WAKO, Osaka, Japan) ved en konsentrasjon på 1 ug /ml i 48 timer. Etter behandling ble utført immunblotanalyse og zymografi
Transient oppregulering i SEMA7A knockdown celler
fersk undersøkelse har blitt rapportert at TGF-β
1 (R . D Systems, Minneapolis , MN, USA) øker ekspresjonsnivået av SEMA7A gjennom en SMAD2 /3-uavhengig reaksjonsvei [28]. Siden den tid har vi behandlet shSEMA celler med TGF-β
1 ved en konsentrasjon på 1 ng /ml i 12 timer. Etter behandling ble mRNA uttrykk og immunoblotting utførte analyser.
semikvantitativ IHC
semikvantitativ IHC (kvadrat-IHC) av de fire-mikrometer deler av parafininnstøpte OSCC kliniske prøver ble utført. I korthet, etter paraffinization, hydrering, aktivering av antigen, hydrogenperoksyd quenching og blokkering, ble de kliniske seksjonene inkubert med mus-anti-SEMA7A monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ved 4 ° C i et fuktig kammer over natten. Etter inkubasjon med det primære antistoff, ble prøvene vasket tre ganger med PBS og behandlet med seg reagens (DAKO, Carpinteria, CA, USA) fulgt av fargeutvikling i 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAKO). Lysbildene deretter ble kontra lett med hematoxylin, dehydrert med etanol, renset med xylen, og montert. For å kvantifisere status for SEMA7A protein uttrykk i kliniske prøver, brukte vi kvadrat-IHC scoring systemer som er beskrevet tidligere [19, 29-33]. De gjennomsnittlige prosentandeler av positive tumorceller ble bestemt i minst tre tilfeldige felt i hver seksjon, og intensiteten av SEMA7A-immunoreaksjonsprodukt ble gitt poeng som følger: 0+, ingen; 1+, svak; 2+, moderat; og 3+, intense. Den fargeintensitet og de cellulære tallene ble multiplisert for å produsere en SEMA7A kvadrat-IHC poengsum. For å bestemme cutoff poeng av SEMA7A kvadrat-IHC score, analyserte vi kvadrat-IHC score av 150 pasienter som bruker mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver og Youden indeksen. Saker med en score enn 69,5 ble definert som SEMA7A-positive. To uavhengige patologer fra Chiba universitetssykehus, ingen av dem hadde kjennskap til pasientens kliniske status, gjorde disse dommene. For å beregne fem års overlevelse, undersøkte vi hver pasients liv og måned for død.
Statistisk analyse
Å sammenligne SEMA7A uttrykk nivåer, ble statistisk signifikans evaluert med Mann-Whitney U test . Relasjoner mellom SEMA7A kvadrat-IHC flekker score og clinicopathological profiler ble evaluert ved bruk av χ
2 test, Fishers eksakte test, t-test, og Mann-Whitney U-test. Den 5-års overlevelse ble evaluert ved bruk av log-rank test. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Resultater
Evaluering av SEMA7A uttrykk i OSCC cellelinjer utvunnet
For å undersøke ekspresjonsstatus av SEMA7A, utførte vi QRT-PCR og immunblotting-analyser ved hjelp av ni OSCC-avledede cellelinjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, SA3, Ca9-22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u -1, og Ho-1-N-1) og HNOKs.
SEMA7A
mRNA ble oppregulert signifikant (P 0,05) i alle OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med de HNOKs (figur 1A). Vi utførte også immunblotting-analyse for å undersøke SEMA7A proteinekspresjon i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs (figur 1B). En betydelig økning i SEMA7A protein uttrykk ble sett i alle OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med HNOKs.
(A) Kvantifisering av
SEMA7A
mRNA uttrykk i OSCC-avledede cellelinjer ved qRT- PCR-analyse. Signifikant (
✽P 0,05, t-test) oppregulering av
SEMA7A
mRNA er sett i syv OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med de HNOKs. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av triplikat resultater. (B) Immunoblotting analyse av SEMA7A protein i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs. SEMA7A proteinekspresjon er oppregulert i OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med den i HNOKs. Densitometriske SEMA7A protein data er normalisert til GAPDH-proteinnivåer. Verdiene er uttrykt som en prosentandel av HNOKs.
Etablering av SEMA7A knockdown celler
Siden hyppig oppregulering av SEMA7A ble observert i OSCC-avledet celler (figur 1), vi transfektert SEMA7A shRNA eller shMock i OSCC-avledet celler (SAS og KOSC-2). For å undersøke SEMA7A mRNA og protein uttrykk i shSEMA7A celler, QRT-PCR og immunoblottingforsøk analyser ble utført (figur 2A og 2B, henholdsvis).
SEMA7A
mRNA uttrykk i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) lavere enn i shMock celler (figur 2A). Den SEMA7A protein nivå i shSEMA7A celler også ble redusert sammenlignet med shMock celler (figur 2B).
(A) Uttrykk for
SEMA7A
mRNA i shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2 avledede transfektanter).
SEMA7A
mRNA uttrykk i shSEMA7A celler er signifikant (
✽P 0,05, t-test) lavere enn i de shMock celler. (B) Immunoblotting analyse viser at SEMA7A protein nivåer i shSEMA7A cellene også er betydelig redusert sammenlignet med de shMock cellene.
Funksjonelle analyser av SEMA7A knockdown celler
For å undersøke effekten av SEMA7A knockdown på celleproliferasjon, overvåket vi cellevekst i 168 timer. Cellevekst i shSEMA7A cellene sank signifikant (P 0,05) sammenlignet med de shMock celler (figur 3A). Vi utførte også cellulære invasivitet og migrasjonsanalyser for å vurdere de biologiske effektene av SEMA7A knockdown celler. I en invasivitet assay, antall penetrerende shSEMA7A celler signifikant (P 0,05) ble redusert sammenlignet med de shMock celler (figur 3B). I migrasjon analysen, når vi visuelt overvåket område av ensartede sår i konfluent cellekultur, sårene i shSEMA7A cellene stengt signifikant (P 0,05) senere enn de i shMock celler (figur 3C). Derfor shSEMA7A celler viste ikke bare redusert celledeling, men også redusert invasivitet og trekk evner.
(A) Cellular spredning analyse av shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-to-avledet transfektanter). For å bestemme effekten av shSEMA7A på celleproliferasjon, ble shMock og shSEMA7A celler sådd i 6-cm retter med en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn. Celleveksten av shSEMA7A celler inhiberes vesentlig sammenlignet med de shMock celler etter 4 dager (96 timer). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene (
✽P 0,05, t-test). (B) Invasivitet analyse av shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-avledede transfektanter). For å evaluere effekten av SEMA7A knockdown på invasivitet, vi sådd 2,5 × 10
5 celler i serumfritt medium av Matrigel
®-belagt Transwell
® innsatser (8 mikrometer porer) og tilsatt serum-supplert mediet i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer, cellene som penetrert gjennom porene ble fiksert, farget og tellet ved hjelp av et lysmikroskop ved 100 x forstørrelse. Antallet shSEMA7A celler trenger gjennom porene er redusert betraktelig (
✽P 0,05, t-test) sammenlignet med de shMock celler. Den midlere verdi ble beregnet fra data oppnådd fra tre separate kamre. (C) Migrering analyse av shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-avledede transfektanter). For å evaluere effekten av SEMA7A knockdown på migrasjon, ble ensartede sår laget i konfluerende kulturer av shSEMA7A og shMock celler, og omfanget av lukke ble overvåket visuelt hver 6. time i 12 timer. Den midlere verdi ble beregnet fra data oppnådd fra tre separate kamre. Såret området er redusert betraktelig (
✽P 0,05, t-test). I kulturen shMock celler etter 12 timer, mens en gap forble i shSEMA7A cellene
Celle- syklus analyse av shSEMA7A celler
Siden mobil veksten av SEMA7A knockdown cellene redusert (figur 3A), undersøkte vi de celle-syklus distribusjoner ved hjelp av flowcytometri. Prosentandelen av celler i G1 fase i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) høyere enn de shMock celler (figur 4A) .Vi også vurderes uttrykket nivåer av G1 arrest-relaterte proteiner, slik som CDKIs (p21
Cip1 og p27
Kip1), cykliner og CDK. Som forventet, CDKIs var oppregulert, og cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4 og CDK6 ble nedregulert signifikant (P 0,05) i shSEMA7A celler (figur 4B). Resultatene indikerte at shSEMA7A celler hemmes cellulær proliferasjon av cellesyklus arrest i G1 fasen.
(A) flowcytometrisk analyse ble utført for å undersøke cellesyklusprogresjon i shSEMA7A og shMock celler (SAS og KOSC- 2-avledet transfektanter) etter synkronisering på G2 /M fase til å bruke nocodazol. Prosentandelen av celler i G1 fase i shSEMA7A cellene økes markert sammenlignet med de shMock cellene. (B) Immunobloting analyse viser opp-regulering av p21
Cip1 og P27
Kip1 og nedregulering av cyclin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i shSEMA7Acells (SAS og KOSC-2-avledede transfektanter ) sammenlignet med de shMock cellene.
redusert utskillelse av MMP og expressin av MT1-MMP i SEMA7A knockdown celler
Siden invasivitet og trekk evner i SEMA7A knockdown celler redusert (fig 3B og 3C), vurdert vi MMP-mediert matrise proteolyse av QRT-PCR og en MMP zymografi analysen.
MMP2 Hotell og
MMP9
mRNA uttrykk i shSEMA7A celler var signifikant (p 0,05) lavere enn i de shMock celler (figur 5A). I shSEMA7A celler, utskillelsen av MMP2, proMMP-2, og proMMP-9 tydelig redusert sammenlignet med shMock celler. CHX behandlede shMock celler inhiberte sekresjonen av MMP-2, proMMP-2, og pro-MMP-9. Nivåene av MMP utskilt ble representert som den normaliserte sekresjon indeksen, som ble beregnet som prosentandelen av utskilt MMP i forhold til den av shMock celler (Figur 5B). Vi har også vurdert MT1-MMP ved QRT-PCR og immunoblotting analyser (Fig 6A og 6B, henholdsvis).
MT1-MMP
mRNA uttrykk i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) lavere enn i shMock celler (figur 6a). Den MT1-MMP protein nivå i shSEMA7A celler også ble redusert sammenlignet med shMock celler (figur 6B). CHX behandlet shMock celler også inihibited uttrykk for MT1-MMP uttrykk. Disse funnene sterkt antydet at SEMA7A var et viktig molekyl for MMP «sekresjon og uttrykk.
(A) Uttrykk for MMP-2 og MMP9 mRNA i shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-to-avledet transfektanter). MMP-2 og MMP9 mRNA uttrykk i shSEMA7A celler er signifikant (✽p 0,05, t-test) som er lavere enn i shMock celler. (B) sekreter av MMP-2, proMMP-2, og proMMP-9 i shMock og shSEMA7A celler ble analysert ved zymografi gelatin. I shSEMA7A celler, utskillelsen av MMP2, proMMP-2, og proMMP-9 er tydelig redusert sammenlignet med shMock celler. I tillegg CHX behandlede shMock celler inhiberte sekresjonen av MMP-2, proMMP-2, og pro-MMP-9. Densitometrisk MMP-2, proMMP-2, og proMMP-9 nivåene er normalisert til shMock nivåer.
(A) Uttrykk for
MT1-MMP
mRNA i shMock og shSEMA7A celler ( SAS og KOSC-2-avledede transfektanter).
MT1-MMP
mRNA uttrykk i shSEMA7A celler er signifikant (
✽P 0,05, t-test) lavere enn i shMock celler. (B) Immunoblotting analyse viser at MT1-MMP-proteinnivåer i shSEMA7A celler er også betydelig redusert sammenlignet med de shMock cellene. CHX behandlet shMock celler også inihibited uttrykk for MT1-MMP uttrykk. Densitometrisk MT1-MMP protein data er normalisert til GAPDH protein nivåer.
inaktivering av ERK1 /2 og AKT trasé i SEMA7A knockdown celler
Vi vurderte fosforyleringen nivåer av ERK1 /2 og AKT i shSEMA7A av immunblotanalyse. Nivåene av pErk1 /2 og protein pakt sank signifikant (p 0,05) i de shSEMA7A cellene sammenlignet med shMock celler (figur 7A og 7B). Disse resultatene antydet at ERK1 /2 og AKT signalveier ble svekkes ofte i de shSEMA7A cellene.
(A, B) Immunoblotting analyse viser at SEMA7A knockdown resulterer i reduserte nivåer av pErk1 /2 og pakt sammenlignet med shMock celler (SAS og KOSC-2-avledede-transfektanter). Densitometrisk pErk1 /2, ERK1 /2, Pakt, og AKT protein data er normalisert til GAPDH protein nivåer.
SEMA7A uttrykk i SEMA7A knockdown celler etter TGF-β
1 behandling
for å undersøke effekten av TGF-β
1 på SEMA7A uttrykk, behandlet vi transfektantene med TGF-β
1.
SEMA7A
mRNA i TGF-β
1 behandlede shSEMA7A celler var signifikant oppregulert i forhold til TGF-β
en ikke-behandlede shSEMA7A celler (figur 8).
De mRNA nivåer av
SEMA7A
i TGF-β
1 ruges shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2) er betydelig høyere (SAS, * P = 0,0022, ** P = 0,0021, † P = 0,0001, †† P = 0,0005, t-test) (KOSC-2, * P = 0,0003, ** P = 0,0003, † P = 0,0029, †† P = 0,0045, t-test) sammenlignet med det i TGF -β
1 unincubated shSEMA7A celler.
fosforylering nivåer av ERK1 /2 og AKT i SEMA7A knockdown celler med /uten TGF-β
1
Vi vurderte fosforylering nivåer av ERK1 /2 og AKT samt SEMA7A uttrykk i SEMA7A knockdown celler med /uten TGF-β
1 ved immunoblotanalyse. Den SEMA7A proteinnivå i TGF-β
1 behandlede shSEMA7A-celler ble øket sammenlignet med de ikke-behandlede shSEMA7A celler. I tillegg, TGF-β
1 behandlede shSEMA7A celler viste økt ekstra fordel og pakt nivåer sammenlignet med ikke-behandlede shSEMA7A celler (Fig 9).
Immunoblot-analyse av fosforyleringen nivåer av SEMA7A, ERK1 /2, og AKT. SEMA7A knockdown fører til redusert nivå av pErk1 /2 og Pakt sammenlignet med shMock celler (SAS og KOSC-to-avledet transfektanter). TGF-β
1 behandlede shSEMA7A cellene viser økt SEMA7A nivå sammenlignet med TGF-β
en ikke-behandlede shSEMA7A celler. Den pErk1 /2 og Pakt nivå viser også økt i TGF-β
1 behandlede shSEMA7A celler.
Evaluering av SEMA7A uttrykk i primær OSCCs
For å undersøke uttrykk statusen SEMA7A i primær OSCCs og forholdet til de clinicopathological egenskaper, analyserte vi SEMA7A protein uttrykk i grunnskolen OSCCs fra 150 pasienter ved hjelp av et kvadrat-IHC scoring system. Den SEMA7A protein ekspresjon av primære OSCCs var signifikant (P 0,05) høyere enn i normalt vev (figur 10A-10C). De SEMA7A kvadrat-IHC score i OSCCs og tilstøtende normale muntlige vev varierte 36,7 til 203,8 (median, 109,3) og 13,5 til 87,5 (median, 37.9), henholdsvis (figur 10C). For å bestemme en optimal cutoff point av de identifiserte kvadrat-IHC score, brukte vi ROC kurve analyse og Youden indeksen. ROC-kurven analyse areal under kurven (AUC) var 0,91 (95% konfidensintervall [CI], 0,8749 til 0,9378, P 0,05) og Youden indeks (sensitivitet, 70,5%, spesifisitet, 96,7%, P 0,05) viste at cutoff verdi var 69,5 (fig 10D og 10E). Sammenhenger mellom clinicopathological kjennetegn ved pasientene med OSCC og status for SEMA7A protein uttrykk er vist i tabell 1. Blant de kliniske klassifikasjoner ble SEMA7A-positive OSCCs korrelerte signifikant (P 0,05) med større svulster, hyppig regional lymfe metastaser, og avanserte kliniske stadier. De fem-års overlevelse i SEMA7A-positive OSCCs (n = 106) og SEMA7A-negative OSCCs (n = 44) var 76,3% og 85,3%, henholdsvis. Original forstørrelse, × 200.
